ويصف المقال كم من 1) حجم وعدد من الالتصاقات البؤري و 2) مؤشر شكل الخلية وتوزيعها من الصور confocal من monolayers التقاء من الخلايا MCF7.
الأساليب المعروضة هنا كمي بعض المعلمات من monolayers الخلية التقاء التصاق من الصور متعددة ملوّن بشكل مناسب confocal: التصاق إلى الركيزة كدالة لعدد وحجم التصاقات البؤري، وشكل الخلية، التي تتميز مؤشر شكل الخلية وغيرها من واصفات الشكل. تم تصور الالتصاقات البؤرية بواسطة تلطيخ paxillin وكانت الحدود الخلوية مميزة بتقاطع plakoglobin و actin. وكانت أساليب زراعة الخلايا وتلطيخها قياسية؛ تمثل الصور مستويات بؤرية واحدة؛ تم إجراء تحليل الصور باستخدام برامج معالجة الصور المتاحة للجمهور. وتستخدم البروتوكولات المعروضة لتحديد عدد وحجم الالتصاقات البؤرية والاختلافات في توزيع شكل الخلايا في الطبقات الأحادية، ولكن يمكن إعادة استخدامها لتحديد حجم وشكل أي بنية خلوية متميزة أخرى يمكن أن تكون ملطخة (على سبيل المثال، الميتوكوندريا أو نوكلي). تقييم هذه المعلمات مهم في توصيف القوى الديناميكية في طبقة الخلية المنضمة، بما في ذلك التصاق الخلية وانكماش أكتوميوسين الذي يؤثر على شكل الخلية.
monolays الخلية الظهارية بمثابة الجماعية التي خلية الخلية وخلوية الركيزة التصاق وكذلك القوى المتعاقدة والتوترات تمثل المعلمات الهامة وتوازنها السليم يساهم في سلامة الشاملة للوحدة1،2،3. وهكذا، فإن تقييم هذه المعلمات يمثل وسيلة لتحديد الوضع الحالي لطبقة الخلية.
الطريقتان الموصوفتان هنا تمثلان تحليلا ثنائي الأبعاد للطبقات الأحادية المتقاربة للخلايا الظهارية (في هذه الحالة MCF7 خط خلايا سرطان الثدي). ويتم إجراء التحليل باستخدام الصور confocal (واحد Z-شرائح) من مناطق مختلفة على المحور Z; منطقة القاعدية بالقرب من الركيزة لقياسات الالتصاق البؤري (FA) والمنطقة apical لقياسات شكل الخلية. الطرق المعروضة بسيطة نسبيا وتتطلب تقنيات مختبرية معيارية وبرامجية مفتوحة المصدر. المجهر Confocal كافية لهذا البروتوكول، لذلك يمكن أن يؤديها دون استخدام أكثر تخصصا TIRF (الانعكاس الداخلي الكلي الفلورية) المجهر. وهكذا، يمكن تنفيذ البروتوكول في إطار مختبري معياري نسبياً. على الرغم من أن دقة الطرق محدودة، إلا أنها يمكن أن تميز الاختلافات الأساسية في الالتصاق البؤري وشكل الخلية.
كلا الأسلوبين الموصوفين هنا تتكون من الإجراءات التجريبية القياسية مثل زراعة الخلايا، والمناعة، والتصوير confocal وتحليل الصور التي أجريت باستخدام ImageJ. ومع ذلك، يمكن استخدام أي برنامج معالجة الصور مع وظائف مناسبة. ويمكن للطرق المعروضة أن تتعقب وتقارن التغيرات التي يحدثها العلاج الدوائي أو الحد الأدنى من التعديل الوراثي. لا ينصح بالحصول على قيم محددة، نظراً لدقة محدودة لهذه الطرق. تم تضمين اثنين من وحدات الماكرو الآلي، لتسهيل قياسات العديد من الصور.
خلية الخلية وخلية الخلية الركيزة التصاق تشكل سمات متأصلة من الخلايا الظهارية وتلعب دورا حاسما في تكوين الأنسجة وتولد. في أنسجة البالغين التنظيم السليم للخصائص الميكانيكية لطبقة الخلية أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على التوازن والوقاية من الاستجابات المرضية مثل تطور الورم والنقائل. يعتمد ح…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل المركز الوطني البولندي للعلوم بموجب المنحة رقم 2014/14/M/NZ1/00437.
Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
BSA | BioShop | ALB001.500 | |
Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
PTX | Sigma | T7402-1MG | |
TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |