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Biology

एमसीएफ7 सेल मोनोलेयर्स में सेल-सब्सट्रेट आसंजन क्षेत्र और सेल आकार वितरण का मात्राकरण

doi: 10.3791/61461 Published: June 24, 2020

Summary

लेख 1 के मात्राकरण का वर्णन करता है) फोकल आसंजन और 2 की आकार और संख्या) सेल आकार सूचकांक और एमसीएफ 7 कोशिकाओं के कन्फ्यूल मोनोलेयर की कॉन्फोकल छवियों से इसका वितरण।

Abstract

यहां प्रस्तुत किए गए तरीके कई उचित रूप से दाग वाली कॉन्फोकल छवियों से कॉन्फ्ल्यूटी अनुयायी सेल मोनोलेयर के कुछ मापदंडों की मात्रा निर्धारित करते हैं: फोकल आसंजन की संख्या और आकार के एक समारोह के रूप में सब्सट्रेट से आसंजन, और सेल आकार, सेल आकार सूचकांक और अन्य आकार वर्णनकर्ताओं द्वारा विशेषता है। फोकल आसंजन को पैक्सिलिन स्टेनिंग द्वारा कल्पना की गई थी और सेल-सेल सीमाओं को जंक्शन प्लाकोग्लोबिन और ऐक्टिन द्वारा चिह्नित किया गया था। सेल संस्कृति और धुंधला करने के तरीके मानक थे; छवियां एकल फोकल विमानों का प्रतिनिधित्व करते हैं; छवि विश्लेषण सार्वजनिक रूप से उपलब्ध छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर किया गया था। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग फोकल आसंजन की संख्या और आकार और मोनोलेयर में सेल आकार वितरण में अंतर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, लेकिन उन्हें किसी अन्य अलग सेलुलर संरचना के आकार और आकार के परिमाणीकरण के लिए पुनर्निर्मित किया जा सकता है जिसे दाग दिया जा सकता है (उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया या नाभिक)। इन मापदंडों का आकलन पालन कोशिका परत में गतिशील बलों के लक्षण वर्णन में महत्वपूर्ण है, सेल आसंजन और actomyosin संकुचन कि सेल के आकार को प्रभावित करता है सहित ।

Introduction

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एपिथेलियल सेल मोनोलेयर एक सामूहिक के रूप में कार्य करते हैं जिसमें सेल-सेल और सेल-सब्सट्रेट आसंजन के साथ - साथ अनुबंधीय बल और तनाव महत्वपूर्ण मापदंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं और उनका उचित संतुलन यूनिट 1,,2,3की समग्र अखंडता में योगदान देता है।2 इस प्रकार, इन मापदंडों का आकलन कोशिका परत की वर्तमान स्थिति स्थापित करने के तरीके का प्रतिनिधित्व करता है।

यहां वर्णित दो विधियां अनुयायी, एपिथेलियल कोशिकाओं (इस मामले में MCF7 स्तन कैंसर सेल लाइन) के कॉन्फ्लूरल मोनोलेयर के दो-आयामी विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करती हैं। विश्लेषण जेड-एक्सिस पर विभिन्न क्षेत्रों से कॉन्फोकल छवियों (एकल जेड-स्लाइस) का उपयोग करके किया जाता है; फोकल आसंजन (एफए) माप और सेल आकार मापन के लिए एपिकल क्षेत्र के लिए एक सब्सट्रेट के पास बेसल क्षेत्र। प्रस्तुत तरीके अपेक्षाकृत सरल हैं और मानक प्रयोगशाला तकनीकों और खुले स्रोत सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इस प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त है, इसलिए इसे अधिक विशेष टीआईआरएफ (टोटल इंटरनल रिफ्लेक्शन फ्लोरेसेंस) माइक्रोस्कोपी को नियोजित किए बिना किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल को अपेक्षाकृत मानक प्रयोगशाला सेटिंग में लागू किया जा सकता है। हालांकि तरीकों की सटीकता सीमित है, वे फोकल आसंजन और सेल आकार में बुनियादी मतभेदों को अलग कर सकते हैं।

यहां वर्णित दोनों तरीकों में चित्रजे का उपयोग करके किए गए सेल कल्टिंग, इम्यूनोस्टेपिंग, कॉन्फोकल इमेजिंग और इमेज एनालिसिस जैसी मानक प्रायोगिक प्रक्रियाएं शामिल हैं। हालांकि, उपयुक्त कार्यों के साथ किसी भी छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। प्रस्तुत तरीकों को ट्रैक और औषधीय उपचार या ंयूनतम आनुवंशिक संशोधन द्वारा दिए गए परिवर्तनों की तुलना कर सकते हैं । इन तरीकों की सीमित परिशुद्धता के कारण निश्चित मूल्यों को प्राप्त करने की सिफारिश नहीं की जाती है। कई छवियों के माप को सुविधाजनक बनाने के लिए दो स्वचालित मैक्रो शामिल किए गए थे।

