В статье описывается количественная оценка 1) размера и количества фокусных спаек и 2) индекса формы клеток и его распределения от конфокальных изображений слияние моноселей клеток MCF7.
Методы, представленные здесь количественно некоторые параметры слияния адептов клеток монослой из нескольких соответствующим образом окрашенных конфокальных изображений: прилипание к субстрату в качестве функции числа и размера фокусных спаек, и форма клеток, характеризующаяся индексом формы клетки и другими дескрипторами формы. Фокусные спайки были визуализированы при окрашивании паксилина, а клеточные границы были отмечены стыковым плакоглобином и актином. Методы клеточной культуры и окрашивания являются стандартными; изображения представляют собой единые фокусные плоскости; анализ изображений проводился с использованием общедоступного программного обеспечения для обработки изображений. Представленные протоколы используются для количественной оценки количества и размера фокусных спаек и различий в распределении формы клеток в монослоях, но они могут быть перепрофилированы для количественной оценки размера и формы любой другой клеточной структуры, которая может быть окрашена (например, митохондрии или ядра). Оценка этих параметров имеет важное значение в характеристике динамических сил в адептов клеточного слоя, в том числе клея клеток и актомиозин контрактистойности, которая влияет на форму клеток.
Эпителиальные клеточные монослой действуют как коллектив, в котором ячейка-клетка и клеточный субстратный спайка, а также контрактные силы и напряжения представляют важные параметры, и их надлежащий баланс способствует общей целостности блока1,2,3. Таким образом, оценка этих параметров представляет собой способ установить текущее состояние слоя ячейки.
Два описанных здесь метода представляют собой двумерный анализ слияние монослой адептов, эпителиальных клеток (в данном случае линия клеток рака молочной железы MCF7). Анализ проводится с использованием конфокополиальных изображений (одиночных ломтиков) из разных регионов на оси з; базальной области вблизи субстрата для фокусных измерений сцепления (FA) и апкической области для измерения формы клеток. Представленные методы являются относительно простыми и требуют стандартных лабораторных методов и программного обеспечения с открытым исходным кодом. Конфокальной микроскопии достаточно для этого протокола, поэтому она может быть выполнена без использования более специализированной микроскопии TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Таким образом, протокол может быть реализован в относительно стандартных лабораторных условиях. Хотя точность методов ограничена, они могут различать основные различия в фокусной спайке и форме клеток.
Оба описанных здесь метода состоят из стандартных экспериментальных процедур, таких как культивирование клеток, иммуносументирование, конфокальная визуализация и анализ изображений, выполняемый с помощью ImageJ. Тем не менее, любое программное обеспечение для обработки изображений с соответствующими функциями может быть использовано. Представленные методы могут отслеживать и сравнивать изменения, вызванные фармакологическим лечением или минимальной генетической модификацией. Получение определенных значений не рекомендуется, из-за ограниченной точности этих методов. Два автоматизированных макроса были включены, чтобы облегчить измерения многих изображений.
Клеточная и клеточно-субстратная адгеция являются неотъемлемыми атрибутами эпителиальных клеток и играют решающую роль в морфогенезе ткани и эмбриогенезе. В взрослых тканях правильное регулирование механических свойств клеточного слоя имеет решающее значение для поддержания гомео…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Польским национальным научным центром в рамках гранта No 2014/14/M/N’1/00437.
Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
BSA | BioShop | ALB001.500 | |
Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
PTX | Sigma | T7402-1MG | |
TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |