Quantifizierung von Zell-Substrat-Adhäsionsflächen und Zellformverteilungen in MCF7-Zell-Monolayern

Summary

Der Artikel beschreibt die Quantifizierung von 1) der Größe und Anzahl der fokalen Verklebungen und 2) Zellformindex und seine Verteilung von konfokalen Bildern der konfluenten Monolayer von MCF7-Zellen.

Abstract

Die hier vorgestellten Methoden quantifizieren einige Parameter von konfluent haftenden Zellmonolayern aus mehreren entsprechend gefärbten konfokalen Bildern: Haftung auf dem Substrat in Abhängigkeit von Anzahl und Größe der Fokaladesionen und Zellform, gekennzeichnet durch den Zellformindex und andere Formdeskriptoren. Fokale Adhäsionen wurden durch Paxillin-Färbung visualisiert und Zellzellränder wurden durch Kreuzung Plakoglobin und Actin gekennzeichnet. Die Methoden für Zellkultur und Färbung waren Standard; Bilder stellen einzelne Fokalebenen dar; Die Bildanalyse wurde mit einer öffentlich zugänglichen Bildverarbeitungssoftware durchgeführt. Die vorgestellten Protokolle werden verwendet, um die Anzahl und Größe der fokalen Adhäsionen und die Unterschiede in der Zellformverteilung in den Monolayern zu quantifizieren, aber sie können für die Quantifizierung der Größe und Form jeder anderen unterschiedlichen Zellstruktur, die gefärbt werden kann (z. B. Mitochondrien oder Kerne), umfunktioniert werden. Die Bewertung dieser Parameter ist wichtig für die Charakterisierung der dynamischen Kräfte in der anhaftenden Zellschicht, einschließlich Zellhaftung und Actomyosin-Kontraktilität, die sich auf die Zellform auswirkt.

Introduction

Epithelzellmonolayer fungieren als Kollektiv, in dem Zell-Zell- und Zellsubstratadhäsion sowie kontraktile Kräfte und Spannungen wichtige Parameter darstellen und ihr richtiges Gleichgewicht zur Gesamtintegrität der Einheit^1,2,3beiträgt. Die Bewertung dieser Parameter stellt daher eine Möglichkeit dar, den aktuellen Status der Zellschicht festzulegen.

Die beiden hier beschriebenen Methoden stellen eine zweidimensionale Analyse der konfluenten Monolayer von anhaftenden Epithelzellen dar (in diesem Fall MCF7 Brustkrebszelllinie). Die Analyse erfolgt ....

Protocol

1. Vorbereitende Schritte

1. Zellaussaat zur Gewinnung von konfluenten Monolayern
   1. Vor der Aussaat die Brunnen einer 4-Wells-Kammerrutsche mit Kollagen I (oder einer anderen ECM-Komponente nach Wahl) beschichten. Für die Kollagen-I-Beschichtung folgen Sie einem kommerziellen Protokoll: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html bei einer Konzentration von 8 g/cm².
   2. Samen 400.000 Zellen zu einem Brunnen einer 4-Well-Kammerrutsche.
   3. Kultur die Zellen für 24 h (oder länger, je nach den experimentellen Endpunkten) vor der Färbung, in einem Inkubator bei 37 °C, 5%_CO2

Results

Fokale Haftungsanalyse
Der Knockdown des HAX1-Gens hatte zuvor gezeigt, dass er fokale Adhäsionen beeinflusst⁶. Die Zellen wurden auf kollageni-beschichteter Oberfläche für 48 h kultiviert. Bilder der MCF7-Kontrollzellen und MCF7-Zellen mit einem HAX1-Knockdown (HAX1 KD) aus drei unabhängigen Experimenten, die mit fokalem Adhäsionsprotein Paxillin gefärbt waren, wurden mit einem konfokalen Mikroskop (Bild von einer einzigen Fokalebene/Z-Scheibe aus de.......

Discussion

Die Zellzell- und Zellsubstratadhäsion sind inhärente Attribute der Epithelzellen und spielen die entscheidende Rolle bei der Gewebemorphogenese und Embriogenese. In erwachsenen Geweben ist die richtige Regulierung der mechanischen Eigenschaften der Zellschicht entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase und die Verhinderung pathologischer Reaktionen wie Tumorprogression und Metastasierung. Die Größe und Anzahl der Fokaladesionen hängt von der Stärke der Zellsubstrathaftung ab, während die Zellform von kontrakt.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A32740	Anti-Kaninchen für Ziegen, 1:500
Ammoniumchlorid	Sigma	A9434
BSA	BioShop	ALB001.500
Kollagen aus Kalbsleder	Sigma	C9791-10MG
DAPI	Sigma	D9542	1:10000 (Lager 1 mg/mL in H2O), Nukleinsäure Färben DMEM
+ GlutaMAX, 1 g/L D-Glukose, Pyruvat	ThermoFisher Scientific	21885-025
FBS	ThermoFisher Scientific	10270-136
Junction Plakoglobin	Cell Signaling	2309S	Kaninchen, 1:400
Laminar-Flow-Schrank Klasse 2	Alpina		Standardausrüstung
MCF7-basierteHAX1KD Zelllinie	Zelllinie, die am Nationalen Institut für Onkologie, Warschau, etabliert wurde, beschrieben in Balcerak et al., 2019		MCF7-Zelllinie mitHAX1knockdown
MCF7-Zelllinie (KONTROLLE)	ATCC	ATCC HTB-22	epitheliale, adhärente Brustkrebs-Zelllinie
Olympus CK2 Lichtmikroskop	Olympus
Paxillin	Abcam	ab32084	Kaninchen, 1:250, Y113
PBS	ThermoFisher Scientific	10010023
Phalloidin-TRITC-Konjugat	Sigma	P1951	1:400 (vorrätig 5 mg/mL in DMSO), Aktinmarkierung
PTX	Sigma	T7402-1MG
TBST – NaCl	Sigma	S9888
TBST – Trizma base	Sigma	T1503
Triton X-100	Sigma	9002-93-11
Zeiss LSM800 Konfokalmikroskop	Zeiss