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Protocol

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1. तैयारी कदम

  1. सेल सीडिंग को मिल्फ्लूंट मोनोलेयर प्राप्त करने के लिए
    1. सीडिंग से पहले, कोलेजन I (या पसंद के अन्य ईसीएम घटक) के साथ 4-कुओं के कक्ष स्लाइड के कुओं को कोट करें। कोलेजन के लिए मैं कोटिंग, एक वाणिज्यिक प्रोटोकॉल का पालन करें: 8 μg/सेमी2की एकाग्रता पर https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html ।
    2. बीज 400,000 कोशिकाओं को एक 4 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड के एक अच्छी तरह से।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5%सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में, धुंधला होने से पहले 24 घंटे (या उससे अधिक समय तक, प्रयोगात्मक अंत बिंदुओं के आधार पर) के लिए कोशिकाओं को संस्कृति दें। यह कदम सेल-सेल संपर्कों की परिपक्वता और मोनोलेयर के गठन की अनुमति देता है।
    4. एक ऑप्टिकल, उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए प्रदान की पुष्टि (के बारे में ९०% की आवश्यकता है) और मोनोलेयर की एक सामांय स्थिति । यदि कोशिकाएं तैर रही हैं या तनावग्रस्त दिखें तो आगे न बढ़ें।
  2. इम्यूनोफ्लोरिसेंट धुंधला
    नोट: कोशिकाओं को पसंद के प्रोटोकॉल के साथ दाग दिया जा सकता है। यहां, इम्यूनोफ्लोरेसेंस पहले के रूप में4वर्णित किया गया था ।
    1. फोकल आसंजन विश्लेषण के लिए, पसंद के फोकल आसंजन प्रोटीन (इस प्रोटोकॉल पैक्सिलिन में) के साथ कोशिकाओं को दाग दें। सेल आकार विश्लेषण के लिए पसंद के सेल-सेल जंक्शन प्रोटीन के साथ दाग (इस प्रोटोकॉल में डेस्मोसोमल प्रोटीन प्लाकोग्लोबिन)।
    2. प्रक्रिया के लिए, निर्दिष्ट समाधानों के 0.5 एमएल का उपयोग करें जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो।
    3. बर्फ पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 4% फॉर्मलडिहाइड में कोशिकाओं को ठीक करें।
    4. ऑटो फ्लोरेसेंस बुझाने के लिए 10 मिनट के लिए 0.1 मीटर अमोनियम क्लोराइड (पीबीएस में) के साथ इनक्यूबेट।
    5. 30 मिनट (पारमेबिलाइजेशन) के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स-100 (पीबीएस में) जोड़ें।
    6. 1 घंटे के लिए टीबीएस-टी में 5% दूध (या 1% बीएसए) के साथ ब्लॉक करें।
    7. रात 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट (एंटी-पैक्सिलिन: खरगोश, 1:250, एंटी-प्लाकोग्लोबिन: खरगोश, 1:400)
    8. 30 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट (एलेक्सा फ्लोर 594 बकरी विरोधी खरगोश, 1:500, 1:500)
    9. 1-5 मिनट के लिए 300 एनएम DAPI के साथ दाग, प्रकाश से संरक्षित।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट फॉलोइडिन कंजूगेट्स (conc. 1:400) के साथ ऐक्टिन का अतिरिक्त धुंधला प्रदर्शन किया जा सकता है; फल्लोइडिन को माध्यमिक एंटीबॉडी के समान चरण में जोड़ा जाना चाहिए।
  3. कॉन्फोकल इमेजिंग
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (जैसे, Zeiss LSM800) का उपयोग करके एकल जेड-स्लाइस की छवियां लें।
      नोट: वैकल्पिक ऐक्टिन धुंधला उचित फोकल विमान का आकलन करने में मदद कर सकता है । कॉर्टिकल ऐक्टिन धुंधला एपिकल क्षेत्र में मौजूद है, जबकि ऐक्टिन तनाव फाइबर बेसल क्षेत्र में मौजूद हैं, सब्सट्रेट के पास, जैसा कि चित्र 1पर सचित्र है।
    2. फोकल आसंजन इमेजिंग
      1. बेसल क्षेत्र से फोकल आसंजन विश्लेषण के लिए जेड-स्लाइस चुनें, सब्सट्रेट के करीब।
      2. उपलब्ध उच्चतम संख्यात्मक एपर्चर (बेहतर 63x एनए: 1.4) के साथ एक उद्देश्य का उपयोग करें।
        नोट: एफए का आकार बहुत विशिष्ट और आसानी से पहचानने योग्य है। इस प्रकार, कोशिकाओं के नीचे एक फोकल प्लेन से स्कैन शुरू करने और फिर धीरे-धीरे उनकी ओर स्कैन करने की सिफारिश की जाती है, जब तक कि एफए स्पष्ट रूप से दिखाई न दे। छवि विश्लेषण दृष्टि के छोटे क्षेत्रों से अधिक सटीक होगा, जो अधिक समान होते हैं, लेकिन इसका मतलब है कि कम कोशिकाओं की गणना देखने के एक क्षेत्र में की जाएगी।
    3. सेल-सेल संपर्क इमेजिंग
      1. 40x या 63x उद्देश्य का उपयोग करें।
      2. परमाणु धुंधला और पसंदीदा जंक्शन प्रोटीन धुंधला के लिए चैनलों का चयन करें।
      3. मोनोलेयर्स के एपिकल क्षेत्र से सेल आकार विश्लेषण के लिए जेड-स्लाइस चुनें।
      4. दृष्टि के कम से कम 3 अलग-अलग क्षेत्रों (200-400 कोशिकाओं) के लिए चित्र लें।

2. छवि विश्लेषण

नोट: बशर्ते मैक्रो इमेजजे संस्करण 1.50f या नए पर बेहतर काम करते हैं। केवल उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात वाली छवियों के परिमाणीकरण के लिए और अंडर-या ओवरसैचुरेटेड पिक्सेल के बिना उपयोग करें। वर्णित तरीकों में मैनुअल पैरामीटर समायोजन की आवश्यकता वाले चरण शामिल हैं। इस प्रकार, एक अंधा विश्लेषण/अंधा प्रयोग सेटअप की सिफारिश की जाती है । इमेज फाइल नामों को एन्क्रिप्ट करने के लिए, इमेजजे प्लगइन्स जैसे "ब्लाइंड एनालिसिस टूल" (उपलब्ध: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) का उपयोग किया जा सकता है।

