Kvantificering af celleunderlagsadhæsionsområde og celleformfordelinger i MCF7-cellemonolag
Summary
Artiklen beskriver kvantificering af 1) størrelsen og antallet af fokale sammenvoksninger og 2) celleform indeks og dens fordeling fra konfokale billeder af sammenløbet monolayers af MCF7 celler.
Abstract
De metoder, der præsenteres her kvantificere nogle parametre for sammenfaldende klæbende celle monolag fra flere passende farvede konfokale billeder: vedhæftning til substratet som en funktion af antallet og størrelsen af fokale sammenvoksninger, og celle form, karakteriseret ved celleform indeks og andre form deskriptorer. Fokale sammenvoksninger blev visualiseret af paxillin farvning og celle-celle grænser var præget af krydset plakoglobin og actin. Metoderne til cellekultur og farvning var standard; billeder repræsenterer enkelte brændpunkter; billedanalyse blev udført ved hjælp af offentligt tilgængelig billedbehandlingssoftware. De præsenterede protokoller bruges til at kvantificere antallet og størrelsen af fokale sammenvoksninger og forskellene i celleformfordeling i monolagene, men de kan repurposed til kvantificering af størrelsen og formen af enhver anden særskilt cellulær struktur, der kan farves (f.eks mitokondrier eller kerner). Vurdering af disse parametre er vigtig i karakteriseringen af de dynamiske kræfter i klæbende cellelag, herunder celleadhæsion og actomyosin-kontraktilitet, der påvirker celleformen.
Introduction
Epitelcellemonolayers fungerer som et kollektiv , hvor celle – og celleunderlag vedhæftning samt kontraktile kræfter og spændinger repræsenterer vigtige parametre , og deres rette balance bidrager til enhed1,2,3‘s overordnede integritet . Derfor repræsenterer en vurdering af disse parametre en måde at fastslå cellelagets aktuelle status på.
De to metoder, der er beskrevet her repræsenterer en to-dimensionel analyse af sammenløbet monolag af klæbende, epitelceller (i dette tilfælde MCF7 brystkræft cellelinje). Analysen udføres ved hjælp af konfokale billeder (enkelte Z-udsnit) fra forskellige områder på Z-aksen; basalområde nær et substrat til fokal vedhæftningsmålinger (FA) og apical region for celleformmålinger. De præsenterede metoder er relativt enkle og kræver standard laboratorieteknikker og open source-software. Konfokal mikroskopi er tilstrækkelig til denne protokol, så det kan udføres uden at anvende mere specialiseret TIRF (Total Internal Reflection Fluorescens) mikroskopi. Protokollen kan således gennemføres i et relativt standardlaboratorium. Selv om nøjagtigheden af metoderne er begrænset, kan de skelne grundlæggende forskelle i fokal vedhæftning og celleform.
Begge metoder, der er beskrevet her, består af standardforsøgsprocedurer såsom cellekultning, immunstaining, konfokal billeddannelse og billedanalyse udført ved hjælp af ImageJ. Der kan dog bruges billedbehandlingssoftware med de relevante funktioner. De præsenterede metoder kan spore og sammenligne ændringer forårsaget af farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifikation. Det anbefales ikke at opnå bestemte værdier på grund af disse metoders begrænsede præcision. To automatiserede makroer blev inkluderet, for at lette målinger af mange billeder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celle-celle og celle-substrat vedhæftning udgør iboende attributter af epitelceller og spiller den afgørende rolle i væv morfogenese og embriogenese. I voksne væv den korrekte regulering af mekaniske egenskaber af cellelaget er afgørende for at opretholde homøostase og forebygge patologiske reaktioner som tumor progression og metastase. Størrelsen og antallet af fokale sammenvoksninger afhænger af styrken af celle-substrat vedhæftning, mens celleform afhænger af kontraktile kræfter og er relateret til status …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det polske nationale videnskabscenter under tilskud nr.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
