Summary

Cuantificación del área de adhesión de sustrato celular y distribuciones de formas celulares en monocapas de células MCF7

Published: June 24, 2020
doi:

Summary

El artículo describe la cuantificación de 1) el tamaño y el número de adherencias focales y 2) índice de forma celular y su distribución de imágenes confocales de las monocapas confluentes de las células MCF7.

Abstract

Los métodos presentados aquí cuantifican algunos parámetros de monocapas de células adherentes confluentes a partir de múltiples imágenes confocales debidamente manchadas: adhesión al sustrato en función del número y tamaño de adhesiones focales, y forma de celda, caracterizada por el índice de forma de celda y otros descriptores de forma. Las adherencias focales fueron visualizadas por la tinción de paxillin y los bordes de las células celulares se marcaron con plakoglobina de unión y actina. Los métodos para el cultivo celular y la tinción eran estándar; imágenes representan planos focales individuales; el análisis de imágenes se realizó utilizando software de procesamiento de imágenes disponible públicamente. Los protocolos presentados se utilizan para cuantificar el número y el tamaño de las adherencias focales y las diferencias en la distribución de la forma celular en las monocapas, pero se pueden reutilizar para la cuantificación del tamaño y la forma de cualquier otra estructura celular distinta que se pueda teñir (por ejemplo, mitocondrias o núcleos). La evaluación de estos parámetros es importante en la caracterización de las fuerzas dinámicas en la capa celular adherente, incluida la adhesión celular y la contractilidad de actomiosina que afecta a la forma celular.

Introduction

Las monocapas celulares epiteliales actúan como un colectivo en el que la adhesión de células celulares y sustratos celulares, así como fuerzas y tensiones contráctiles representan parámetros importantes y su equilibrio adecuado contribuye a la integridad general de la unidad1,,2,,3. Por lo tanto, la evaluación de estos parámetros representa una manera de establecer el estado actual de la capa de celda.

Los dos métodos descritos aquí representan un análisis bidimensional de las monocapas confluentes de las células epiteliales adherentes (en este caso la línea celular del cáncer de mama MCF7). El análisis se realiza utilizando imágenes confocales (cortes Z únicos) de diferentes regiones en el eje Z; región basal cerca de un sustrato para mediciones de adhesión focal (FA) y región apical para mediciones de forma celular. Los métodos presentados son relativamente simples y requieren técnicas de laboratorio estándar y software de código abierto. La microscopía confocal es suficiente para este protocolo, por lo que se puede realizar sin emplear una microscopía TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) más especializada. Por lo tanto, el protocolo podría aplicarse en un entorno de laboratorio relativamente estándar. Aunque la precisión de los métodos es limitada, pueden distinguir las diferencias básicas en la adhesión focal y la forma de la célula.

Ambos métodos descritos aquí consisten en los procedimientos experimentales estándar tales como el cultivo celular, inmunosuculción, imágenes confocales y análisis de imágenes realizados con ImageJ. Sin embargo, se puede utilizar cualquier software de procesamiento de imágenes con las funciones adecuadas. Los métodos presentados pueden rastrear y comparar los cambios infligidos por el tratamiento farmacológico o la modificación genética mínima. No se recomienda obtener valores definidos, debido a la precisión limitada de estos métodos. Se incluyeron dos macros automatizadas, para facilitar las mediciones de muchas imágenes.

Protocol

1. Pasos preparatorios Siembra celular para obtener monocapas confluentes Antes de la siembra, recubrir los pozos de un portaobjetos de 4 pozos con colágeno I (u otro componente ECM de elección). Para el recubrimiento de colágeno I, siga un protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a una concentración de 8 g/cm2. Semilla 400.000 células a un pozo de un portaobjetos de 4 pozos. Cultivo de l…

Representative Results

Análisis de adherencia focalAnteriormente se demostró que el derribo del gen HAX1 afectaba a las adherencias focales6. Las células se cultivaron en la superficie recubierta de colágeno I durante 48 h. Las imágenes de las células de control MCF7 y las células MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) de tres experimentos independientes manchados con paxillin de proteína de adhesión focal se obtuvieron utilizando un microscopio confocal (imagen de …

Discussion

La adhesión de células celulares y sustratos celulares constituyen atributos inherentes de las células epiteliales y desempeñan el papel crítico en la morfogénesis tisular y la embriogénesis. En los tejidos adultos, la regulación adecuada de las propiedades mecánicas de la capa celular es crucial para mantener la homeostasis y prevenir respuestas patológicas como la progresión tumoral y la metástasis. El tamaño y el número de adherencias focales dependen de la fuerza de la adhesión del sustrato celular, mi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia bajo la subvención No. 2014/14/M/NZ1/00437.

Materials

Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A32740 goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride Sigma A9434
BSA BioShop ALB001.500
Collagen from calf skin Sigma C9791-10MG
DAPI Sigma D9542 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate ThermoFisher Scientific 21885-025
FBS ThermoFisher Scientific 10270-136
Junction plakoglobin Cell Signaling 2309S rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2 Alpina standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL) ATCC ATCC HTB-22 epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope Olympus
Paxillin Abcam ab32084 rabbit, 1:250, Y113
PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Phalloidin-TRITC conjugate Sigma P1951 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX Sigma T7402-1MG
TBST – NaCl Sigma S9888
TBST – Trizma base Sigma T1503
Triton X-100 Sigma 9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope Zeiss

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Cite This Article
Wakula, M., Balcerak, A., Smietanka, U., Chmielarczyk, M., Konopiński, R., Grzybowska, E. A. Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (160), e61461, doi:10.3791/61461 (2020).

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