एमसीएफ7 सेल मोनोलेयर्स में सेल-सब्सट्रेट आसंजन क्षेत्र और सेल आकार वितरण का मात्राकरण
Summary
लेख 1 के मात्राकरण का वर्णन करता है) फोकल आसंजन और 2 की आकार और संख्या) सेल आकार सूचकांक और एमसीएफ 7 कोशिकाओं के कन्फ्यूल मोनोलेयर की कॉन्फोकल छवियों से इसका वितरण।
Abstract
यहां प्रस्तुत किए गए तरीके कई उचित रूप से दाग वाली कॉन्फोकल छवियों से कॉन्फ्ल्यूटी अनुयायी सेल मोनोलेयर के कुछ मापदंडों की मात्रा निर्धारित करते हैं: फोकल आसंजन की संख्या और आकार के एक समारोह के रूप में सब्सट्रेट से आसंजन, और सेल आकार, सेल आकार सूचकांक और अन्य आकार वर्णनकर्ताओं द्वारा विशेषता है। फोकल आसंजन को पैक्सिलिन स्टेनिंग द्वारा कल्पना की गई थी और सेल-सेल सीमाओं को जंक्शन प्लाकोग्लोबिन और ऐक्टिन द्वारा चिह्नित किया गया था। सेल संस्कृति और धुंधला करने के तरीके मानक थे; छवियां एकल फोकल विमानों का प्रतिनिधित्व करते हैं; छवि विश्लेषण सार्वजनिक रूप से उपलब्ध छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर किया गया था। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग फोकल आसंजन की संख्या और आकार और मोनोलेयर में सेल आकार वितरण में अंतर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, लेकिन उन्हें किसी अन्य अलग सेलुलर संरचना के आकार और आकार के परिमाणीकरण के लिए पुनर्निर्मित किया जा सकता है जिसे दाग दिया जा सकता है (उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया या नाभिक)। इन मापदंडों का आकलन पालन कोशिका परत में गतिशील बलों के लक्षण वर्णन में महत्वपूर्ण है, सेल आसंजन और actomyosin संकुचन कि सेल के आकार को प्रभावित करता है सहित ।
Introduction
एपिथेलियल सेल मोनोलेयर एक सामूहिक के रूप में कार्य करते हैं जिसमें सेल-सेल और सेल-सब्सट्रेट आसंजन के साथ – साथ अनुबंधीय बल और तनाव महत्वपूर्ण मापदंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं और उनका उचित संतुलन यूनिट 1,,2,3की समग्र अखंडता में योगदान देता है।2 इस प्रकार, इन मापदंडों का आकलन कोशिका परत की वर्तमान स्थिति स्थापित करने के तरीके का प्रतिनिधित्व करता है।
यहां वर्णित दो विधियां अनुयायी, एपिथेलियल कोशिकाओं (इस मामले में MCF7 स्तन कैंसर सेल लाइन) के कॉन्फ्लूरल मोनोलेयर के दो-आयामी विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करती हैं। विश्लेषण जेड-एक्सिस पर विभिन्न क्षेत्रों से कॉन्फोकल छवियों (एकल जेड-स्लाइस) का उपयोग करके किया जाता है; फोकल आसंजन (एफए) माप और सेल आकार मापन के लिए एपिकल क्षेत्र के लिए एक सब्सट्रेट के पास बेसल क्षेत्र। प्रस्तुत तरीके अपेक्षाकृत सरल हैं और मानक प्रयोगशाला तकनीकों और खुले स्रोत सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इस प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त है, इसलिए इसे अधिक विशेष टीआईआरएफ (टोटल इंटरनल रिफ्लेक्शन फ्लोरेसेंस) माइक्रोस्कोपी को नियोजित किए बिना किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल को अपेक्षाकृत मानक प्रयोगशाला सेटिंग में लागू किया जा सकता है। हालांकि तरीकों की सटीकता सीमित है, वे फोकल आसंजन और सेल आकार में बुनियादी मतभेदों को अलग कर सकते हैं।
यहां वर्णित दोनों तरीकों में चित्रजे का उपयोग करके किए गए सेल कल्टिंग, इम्यूनोस्टेपिंग, कॉन्फोकल इमेजिंग और इमेज एनालिसिस जैसी मानक प्रायोगिक प्रक्रियाएं शामिल हैं। हालांकि, उपयुक्त कार्यों के साथ किसी भी छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। प्रस्तुत तरीकों को ट्रैक और औषधीय उपचार या ंयूनतम आनुवंशिक संशोधन द्वारा दिए गए परिवर्तनों की तुलना कर सकते हैं । इन तरीकों की सीमित परिशुद्धता के कारण निश्चित मूल्यों को प्राप्त करने की सिफारिश नहीं की जाती है। कई छवियों के माप को सुविधाजनक बनाने के लिए दो स्वचालित मैक्रो शामिल किए गए थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल-सेल और सेल-सब्सट्रेट आसंजन एपिथेलियल कोशिकाओं के अंतर्निहित गुणों का गठन करते हैं और ऊतक मॉर्फोजेनेसिस और एम्ब्रिजेनेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वयस्क ऊतकों में कोशिका परत के यांत्रि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को पोलिश राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र द्वारा अनुदान संख्या 2014/14/M/NZ1/00437 के तहत समर्थन दिया गया था ।
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
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