Kvantifisering av celle-substrat vedheft område og celle form distribusjoner i MCF7 celle monolayers
Summary
Artikkelen beskriver kvantifisering av 1) størrelsen og antall fokale adhesjoner og 2) celleformindeks og dens distribusjon fra konsantbilder av de sammenføyte monolagerne til MCF7-celler.
Abstract
Metodene som presenteres her kvantifisere noen parametere for samflytende tilhengercellemonolag fra flere passende fargede konsernbilder: vedheft til substratet som en funksjon av antall og størrelse på fokale adhesjoner, og celleform, preget av celleformindeksen og andre formbeskrivelser. Fokale adhesjoner ble visualisert av paxillin farging og cellecellegrenser var preget av kobling plakoglobin og actin. Metodene for cellekultur og farging var standard; bilder representerer enkelt fokale plan; bildeanalyse ble utført ved hjelp av offentlig tilgjengelig bildebehandlingsprogramvare. De presenterte protokollene brukes til å kvantifisere antall og størrelse på fokale adhesjoner og forskjellene i celleformfordeling i monolayers, men de kan brukes på nytt for kvantifisering av størrelsen og formen på enhver annen distinkt cellulær struktur som kan farges (f.eks mitokondrier eller kjerner). Å vurdere disse parametrene er viktig i karakteriseringen av de dynamiske kreftene i tilhengercellelag, inkludert celleadhesjon og actomyosin-kontraktilitet som påvirker celleformen.
Introduction
Epitelcellemonolag fungerer som et kollektiv der cellecelle- og cellesubstratvedheft samt kontraktile krefter og spenninger representerer viktige parametere, og deres riktige balanse bidrar til enhetens samlede integritet1,,2,,3. Dermed representerer vurdering av disse parametrene en måte å etablere gjeldende status for cellelaget.
De to metodene som er beskrevet her representerer en todimensjonal analyse av de samfalter monolager av tilhenger, epitelceller (i dette tilfellet MCF7 brystkreftcellelinje). Analysen utføres ved hjelp av konfuserte bilder (enkelt Z-skiver) fra forskjellige regioner på Z-aksen; basalområdet nær et substrat for fokale vedheft (FA) målinger og apikal region for celleform målinger. De presenterte metodene er relativt enkle og krever standard laboratorieteknikker og åpen kildekode-programvare. Konfisk mikroskopi er tilstrekkelig for denne protokollen, slik at den kan utføres uten å bruke mer spesialisert TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopi. Dermed kan protokollen implementeres i en relativt standard laboratorieinnstilling. Selv om nøyaktigheten av metodene er begrenset, kan de skille grunnleggende forskjeller i fokal vedheft og celleform.
Begge metodene som er beskrevet her består av standard eksperimentelle prosedyrer som cellekultering, immunstoppnåelse, konfikal bildebehandling og bildeanalyse utført ved hjelp av ImageJ. Imidlertid kan enhver bildebehandlingsprogramvare med de riktige funksjonene brukes. De presenterte metodene kan spore og sammenligne endringer påført av farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifikasjon. Å skaffe bestemte verdier anbefales ikke, på grunn av den begrensede presisjonen til disse metodene. To automatiserte makroer ble inkludert, for å lette målingene av mange bilder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellecelle- og cellesubstratadhesjon utgjør iboende attributter av epitelcellene og spiller den kritiske rollen i vevmorfogenese og embriogenese. I voksent vev er riktig regulering av mekaniske egenskaper av cellelaget avgjørende for å opprettholde homeostase og forhindre patologiske reaksjoner som tumorprogresjon og metastase. Størrelsen og antall fokale adhesjoner avhenger av styrken av celle-substrat vedheft, mens celleform avhenger av kontraktile krefter og er relatert til statusen for celle-celle-kontakter.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av det polske nasjonale vitenskapssenteret under tilskudd nr.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
