القياس الكمي لمنطقة التصاق الخلايا الركازة وتوزيعات شكل الخلية في الطبقات الأحادية الخلية MCF7
Summary
ويصف المقال كم من 1) حجم وعدد من الالتصاقات البؤري و 2) مؤشر شكل الخلية وتوزيعها من الصور confocal من monolayers التقاء من الخلايا MCF7.
Abstract
الأساليب المعروضة هنا كمي بعض المعلمات من monolayers الخلية التقاء التصاق من الصور متعددة ملوّن بشكل مناسب confocal: التصاق إلى الركيزة كدالة لعدد وحجم التصاقات البؤري، وشكل الخلية، التي تتميز مؤشر شكل الخلية وغيرها من واصفات الشكل. تم تصور الالتصاقات البؤرية بواسطة تلطيخ paxillin وكانت الحدود الخلوية مميزة بتقاطع plakoglobin و actin. وكانت أساليب زراعة الخلايا وتلطيخها قياسية؛ تمثل الصور مستويات بؤرية واحدة؛ تم إجراء تحليل الصور باستخدام برامج معالجة الصور المتاحة للجمهور. وتستخدم البروتوكولات المعروضة لتحديد عدد وحجم الالتصاقات البؤرية والاختلافات في توزيع شكل الخلايا في الطبقات الأحادية، ولكن يمكن إعادة استخدامها لتحديد حجم وشكل أي بنية خلوية متميزة أخرى يمكن أن تكون ملطخة (على سبيل المثال، الميتوكوندريا أو نوكلي). تقييم هذه المعلمات مهم في توصيف القوى الديناميكية في طبقة الخلية المنضمة، بما في ذلك التصاق الخلية وانكماش أكتوميوسين الذي يؤثر على شكل الخلية.
Introduction
monolays الخلية الظهارية بمثابة الجماعية التي خلية الخلية وخلوية الركيزة التصاق وكذلك القوى المتعاقدة والتوترات تمثل المعلمات الهامة وتوازنها السليم يساهم في سلامة الشاملة للوحدة1،2،3. وهكذا، فإن تقييم هذه المعلمات يمثل وسيلة لتحديد الوضع الحالي لطبقة الخلية.
الطريقتان الموصوفتان هنا تمثلان تحليلا ثنائي الأبعاد للطبقات الأحادية المتقاربة للخلايا الظهارية (في هذه الحالة MCF7 خط خلايا سرطان الثدي). ويتم إجراء التحليل باستخدام الصور confocal (واحد Z-شرائح) من مناطق مختلفة على المحور Z; منطقة القاعدية بالقرب من الركيزة لقياسات الالتصاق البؤري (FA) والمنطقة apical لقياسات شكل الخلية. الطرق المعروضة بسيطة نسبيا وتتطلب تقنيات مختبرية معيارية وبرامجية مفتوحة المصدر. المجهر Confocal كافية لهذا البروتوكول، لذلك يمكن أن يؤديها دون استخدام أكثر تخصصا TIRF (الانعكاس الداخلي الكلي الفلورية) المجهر. وهكذا، يمكن تنفيذ البروتوكول في إطار مختبري معياري نسبياً. على الرغم من أن دقة الطرق محدودة، إلا أنها يمكن أن تميز الاختلافات الأساسية في الالتصاق البؤري وشكل الخلية.
كلا الأسلوبين الموصوفين هنا تتكون من الإجراءات التجريبية القياسية مثل زراعة الخلايا، والمناعة، والتصوير confocal وتحليل الصور التي أجريت باستخدام ImageJ. ومع ذلك، يمكن استخدام أي برنامج معالجة الصور مع وظائف مناسبة. ويمكن للطرق المعروضة أن تتعقب وتقارن التغيرات التي يحدثها العلاج الدوائي أو الحد الأدنى من التعديل الوراثي. لا ينصح بالحصول على قيم محددة، نظراً لدقة محدودة لهذه الطرق. تم تضمين اثنين من وحدات الماكرو الآلي، لتسهيل قياسات العديد من الصور.
Protocol
Representative Results
Discussion
خلية الخلية وخلية الخلية الركيزة التصاق تشكل سمات متأصلة من الخلايا الظهارية وتلعب دورا حاسما في تكوين الأنسجة وتولد. في أنسجة البالغين التنظيم السليم للخصائص الميكانيكية لطبقة الخلية أمر بالغ الأهمية في الحفاظ على التوازن والوقاية من الاستجابات المرضية مثل تطور الورم والنقائل. يعتمد ح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المركز الوطني البولندي للعلوم بموجب المنحة رقم 2014/14/M/NZ1/00437.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
