Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen
Summary
Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.
Abstract
De hier gepresenteerde methoden kwantificeren enkele parameters van aanhangende celmonolagen van meerdere op de juiste wijze vastgehouden confocale afbeeldingen: hechting aan het substraat als functie van het aantal en de grootte van focale verklevingen en celvorm, gekenmerkt door de celvormindex en andere vormbeschrijvingen. Focale verklevingen werden gevisualiseerd door paxilline kleuring en cel-cel grenzen werden gekenmerkt door knooppunt plakoglobine en actin. De methoden voor celkweek en kleuring waren standaard; afbeeldingen vertegenwoordigen afzonderlijke brandpuntsvlakken; beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van openbaar beschikbare software voor beeldverwerking. De gepresenteerde protocollen worden gebruikt om het aantal en de grootte van focale verklevingen en de verschillen in celvormverdeling in de monolagen te kwantificeren, maar ze kunnen opnieuw worden gebruikt voor de kwantificering van de grootte en vorm van een andere afzonderlijke cellulaire structuur die kan worden gekleurd (bijvoorbeeld mitochondriën of kernen). Het beoordelen van deze parameters is belangrijk bij de karakterisering van de dynamische krachten in de hechtende cellaag, inclusief celhechting en actomyosinecontractiliteit die de celvorm beïnvloedt.
Introduction
Epitheelcelmonolagen fungeren als een collectief waarin celcel- en celsubstraathechting en contractielkrachten en spanningen belangrijke parameters vertegenwoordigen en hun juiste evenwicht bijdraagt aan de algehele integriteit van eenheid1,2,3. Het beoordelen van deze parameters is dus een manier om de huidige status van de cellaag vast te stellen.
De twee hier beschreven methoden vertegenwoordigen een tweedimensionale analyse van de samenvloeiende monolagen van aanhangende, epitheelcellen (in dit geval MCF7 borstkankercellijn). De analyse wordt uitgevoerd met behulp van confocale afbeeldingen (enkele Z-segmenten) uit verschillende regio’s op de Z-as; basaal gebied in de buurt van een substraat voor focale hechting (FA) metingen en apicale regio voor celvorm metingen. De gepresenteerde methoden zijn relatief eenvoudig en vereisen standaard laboratoriumtechnieken en open-source software. Confocale microscopie is voldoende voor dit protocol, dus het kan worden uitgevoerd zonder gebruik te maken van meer gespecialiseerde TIRF (Total Internal Reflection Fluorescentie) microscopie. Zo zou het protocol kunnen worden geïmplementeerd in een relatief standaard laboratoriumomgeving. Hoewel de nauwkeurigheid van de methoden beperkt is, kunnen ze basisverschillen in brandpuntshechting en celvorm onderscheiden.
Beide hier beschreven methoden bestaan uit de standaard experimentele procedures zoals celverlening, immunostaining, confocale beeldvorming en beeldanalyse uitgevoerd met ImageJ. Echter, elke beeldverwerking software met de juiste functies kan worden gebruikt. De gepresenteerde methoden kunnen veranderingen volgen en vergelijken die zijn veroorzaakt door farmacologische behandeling of minimale genetische modificatie. Het verkrijgen van bepaalde waarden wordt niet aanbevolen, vanwege de beperkte precisie van deze methoden. Twee geautomatiseerde macro’s werden opgenomen, om de metingen van vele beelden te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celcel- en celsubstraathechting vormen inherente kenmerken van de epitheelcellen en spelen de cruciale rol in weefselmorfogenese en embriogenese. In volwassen weefsels is de juiste regulatie van mechanische eigenschappen van de cellaag cruciaal bij het handhaven van homeostase en het voorkomen van pathologische reacties zoals tumorprogressie en metastase. De grootte en het aantal brandpuntsverklevingen zijn afhankelijk van de sterkte van de hechting van het celsubstraat, terwijl de celvorm afhankelijk is van contractiele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Poolse National Science Center onder grant nr.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