  1. फोकल आसंजन विश्लेषण
    नोट: निम्नलिखित विधियों के लिए अनुशंसित इनपुट फाइलें हैं: FAs की छवियां .tiff प्रारूप में सहेजे गए 8-बिट ग्रेस्केल में प्रतिनिधित्व की गई हैं।
    1. इमेजजे का उपयोग करके खुली छवि।
    2. पिक्सल के लिए एक छवि के पैमाने सेट(विश्लेषण । सेट स्केल;; स्केल निकालें और वैश्विक विकल्प की जांच करें)।
    3. फाइल का नाम और माप विकल्पों में आरओआई के क्षेत्र को शामिलकरें (विश्लेषण करें । माप सेट करें...); क्षेत्र और डिस्प्ले लेबल विकल्पों की जांच करें।
    4. घटाना पृष्ठभूमि (प्रक्रिया । घटाना पृष्ठभूमि; 50 पिक्सल के लिए रोलिंग बॉल त्रिज्या पैरामीटर सेट; स्लाइडिंग पैराबोलॉयड विकल्प की जांच करें)। छद्म रंग आरजीबी छवियों के मामले में: आरजीबी चैनलों को विभाजित करें, चैनल को एफए के साथ खोला जाए, शेष चैनलों को बंद करें (छवि। रंग । स्प्लिट चैनल)
    5. ब्याज के सबसे छोटे क्षेत्र (आरओआई) के क्षेत्र का निर्धारण करें। फ्रीहैंड या बहुभुज चयन का उपयोग करना सबसे छोटा एकल फोकल आसंजन की रूपरेखा तैयार करता है और इसके क्षेत्रको मापता है (विश्लेषण । उपाय)। कुछ बेतरतीब ढंग से चुनी गई छवियों (कुल 20 आरओआई के लिए) से विभिन्न आरओआई (एफएस) के लिए इस चरण को दोहराएं। प्राप्त परिणामों के मतलब की गणना करें और सहेजें।
      नोट: इस कदम की आवश्यकता तभी होती है जब छवियों के किसी दिए गए सेट का पहली बार विश्लेषण किया जाता है (विशिष्ट सेल लाइन, विशिष्ट बाह्राश मैट्रिक्स घटकों के साथ कोटिंग स्लाइड, विभिन्न संस्कृति की स्थिति)।
    6. निम्नलिखित तरीकों में से एक का उपयोग करके छवि को बाइनरी में परिवर्तित करें:
      1. वैश्विक सीमा निर्धारित करें (छवि । समायोजित करें । दहलीज; डिफ़ॉल्ट, बी एंड डब्ल्यू और डार्क बैकग्राउंड विकल्पों की जांच करें, सीमा को मैन्युअल रूप से समायोजित करें या इसे स्वचालित रूप से सेट करें)।
      2. स्थानीय सीमा निर्धारित करें(छवि । समायोजित करें । ऑटो स्थानीय दहलीज...; Phansalkar के लिए विधि सेट और काले पृष्ठभूमि विकल्प पर सफेद वस्तुओं की जांच करें । इसके बाद, छवि को उलटाकरें (संपादित करें। उलटा)
    7. आरओआई की संख्या और क्षेत्र को मापें। विश्लेषण का चयन करें । कणों का विश्लेषणकरें ; पिक्सेल इकाइयों, प्रदर्शन परिणामों, स्पष्ट परिणामों और सारांश विकल्पोंकी जांच करें, आकार पैरामीटरसेट करें, क्योंकि कम सीमा चरण 2.1.5 से सबसे छोटी आरओआई के मतलब का उपयोग करती है। ऊपरी सीमा को एक विशिष्ट सेल क्षेत्र के 25% तक सेट किया जा सकता है।
    8. डेटा ट्रांसफर करें (जिसमें एफए की छवि का नाम, एफए की संख्या, एफए का कुल और मतलब क्षेत्र; क्रमशः स्लाइस, काउंट, टोटल एरिया, एवरेज साइज) सारांश विंडो से लेकर पसंद के डेटा मैनेजिंग प्रोग्राम तक शामिल हैं ।
    9. DAPI-दाग नाभिक की गिनती करके प्रति छवि कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें। गिनती मैन्युअल रूप से किया जा सकता है(प्लगइन्स । विश्लेषण करें । सेल काउंटर)या उपलब्ध प्रोटोकॉल के रूप में जैसे: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation।
    10. वैकल्पिक रूप से, एफएएस गिनती की सुविधा के लिए, संलग्न इमेजजे मैक्रो (FAs.ijm) का उपयोग करें।
      1. इमेजजे सोर्स फाइल्स फोल्डर में स्थित प्लगइन्स या मैक्रो फोल्डर के साथ मैक्रो के साथ .ijm फाइल को मूव करें।
      2. चरण 2.1.4 में वर्णित सबसे छोटे आरओआई के क्षेत्र का निर्धारण करें।
      3. ओपन मैक्रो फाइल(प्लगइन्स । मैक्रोन । संपादित करें...)
      4. मैक्रो चलाने से पहले तीन चर का मूल्य निर्धारित करें: चरण 2.1.4 के दौरान अर्जित संख्या के साथ area_of_the_smallest_region_of_interest का मूल्य भरें। मैनुअल या ऑटोके लिए threshold_type मूल्य निर्धारित करें ।
      5. परिवर्तनों को सहेजें (मैक्रो उपयोग करने के लिए तैयार होना चाहिए)।
      6. इमेजजे पैनल से मैक्रो को कॉल करें या उसमें शॉर्टकट बनाएं। मैक्रो मानक खुली संवाद खिड़की के साथ शुरू होता है। प्रक्रिया की जाने वाली छवि का चयन करें।
        नोट: मैन्युअल थ्रेसहोल्ड समायोजन के मामले में, सीमा मूल्य की मैन्युअल पुष्टि की आवश्यकता होगी (थ्रेसहोल्ड डायलॉग विंडो पर लागू बटन का उपयोग करके परिवर्तन स्वीकार करने से बचें, इसके बजाय एक्शन आवश्यक कस्टम संवाद विंडो का उपयोग करें)। मैक्रो के साथ काम करके प्राप्त परिणाम चरण 2.1.8 (सारांश संवाद खिड़की में शामिल) में वर्णित लोगों के समान हैं। इसके अतिरिक्त, मैनुअल थ्रेसहोल्ड समायोजन के मामले में लोअर थ्रेसहोल्ड स्तर लॉग संवाद विंडो में प्रदर्शित किया जाता है, क्योंकि यह मूल्य यदि आवश्यक हो तो भविष्य में प्राप्त परिणामों को पुन: पेश करने की अनुमति देता है। पूरक आंकड़े S1 और S2 FAs.ijm मैक्रो के लिए एक प्रशिक्षण डेटासेट के रूप में शामिल किया गया ।
