Quantifizierung von Zell-Substrat-Adhäsionsflächen und Zellformverteilungen in MCF7-Zell-Monolayern
Summary
Der Artikel beschreibt die Quantifizierung von 1) der Größe und Anzahl der fokalen Verklebungen und 2) Zellformindex und seine Verteilung von konfokalen Bildern der konfluenten Monolayer von MCF7-Zellen.
Abstract
Die hier vorgestellten Methoden quantifizieren einige Parameter von konfluent haftenden Zellmonolayern aus mehreren entsprechend gefärbten konfokalen Bildern: Haftung auf dem Substrat in Abhängigkeit von Anzahl und Größe der Fokaladesionen und Zellform, gekennzeichnet durch den Zellformindex und andere Formdeskriptoren. Fokale Adhäsionen wurden durch Paxillin-Färbung visualisiert und Zellzellränder wurden durch Kreuzung Plakoglobin und Actin gekennzeichnet. Die Methoden für Zellkultur und Färbung waren Standard; Bilder stellen einzelne Fokalebenen dar; Die Bildanalyse wurde mit einer öffentlich zugänglichen Bildverarbeitungssoftware durchgeführt. Die vorgestellten Protokolle werden verwendet, um die Anzahl und Größe der fokalen Adhäsionen und die Unterschiede in der Zellformverteilung in den Monolayern zu quantifizieren, aber sie können für die Quantifizierung der Größe und Form jeder anderen unterschiedlichen Zellstruktur, die gefärbt werden kann (z. B. Mitochondrien oder Kerne), umfunktioniert werden. Die Bewertung dieser Parameter ist wichtig für die Charakterisierung der dynamischen Kräfte in der anhaftenden Zellschicht, einschließlich Zellhaftung und Actomyosin-Kontraktilität, die sich auf die Zellform auswirkt.
Introduction
Epithelzellmonolayer fungieren als Kollektiv, in dem Zell-Zell- und Zellsubstratadhäsion sowie kontraktile Kräfte und Spannungen wichtige Parameter darstellen und ihr richtiges Gleichgewicht zur Gesamtintegrität der Einheit1,2,3beiträgt. Die Bewertung dieser Parameter stellt daher eine Möglichkeit dar, den aktuellen Status der Zellschicht festzulegen.
Die beiden hier beschriebenen Methoden stellen eine zweidimensionale Analyse der konfluenten Monolayer von anhaftenden Epithelzellen dar (in diesem Fall MCF7 Brustkrebszelllinie). Die Analyse erfolgt mit konfokalen Bildern (einzelne Z-Slices) aus verschiedenen Regionen auf der Z-Achse; Basalbereich in der Nähe eines Substrats für fokale Adhäsionsmessungen (FA) und apikaler Bereich für Zellformmessungen. Die vorgestellten Methoden sind relativ einfach und erfordern Standardlabortechniken und Open-Source-Software. Die konfokale Mikroskopie ist für dieses Protokoll ausreichend, so dass sie ohne speziellere TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) durchgeführt werden kann. Somit könnte das Protokoll in einer relativ standardisierten Laborumgebung implementiert werden. Obwohl die Genauigkeit der Methoden begrenzt ist, können sie grundlegende Unterschiede in der fokalen Haftung und Zellform unterscheiden.
Beide hier beschriebenen Methoden bestehen aus den üblichen experimentellen Verfahren wie Zellkultivierung, Immunfärbung, konfokale Bildgebung und Bildanalyse, die mit ImageJ durchgeführt werden. Es kann jedoch jede Bildverarbeitungssoftware mit den entsprechenden Funktionen verwendet werden. Die vorgestellten Methoden können Veränderungen nachverfolgen und vergleichen, die durch pharmakologische Behandlung oder minimale genetische Veränderung verursacht werden. Aufgrund der begrenzten Genauigkeit dieser Methoden wird nicht empfohlen, bestimmte Werte zu erhalten. Zwei automatisierte Makros wurden aufgenommen, um die Messung vieler Bilder zu erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Zellzell- und Zellsubstratadhäsion sind inhärente Attribute der Epithelzellen und spielen die entscheidende Rolle bei der Gewebemorphogenese und Embriogenese. In erwachsenen Geweben ist die richtige Regulierung der mechanischen Eigenschaften der Zellschicht entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase und die Verhinderung pathologischer Reaktionen wie Tumorprogression und Metastasierung. Die Größe und Anzahl der Fokaladesionen hängt von der Stärke der Zellsubstrathaftung ab, während die Zellform von…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Polnischen National Science Center unter der Fördernummer 2014/14/M/NZ1/00437 unterstützt.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
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