Summary

Quantifizierung von Zell-Substrat-Adhäsionsflächen und Zellformverteilungen in MCF7-Zell-Monolayern

Published: June 24, 2020
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Summary

Der Artikel beschreibt die Quantifizierung von 1) der Größe und Anzahl der fokalen Verklebungen und 2) Zellformindex und seine Verteilung von konfokalen Bildern der konfluenten Monolayer von MCF7-Zellen.

Abstract

Die hier vorgestellten Methoden quantifizieren einige Parameter von konfluent haftenden Zellmonolayern aus mehreren entsprechend gefärbten konfokalen Bildern: Haftung auf dem Substrat in Abhängigkeit von Anzahl und Größe der Fokaladesionen und Zellform, gekennzeichnet durch den Zellformindex und andere Formdeskriptoren. Fokale Adhäsionen wurden durch Paxillin-Färbung visualisiert und Zellzellränder wurden durch Kreuzung Plakoglobin und Actin gekennzeichnet. Die Methoden für Zellkultur und Färbung waren Standard; Bilder stellen einzelne Fokalebenen dar; Die Bildanalyse wurde mit einer öffentlich zugänglichen Bildverarbeitungssoftware durchgeführt. Die vorgestellten Protokolle werden verwendet, um die Anzahl und Größe der fokalen Adhäsionen und die Unterschiede in der Zellformverteilung in den Monolayern zu quantifizieren, aber sie können für die Quantifizierung der Größe und Form jeder anderen unterschiedlichen Zellstruktur, die gefärbt werden kann (z. B. Mitochondrien oder Kerne), umfunktioniert werden. Die Bewertung dieser Parameter ist wichtig für die Charakterisierung der dynamischen Kräfte in der anhaftenden Zellschicht, einschließlich Zellhaftung und Actomyosin-Kontraktilität, die sich auf die Zellform auswirkt.

Introduction

Epithelzellmonolayer fungieren als Kollektiv, in dem Zell-Zell- und Zellsubstratadhäsion sowie kontraktile Kräfte und Spannungen wichtige Parameter darstellen und ihr richtiges Gleichgewicht zur Gesamtintegrität der Einheit1,2,3beiträgt. Die Bewertung dieser Parameter stellt daher eine Möglichkeit dar, den aktuellen Status der Zellschicht festzulegen.

Die beiden hier beschriebenen Methoden stellen eine zweidimensionale Analyse der konfluenten Monolayer von anhaftenden Epithelzellen dar (in diesem Fall MCF7 Brustkrebszelllinie). Die Analyse erfolgt mit konfokalen Bildern (einzelne Z-Slices) aus verschiedenen Regionen auf der Z-Achse; Basalbereich in der Nähe eines Substrats für fokale Adhäsionsmessungen (FA) und apikaler Bereich für Zellformmessungen. Die vorgestellten Methoden sind relativ einfach und erfordern Standardlabortechniken und Open-Source-Software. Die konfokale Mikroskopie ist für dieses Protokoll ausreichend, so dass sie ohne speziellere TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) durchgeführt werden kann. Somit könnte das Protokoll in einer relativ standardisierten Laborumgebung implementiert werden. Obwohl die Genauigkeit der Methoden begrenzt ist, können sie grundlegende Unterschiede in der fokalen Haftung und Zellform unterscheiden.

Beide hier beschriebenen Methoden bestehen aus den üblichen experimentellen Verfahren wie Zellkultivierung, Immunfärbung, konfokale Bildgebung und Bildanalyse, die mit ImageJ durchgeführt werden. Es kann jedoch jede Bildverarbeitungssoftware mit den entsprechenden Funktionen verwendet werden. Die vorgestellten Methoden können Veränderungen nachverfolgen und vergleichen, die durch pharmakologische Behandlung oder minimale genetische Veränderung verursacht werden. Aufgrund der begrenzten Genauigkeit dieser Methoden wird nicht empfohlen, bestimmte Werte zu erhalten. Zwei automatisierte Makros wurden aufgenommen, um die Messung vieler Bilder zu erleichtern.

Protocol

1. Vorbereitende Schritte Zellaussaat zur Gewinnung von konfluenten Monolayern Vor der Aussaat die Brunnen einer 4-Wells-Kammerrutsche mit Kollagen I (oder einer anderen ECM-Komponente nach Wahl) beschichten. Für die Kollagen-I-Beschichtung folgen Sie einem kommerziellen Protokoll: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html bei einer Konzentration von 8 g/cm2. Samen 400.000 Zellen zu einem Brunnen einer 4-Well-Kammerrutsche.<…

Representative Results

Fokale HaftungsanalyseDer Knockdown des HAX1-Gens hatte zuvor gezeigt, dass er fokale Adhäsionen beeinflusst6. Die Zellen wurden auf kollageni-beschichteter Oberfläche für 48 h kultiviert. Bilder der MCF7-Kontrollzellen und MCF7-Zellen mit einem HAX1-Knockdown (HAX1 KD) aus drei unabhängigen Experimenten, die mit fokalem Adhäsionsprotein Paxillin gefärbt waren, wurden mit einem konfokalen Mikroskop (Bild von einer einzigen Fokalebene/Z-Scheibe …

Discussion

Die Zellzell- und Zellsubstratadhäsion sind inhärente Attribute der Epithelzellen und spielen die entscheidende Rolle bei der Gewebemorphogenese und Embriogenese. In erwachsenen Geweben ist die richtige Regulierung der mechanischen Eigenschaften der Zellschicht entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase und die Verhinderung pathologischer Reaktionen wie Tumorprogression und Metastasierung. Die Größe und Anzahl der Fokaladesionen hängt von der Stärke der Zellsubstrathaftung ab, während die Zellform von…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Polnischen National Science Center unter der Fördernummer 2014/14/M/NZ1/00437 unterstützt.

Materials

Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A32740 goat anti-rabbit, 1:500
Ammonium chloride Sigma A9434
BSA BioShop ALB001.500
Collagen from calf skin Sigma C9791-10MG
DAPI Sigma D9542 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining
DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate ThermoFisher Scientific 21885-025
FBS ThermoFisher Scientific 10270-136
Junction plakoglobin Cell Signaling 2309S rabbit, 1:400
Laminar-flow cabinet class 2 Alpina standard equipment
MCF7-basedHAX1KD cell line Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 MCF7 cell line withHAX1knockdown
MCF7 cell line (CONTROL) ATCC ATCC HTB-22 epithelial, adherent breast cancer cell line
Olympus CK2 light microscope Olympus
Paxillin Abcam ab32084 rabbit, 1:250, Y113
PBS ThermoFisher Scientific 10010023
Phalloidin-TRITC conjugate Sigma P1951 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling
PTX Sigma T7402-1MG
TBST – NaCl Sigma S9888
TBST – Trizma base Sigma T1503
Triton X-100 Sigma 9002-93-11
Zeiss LSM800 Confocal microscope Zeiss

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Cite This Article
Wakula, M., Balcerak, A., Smietanka, U., Chmielarczyk, M., Konopiński, R., Grzybowska, E. A. Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (160), e61461, doi:10.3791/61461 (2020).

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