  2. सेल आकार विश्लेषण
    1. मैनुअल
      1. इमेजजे या किसी अन्य इमेज प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर में एक छवि को समान कार्यों के समान सेट के साथ खोलें (आगे के निर्देश इमेजजे से संबंधित हैं)। मेनू विश्लेषण से चयन करके मापा जाने वाले मापदंडों का चयन करें । प्रदर्शित होने वाले बॉक्स में माप और टिकिंग शेप वर्णनकर्ता सेट करें।
      2. फ्रीहैंड चयन आइकन का उपयोग करके, पसंद के जंक्शन प्रोटीन (एस) द्वारा चिह्नित सेल सीमाओं को मैन्युअल रूप से चित्रित करें। चुने हुए मापदंडों की गणना प्रत्येक सेल के लिए स्वचालित रूप से की जाती है। प्रत्येक सेल को संपादित करके रेखांकित करने के बाद परिणामों को स्टोर करें । चयन । प्रबंधक में जोड़ें। निर्बाध सीमाओं के साथ केवल पूर्ण, पूरी तरह से दिखाई देने वाली कोशिकाओं को गिना जाना चाहिए।
      3. जब दृश्य के क्षेत्र में सभी कोशिकाओं को रेखांकित कर रहे हैं, आरओआई प्रबंधक के बाएं बॉक्स में प्रदर्शित होने वाले सभी नंबरों को चिह्नित करके माप करें (कोशिकाओं के अनुरूप) और उपाय पर क्लिक करें परिणाम बॉक्स में दिखाई देते हैं और पसंद की स्प्रेडशीट में स्थानांतरित किए जा सकते हैं।
    2. स्वचालित
      नोट: सेल आकार वर्णनकर्ताओं (सीएसआई, आस्पेक्ट रेशियो, गोलाई, दृढ़ता) के मात्राकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए एक इमेजजे मैक्रो तैयार किया गया है और इस लेख (CSI.ijm) से जुड़ा हुआ है। मैक्रो मुख्य रूप से इमेजजे प्लगइन पर आधारित है जिसे मोर्फोलिबजे (https://imagej.net/MorphoLibJ) 5 कहाजाताहै। मैक्रो निम्नलिखित चरणों को निष्पादित करता है: 1) छवि की प्रत्येक सीमा का विस्तार 10 काले पिक्सल [MorpholibJ]; 2) फैलाव और कटाव के दौर - रूपात्मक फिल्टर [MorpholibJ]; 3) रूपात्मक विभाजन [MorpholibJ] द्वारा कोशिकाओं की सीमाओं की बाइनरी छवि का उत्पादन; 4) सेल सीमाओं का फैलाव; 5) पिक्सल वैल्यू का उलटा; 6) चयन और क्षेत्र और छवि पर कोशिकाओं की परिधि की माप की पीढ़ी; और 7) एक नई फ़ाइल के लिए उल्लिखित कोशिकाओं और ImageJ ROI चयन के साथ छवि को सहेजना।
      1. इमेजजे सोर्स फाइल्स फोल्डर में स्थित प्लगइन्स या मैक्रो फोल्डर में मैक्रो के साथ .ijm फाइल ले जाएं। इमेजजे पैनल से मैक्रो को कॉल करें या उसमें शॉर्टकट बनाएं।
      2. एक नए डेटासेट के परिमाणीकरण से पहले, सबसे छोटे और ब्याज के सबसे बड़े क्षेत्रों के मूल्यों का निर्धारण करें। छवि पर सबसे छोटी और सबसे बड़ी कोशिकाओं के कुछ (3-10) उदाहरणों की रूपरेखा (फ्रीहैंड या बहुभुज चयन) और फिर उनके क्षेत्र को मापने(विश्लेषण। उपाय)
      3. वैकल्पिक रूप से, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ मैक्रो को चलाएं (कम आकार की सीमा 0 सेट है और ऊपरी सीमा अनंत के लिए निर्धारित है), मैक्रो खत्म करने और सेट सेल आकार सीमाओं विकल्प का चयन करने के लिए प्रतीक्षा करें। अपने लेबल पर क्लिक करके सबसे छोटी और सबसे बड़ी कोशिकाओं के क्षेत्र को मापें और फिर इमेजजे आरओआई प्रबंधक में उपाय दबाएं। the_smallest_cell और the_biggest_cell चर का मूल्य निर्धारित करें। परिवर्तनों को सहेजें, सभी मैक्रो डायलॉग खिड़कियां बंद करें और मैक्रो को फिर से चलाएं।
        नोट: मैक्रो आरओआई आकार सीमाओं की स्थापना के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह सिफारिश नहीं है क्योंकि यह काफी अनुचित सेल टुकड़े या सेल समूहों को मापने की संभावना बढ़ जाती है ।
      4. मानक ओपन संवाद खिड़की के साथ मैक्रो शुरू करें। संसाधित की जाने वाली छवि (ग्रेस्केल) का चयन करें।
      5. परिणामों का विश्लेषण करें। मैक्रो द्वारा प्रदान किए गए आउटपुट में शामिल हैं: परिणामों की तालिका (सेल लेबल, इमेज लेबल, सेल क्षेत्र[पिक्सल 2],सेल परिधि[पिक्सल 2],परिपत्रता [सीएसआई], आस्पेक्ट रेशियो, गोलाई, दृढ़ता), उल्लिखित कोशिकाओं और आरओआई चयन सूची के साथ छवि (जो परिणाम उपफोल्डर में नई फ़ाइल में भी सहेजी जाएगी)। परिणाम तालिका स्वचालित रूप से उपयोगकर्ता के क्लिपबोर्ड पर कॉपी की जाएगी।
        नोट: पूरक आंकड़े S3 और S4 CSI.ijm मैक्रो के लिए एक प्रशिक्षण डेटासेट के रूप में शामिल किया गया ।

