Kvantifiering av cellsubstratvidhäftningsområde och cellformfördelningar i MCF7 Cell Monolayers
Summary
Artikeln beskriver kvantifiering av 1) storlek och antal fokala sammanväxningar och 2) cell form index och dess fördelning från konfa bilder av konfluenta monolayers av MCF7 celler.
Abstract
De metoder som presenteras här kvantifiera vissa parametrar för konfluenta vidhäftande cell monolayers från flera lämpligt färgade confocal bilder: vidhäftning till substratet som en funktion av antalet och storleken på fokala sammanväxningar, och cell form, som kännetecknas av cellen form index och andra form deskriptorer. Focal sammanväxningar visualiserades av paxillin färgning och cell-cell gränser präglades av korsningen plakoglobin och aktin. Metoderna för cellodling och färgning var standard; Bilder representerar enstaka fokalplan. bildanalys utfördes med hjälp av offentligt tillgängliga bildbehandlingsprogram. De presenterade protokollen används för att kvantifiera antalet och storleken på fokala sammanväxningar och skillnaderna i cellformfördelning i monolayers, men de kan återanvändas för kvantifiering av storlek och form av någon annan distinkt cellulär struktur som kan färgas (t.ex. mitokondrierna eller atomkärnor). Att bedöma dessa parametrar är viktigt i karakteriseringen av de dynamiska krafterna i vidhäftande cellskikt, inklusive cellvidhäftning och aktomyosinkontraktilitet som påverkar cellformen.
Introduction
Epitelial cell monolayers fungera som ett kollektiv där cell-cell och cell-substrat vidhäftning samt kontraktila krafter och spänningar representerar viktiga parametrar och deras rätt balans bidrar till den övergripande integriteten hos enheten1,2,3. Att bedöma dessa parametrar representerar således ett sätt att fastställa celllagrets aktuella status.
De två metoder som beskrivs här representerar en tvådimensionell analys av konfluenta monolayers av vidhäftande, epitelceller (i detta fall MCF7 bröstcancer cellinje). Analysen utförs med hjälp av konfokala bilder (enstaka Z-skivor) från olika regioner på Z-axeln. basala regionen nära ett substrat för fokalvidhäftning (FA) mätningar och apikal region för cellform mätningar. De presenterade metoderna är relativt enkla och kräver standard laboratorieteknik och programvara med öppen källkod. Konfokalmikroskopi är tillräcklig för detta protokoll, så det kan utföras utan att använda mer specialiserade TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopi. Således skulle protokollet kunna genomföras i en relativt standard laboratorium inställning. Även om metodernas noggrannhet är begränsad, kan de skilja på grundläggande skillnader i fokal vidhäftning och cellform.
Båda metoderna som beskrivs här består av standard experimentella procedurer såsom cellodling, immunstaining, konfial avbildning och bildanalys som utförs med ImageJ. Alla bildbehandlingsprogram med lämpliga funktioner kan dock användas. De presenterade metoderna kan spåra och jämföra förändringar som orsakas av farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifiering. Att erhålla bestämda värden rekommenderas inte, på grund av den begränsade precisionen hos dessa metoder. Två automatiserade makron ingick, för att underlätta mätningar av många bilder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell-cell och cell-substrat vidhäftning utgör inneboende attribut av epitelceller och spela den avgörande rollen i vävnad morphogenesis och embriogenesis. I vuxna vävnader är korrekt reglering av mekaniska egenskaper hos celllagret avgörande för att upprätthålla homeostas och förhindra patologiska reaktioner som tumörprogression och metastasering. Storleken och antalet fokala sammanväxningar beror på styrkan hos cellsubstratvidhäftning, medan cellformen beror på kontraktila krafter och är relaterad till …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av polska National Science Center under bidrag nr 2014/14/M/NZ1/00437.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