3. क्वांटिफिकेशन

  1. एफएएस का परिमाणीकरण
    1. प्रति सेल/नाभिक के हिसाब से मतलब एफए नंबर और एवरेज एफए साइज की गणना करें ।
      नोट: कुछ सेल लाइनों के लिए अलग-अलग कोशिकाओं में अलग-अलग एफएस की गिनती करना संभव है। सेल लाइनों के लिए जिनके पास मजबूत सेल-सेल संपर्क हैं और एमसीएफ 7 जैसे मोनोलेयर के रूप में बढ़ते हैं, प्रति सेल एफए से प्राप्त मूल्यों को पूरी छवि में नाभिक की संख्या से गणना करके गणना की जा सकती है।
    2. आबादी (प्रायोगिक समूहों) के बीच संभावित मतभेदों के सांख्यिकीय महत्व का आकलन करें । डेटा के वितरण और विचरण के आधार पर, दो अलग-अलग समूहों की तुलना के लिए छात्र टी-टेस्ट (सामान्य वितरण) या गैर-पैरामेट्रिक यू-टेस्ट (मान-व्हिटनी) का उपयोग करें। कई समूहों की तुलना के लिए उपयुक्त पोस्ट-हॉक परीक्षणों के साथ मिलकर वन-वे एवलोवा या क्रुस्कल-वालिस का उपयोग करें।
  2. सेल आकार विश्लेषण
    1. आकार वर्णनकर्ताओं की गणना
      1. मैनुअल विश्लेषण: उचित क्षेत्र और परिधि से प्रत्येक मापा सेल के लिए पसंद की स्प्रेडशीट में सेल आकार सूचकांक (सीएसआई, जिसे परिपत्रता या सेल आकार भी कहा जाता है) की गणना करें:
        Equation 1
        नोट: सीएसआई 1 (परिपत्र) और 0 (लम्बी) के बीच मान लेता है। विभिन्न कोशिका आकृतियों (एक ही क्षेत्र के साथ) और उनके संबंधित सीएसआई के उदाहरण चित्र 2में प्रस्तुत किए गए हैं। स्वचालित विश्लेषण में आकार वर्णनकर्ताओं (सूचीबद्ध और नीचे परिभाषित) के मूल्यों की गणना स्वचालित रूप से की जाती है और परिणाम बॉक्स में दिखाई देती है:
        (1) सीएसआई = 41 * क्षेत्र/(परिधि)2
        (2) एआर = प्रमुख धुरी/
        (3) गोलाई = 4 * क्षेत्र /2
        (4) दृढ़ता = क्षेत्र/उत्तल क्षेत्र
    2. सेल आकार वितरण के हिस्टोग्राम
      1. परिपत्रता (सीएसआई) के हिस्टोग्राम के रूप में प्लॉट सेल आकार वितरण। कोशिकाओं को उनके सीएसआई मूल्य (न्यूनतम 200-400 कोशिकाओं के लिए गणना) के अनुसार वर्गीकृत करें, दस समान अंतरालों में से एक (सीमा: 0-1, बिन चौड़ाई: 0.1)। हिस्टोग्राम हर श्रेणी में कोशिकाओं की संख्या प्रदर्शित करता है।
        नोट: ठेठ MCF7 सेल परत के आकार वितरण दिखा हिस्टोग्राम लगभग 0.7-0.8 सीएसआई की एक चोटी से पता चलता है । यदि कोशिकाओं का आकार किसी कारक द्वारा विकृत किया जाता है (उदाहरण के लिए paclitaxel उपचार, जो G2/M चरण की गिरफ्तारी का कारण बनता है और परिणाम में अधिक कोशिकाएं गोल होती हैं) तो इसे हिस्टोग्राम पर प्रतिबिंबित किया जाना चाहिए ।
    3. संचयी वितरण भूखंड
      1. प्रत्येक सेल लाइन के लिए संचयी सीएसआई वितरण की तुलना करें, क्योंकि यह सेल आकार परिवर्तन (या वितरण में किसी भी अन्य परिवर्तन) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मतभेदों का आकलन करने का सबसे अच्छा तरीका है। उदाहरण के लिए, इसे एफए के बदलते वितरण को ट्रैक करने के लिए लागू किया जा सकता है।
      2. वितरण की तुलना करने के लिए संचयी वितरण समारोह (सीडीएफ) की गणना करें। सीडीएफ किसी दिए गए सीएसआई मूल्य (एक्स एक्सिस पर प्लॉट) प्रतिशत (या सापेक्ष गणना) के लिए असाइन करता है जिसके लिए सभी मूल्य इस सीएसआई मूल्य (वाई एक्सिस पर प्लॉट) के बराबर या बराबर हैं। इस प्रकार, जैसा कि सीएसआई मूल्य अधिक हो जाता है, मूल्यों के सेट का प्रतिशत जो इस मूल्य के कम या बराबर होते हैं, वह भी अधिक हो जाता है। सीडीएफ की गणना पसंद के सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर या मैन्युअल रूप से की जा सकती है।
      3. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कोलगोमोरोव-स्मिनोव नॉनपरमेट्रिक परीक्षण का उपयोग करें।

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Representative Results

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फोकल आसंजन विश्लेषण
HAX1 जीन के नॉकआउट को पहले फोकल आसंजन6को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था । कोशिकाओं को कोलेजन आई-लेपित सतह पर 48 एच के लिए सुक्षित किया गया था। MCF7 नियंत्रण कोशिकाओं और एमसीएफ 7 कोशिकाओं की छवियां एक HAX1 नॉकडाउन(HAX1 KD) के साथ तीन स्वतंत्र फोकल आसंजन प्रोटीन पैक्सिलिन के साथ दाग प्रयोगों से एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (बेसल क्षेत्र से फोकल एकल विमान/जेड-स्लाइस से छवि) का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे । प्रत्येक सेल लाइन से लगभग 2,000-2,500 कोशिकाओं से एफएएस वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी। सबसे छोटे फोकल आसंजन के लिए औसत मूल्य 50 (पिक्सेल2)के लिए सेट किया गया था। इमेजजे के साथ एफएएस काउंट की प्रतिनिधि छवियां, जिनमें अंतिम, गिने गए रूपरेखा और मूल छवि के साथ एफए की रूपरेखा का ओवरले शामिल है, चित्र 3 एपर दोनों सेल लाइनों के लिए दिखाया गया है। दोनों सेल लाइनों में एफएस की संख्या और आकार में अंतर चित्र 3बीपर प्रस्तुत किया जाता है ।

सेल आकार विश्लेषण
मैनुअल मूल्यांकन: MCF7 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था, माध्यम को एक ही ताजा माध्यम (अनुपचारित) या माध्यम के लिए 0.1 माइक्रोन पैक्टैक्सेल (पीटीएक्स) के साथ आदान-प्रदान किया गया था - सेल गोलाई को प्रेरित करने के लिए - और एक और 24 एच के लिए सुसंस्कृत। विरोधी प्लाकोग्लोबिन एंटीबॉडी और डीएपीआई के साथ दागदार कॉन्फ्लूंट एमसीएफ 7 मोनोलेयर की छवियां एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एपिकल क्षेत्र से एकल जेड-स्लाइस) का उपयोग करके प्राप्त की गई थीं। प्रत्येक प्रयोग (अनुपचारित/इलाज) से लगभग 200-400 कोशिकाओं (2-3 क्षेत्रों को) प्रलेखित किया गया (40x उद्देश्य) और छवियों का मूल्यांकन ImageJ छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर(चित्रा 4A)का उपयोग करके किया गया था। उल्लिखित कोशिकाओं के साथ प्रत्येक कोशिका परत के प्रतिनिधि क्षेत्रों को चित्र 4 ए (अनुपचारित और पीटीएक्स-उपचारित कोशिकाओं) में दिखाया गया है। सभी कोशिकाओं को उनके सीएसआई मूल्यों (10 अंतराल, बिन चौड़ाई 0.1) के अनुसार वर्गीकृत किया गया था और संबंधित हिस्टोग्राम(चित्रा 4 बी)में प्रस्तुत किया गया था, जो अंतिम बिन (0.9-1) में वृद्धि दिखाता है और पीटीएक्स-उपचारित कोशिकाओं के लिए मुख्य चोटियों (0.6-0.9) की सपाटता, अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में। सीएसआई के संचयी वितरण में अंतर की गणना सांख्यिकीय महत्व के लिए कोलगोमोरोव-स्मिनोव परीक्षण (K-S) का उपयोग करके की गई थी, जो एक आयामी संभावना वितरण की समानता का एक गैर-परापमेट्रिक परीक्षण था। सॉफ्टवेयर के साथ फ्रीक्वेंसी डिस्ट्रीब्यूशन हिस्टोग्राम और संचयी वितरण भूखंड(चित्रा 4सी)उत्पन्न किए गए थे।

स्वचालित मूल्यांकन: एमसीएफ7 कोशिकाओं को 24 एच के लिए सुसंस्कृत किया गया था, जो ऐक्टिन की कल्पना करने के लिए फ्लोरोफोर-कंजूगेटेड फालोइडिन के साथ तय और दाग दिया गया था। छवियों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एपिकल क्षेत्र से एकल जेड-स्लाइस) का उपयोग करके लिया गया था। शामिल प्रोटोकॉल(चित्रा 5ए-सी)के अनुसार, संलग्न मैक्रो फ़ाइल का उपयोग करके मोनोलेयर की ग्रेस्केल छवियों का विश्लेषण किया गया था। कुल मिलाकर, देखने के 12 क्षेत्रों से ५१२ कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित की गई । परिणाम परिपत्रता(चित्रा 5D)के वितरण प्रस्तुत एक हिस्टोग्राम के रूप में प्लॉट किए गए थे ।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लोरोफोर-कंजूगेटेड फॉलोइडिन के साथ ऐक्टिन धुंधला, एक ही क्षेत्र से दो अलग-अलग जेड-स्लाइस। (A)कॉर्टिकल ऐक्टिन वाला एपिकल रीजन। (ख)ऐक्टिन स्ट्रेस फाइबर वाला बेसल क्षेत्र। बार: 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अलग-अलग परिधि वाले आकारों के लिए विभिन्न सेल शेप इंडेक्स (सीएसआई) मूल्यों के उदाहरण, लेकिन एक ही क्षेत्र। बाईं ओर बहुत लम्बी आकार सीएसआई 0 के करीब है, जबकि दाईं ओर आदर्श सर्कल में 1 का सीएसआई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: फोकल आसंजन मात्राकरण। (A)MCF7-आधारित सेल लाइनों की प्रतिनिधि छवियां: नियंत्रण और HAX1 केडी पैक्सिलिन के साथ दाग; बाएं से दाएं: (1) पैक्सिलिन और नाभिक (2) ने एफए रूपरेखा और मूल छवि के एफएस (3) ओवरले को रेखांकित और गिने। बार: 20 माइक्रोन। इंसेट (प्रत्येक चित्र के नीचे) ज़ूम बॉक्स्ड क्षेत्रों को दिखाते हैं। (ख)दो सेल लाइनों के बीच एफएस आकार और संख्या में अंतर दिखाने वाले भूखंड । छात्र टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व का आकलन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एमसीएफ7 सेल लेयर में paclitaxel (PTX) द्वारा प्रेरित सेल आकार में परिवर्तन; मैनुअल गिनती । (A)एमसीएफ7 मोनोलेयर्स के प्रतिनिधि क्षेत्र, पीटीएफएक्स के साथ अनुपचारित और इलाज की जाने वाली कोशिकाएं, जंक्शन प्रोटीन प्लाकोग्लोबिन और डीएपीआई, बार: 20 माइक्रोन के साथ दाग। दाईं ओर का पैनल इमेजजे में संसाधित छवि को दिखाता है; सेल किनारों को रेखांकित किया जाता है और सभी गिनी जाने वाले कोशिकाओं को गिने जाते हैं। (ख)अनुपचारित और पीटीएक्स-उपचारित कोशिकाओं में सीएसआई वितरण, प्रत्येक प्रयोग में 200-400 कोशिकाओं (अनुपचारित/उपचारित), बिन चौड़ाई: ०.१ दिखाते हुए हिस्टोग्राम । एक अंश के रूप में सापेक्ष आवृत्तियों के साथ आवृत्ति वितरण विश्लेषण का उपयोग करके भूखंड उत्पन्न किए गए थे। (ग)अनुपचारित और पीटीएमएक्स-उपचारित मोनोलेयर्स के लिए संचयी वितरण का भूखंड। कोलगोमोरोव-स्मिनोव नॉनपरमेट्रिक टेस्ट (केएस) का उपयोग करके सांख्यिकीय अंतर की गणना की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: MCF7 मोनोलेयर में सेल आकार स्वचालित विधि का उपयोग कर मूल्यांकन किया। (ए-सी) संलग्न मैक्रो द्वारा निष्पादित बाद के चरणों को दर्शाते हुए स्वचालित छवि विश्लेषण का एक उदाहरण। (A)इनपुट इमेज; कॉर्टिकल ऐक्टिन; ग्रेस्केल, स्केल बार 10 माइक्रोन (सूचनात्मक उद्देश्यों के लिए; स्केल बार को विश्लेषण छवियों में एम्बेडेड नहीं किया जाना चाहिए)। (ख)विभाजन के बाद सेल परत; सेल सीमाओं को रेखांकित किया गया; पूरी सीमाओं के बिना कोशिकाओं को समाप्त कर दिया। (ग)कोशिका का ओवरले मूल छवि पर रूपरेखा। (घ)विश्लेषण डेटासेट में सीएसआई के वितरण को दर्शाने वाला हिस्टोग्राम, 512 कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा S1, S2: MCF7 कोशिकाओं, पैक्सिलिन और DAPI-FAs और नाभिक कल्पना करने के लिए दाग । FAs.ijm मैक्रो के लिए एक प्रशिक्षण डेटासेट के रूप में प्रदान की गई।
चित्रा S1: कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा S2: कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा S3, S4: MCF7 कोशिकाओं, plakoglobin और DAPI-सेल सेल जंक्शनों और नाभिक कल्पना करने के लिए दाग । सीएसआई.आईजेएम मैक्रो के लिए एक प्रशिक्षण डेटासेट के रूप में प्रदान की गई।
चित्रा S3: कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा S4: कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

FAs.txt: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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सेल-सेल और सेल-सब्सट्रेट आसंजन एपिथेलियल कोशिकाओं के अंतर्निहित गुणों का गठन करते हैं और ऊतक मॉर्फोजेनेसिस और एम्ब्रिजेनेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वयस्क ऊतकों में कोशिका परत के यांत्रिक गुणों का उचित विनियमन होमोस्टेसिस को बनाए रखने और ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस जैसे रोग प्रतिक्रियाओं को रोकने में महत्वपूर्ण है। फोकल आसंजन का आकार और संख्या सेल-सब्सट्रेट आसंजन की ताकत पर निर्भर करती है, जबकि सेल आकार अनुबंधित बलों पर निर्भर करता है और सेल-सेल-संपर्कों की स्थिति से संबंधित है।

यहां, हम इस मामले में फोकल आसंजन और सेल परत में पूरी कोशिकाओं में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा दाग वाले सेलुलर संरचनाओं के क्षेत्र, संख्या और आकार के मात्रात्मक विश्लेषण के दो सरल तरीकों का वर्णन करते हैं। हालांकि, प्रस्तावित उपकरणों को किसी भी चुने हुए ढांचे के परिमाणीकरण के लिए पुन: उद्देशित किया जा सकता है। इन विश्लेषणों के लिए महत्वपूर्ण मुद्दा इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग की गुणवत्ता है। इन तरीकों को सेल-कल्चर यूनिट और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से लैस किसी भी मानक प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है। वे सेल लाइनों की तुलना करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, खासकर जब मापा मापदंडों में अंतर (प्राकृतिक या विशिष्ट उपचार द्वारा प्रेरित) पर्याप्त हैं। उन्हें मिनट के मतभेदों को मापने या पूर्ण माप स्थापित करने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि वे प्रारंभिक मनमाने ढंग से सेटिंग्स में न्यूनतम परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील होते हैं, खासकर फोकल आसंजन के मामले में। एफए क्वांटिफिकेशन की यह विधि टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी जैसे अधिक उन्नत और विशिष्ट तरीकों से कम है, लेकिन इसमें परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता नहीं होने का लाभ है।

फोकल आसंजन मापन के समान तरीके 7 , 8 ,,98,,910से पहले बताए गए थे . यहां, हमने सेटिंग्स को निर्दिष्ट किया और मापों को सुविधाजनक बनाने के लिए कई विकल्पों के साथ एक मुफ्त इमेजजे मैक्रो बनाया।

सेल आकार विश्लेषण कई बार वर्णित किया गया था, बहुत जटिल और विस्तृत तरीकों सहित11,,12। यहां, हम एपिथेलियल सेल मोनोलेयर में परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं, जो सेल आकृति विज्ञान या विकासात्मक परिवर्तनों की तुलना करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत मोनोलेयर्स में सेल आकार विश्लेषण की मैनुअल विधि का वर्णन पिछली रिपोर्ट6में किया गया था । किसी वस्तु (ओं) के आकार का वर्णन और तुलना करने के तरीके के रूप में सीएसआई सूत्र का व्यापक रूप से विभिन्न विषयों13, 14,में उपयोग कियाजाताहै, जिसमें भूविज्ञान शामिल है, जहां से इसकी उत्पत्ति हुई थी। परिणामों को हिस्टोग्राम के रूप में प्रस्तुत करना और / या संचयी वितरण समारोह के रूप में आमतौर पर किसी भी प्रकार के 8 , 10,,815के वितरण की तुलना के लिए उपयोग कियाजाताहै ।

विशेष रूप से, हम यहां इमेजजे प्लगइन मोर्हब्लिबजे (https://imagej.net/MorphoLibJ) के आधार पर स्वचालित सेल आकार विश्लेषण के लिए एक उपकरण पेश करते हैं। हम एक मैक्रो फ़ाइल प्रदान करते हैं, जो इस विश्लेषण को जल्दी और कुशलता से कर सकता है। यह विधि हमेशा सही सेल सीमाओं को पहचानती नहीं है, लेकिन दोषपूर्ण माप (जो हर स्वचालित विश्लेषण में मौजूद हैं) का प्रतिशत न्यूनतम है और अंतिम परिणाम को काफी प्रभावित नहीं करना चाहिए, खासकर यदि पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाता है। पूरी सीमाओं के बिना कोशिकाओं को समाप्त कर रहे हैं । स्वचालित सेल आकार विश्लेषण में निर्विवाद फायदे हैं और हम इस विधि को प्रस्तुत करते हैं ताकि वैज्ञानिक समुदाय द्वारा इसकी सराहना की जा सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को पोलिश राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र द्वारा अनुदान संख्या 2014/14/M/NZ1/00437 के तहत समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A32740 goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride Sigma A9434
BSA BioShop ALB001.500
Collagen from calf skin Sigma C9791-10MG
DAPI Sigma D9542 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate ThermoFisher Scientific 21885-025
FBS ThermoFisher Scientific 10270-136
Junction plakoglobin Cell Signaling 2309S rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2 Alpina standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL) ATCC ATCC HTB-22 epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope Olympus
Paxillin Abcam ab32084 rabbit, 1:250, Y113
PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Phalloidin-TRITC conjugate Sigma P1951 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX Sigma T7402-1MG
TBST – NaCl Sigma S9888
TBST – Trizma base Sigma T1503
Triton X-100 Sigma 9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope Zeiss

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References

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एमसीएफ7 सेल मोनोलेयर्स में सेल-सब्सट्रेट आसंजन क्षेत्र और सेल आकार वितरण का मात्राकरण
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Wakula, M., Balcerak, A., Smietanka, U., Chmielarczyk, M., Konopiński, R., Grzybowska, E. A. Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (160), e61461, doi:10.3791/61461 (2020).More

Wakula, M., Balcerak, A., Smietanka, U., Chmielarczyk, M., Konopiński, R., Grzybowska, E. A. Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (160), e61461, doi:10.3791/61461 (2020).

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