Quantificazione dell'area di adesione del substrato cellulare e della distribuzione delle forme cellulari nei monostrati cellulari MCF7
Summary
L’articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l’indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.
Abstract
I metodi qui presentati quantificano alcuni parametri dei monostrati cellulari aderenti confluenti da più immagini confocali opportunamente macchiate: adesione al substrato in funzione del numero e delle dimensioni delle adere focali e della forma cellulare, caratterizzata dall’indice di forma cellulare e da altri descrittori di forma. Le adesioni focali sono state visualizzate dalla colorazione paxillin a zintillina e i confini delle cellule cellulari sono stati contrassegnati da plakoglobina di giunzione e actina. I metodi per la coltura cellulare e la colorazione erano standard; le immagini rappresentano singoli piani focali; l’analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando un software di elaborazione delle immagini disponibile pubblicamente. I protocolli presentati vengono utilizzati per quantificare il numero e le dimensioni delle ademonie focali e le differenze nella distribuzione della forma cellulare nei monostrati, ma possono essere riutilizzati per la quantificazione delle dimensioni e della forma di qualsiasi altra struttura cellulare distinta che può essere macchiata (ad esempio, mitocondri o nuclei). La valutazione di questi parametri è importante nella caratterizzazione delle forze dinamiche nello strato cellulare aderente, compresa l’adesione cellulare e la contrattiglio anomiosina che influenza la forma delle cellule.
Introduction
I monostrati cellulari epiteliali agiscono come un collettivo in cui l’adesione cellulare e substrato cellulare, così come le forze e le tensioni contrattuali rappresentano parametri importanti e il loro corretto equilibrio contribuisce all’integrità complessiva dell’unità1,2,3. Pertanto, la valutazione di questi parametri rappresenta un modo per stabilire lo stato corrente del livello della cella.
I due metodi qui descritti rappresentano un’analisi bidimensionale dei monostrati confluenti delle cellule epiteliali aderenti (in questo caso la linea cellulare del cancro al seno MCF7). L’analisi viene eseguita utilizzando immagini confocali (singole sezioni z) provenienti da diverse regioni sull’asse z; regione basale vicino a un substrato per misurazioni di adesione focale (FA) e regione apicale per le misurazioni della forma delle cellule. I metodi presentati sono relativamente semplici e richiedono tecniche di laboratorio standard e software open-source. La microscopia confocale è sufficiente per questo protocollo, quindi può essere eseguita senza utilizzare una microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) più specializzata. Pertanto, il protocollo potrebbe essere implementato in un ambiente di laboratorio relativamente standard. Anche se l’accuratezza dei metodi è limitata, possono distinguere le differenze di base nell’adesione focale e nella forma delle cellule.
Entrambi i metodi qui descritti consistono nelle procedure sperimentali standard come la coltura cellulare, l’immunostaining, l’imaging confocale e l’analisi delle immagini eseguite utilizzando ImageJ. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi software di elaborazione delle immagini con le funzioni appropriate. I metodi presentati possono monitorare e confrontare i cambiamenti inflitti dal trattamento farmacologico o dalla modificazione genetica minima. Non è consigliabile ottenere valori definiti, a causa della precisione limitata di questi metodi. Sono state incluse due macro automatizzate, per facilitare le misurazioni di molte immagini.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’adesione cellulare e substrato cellulare costituiscono attributi intrinseci delle cellule epiteliali e svolgono il ruolo critico nella morfogenesi dei tessuti e nell’embriogenesi. Nei tessuti adulti la corretta regolazione delle proprietà meccaniche dello strato cellulare è cruciale per mantenere l’omeostasi e prevenire le risposte patologiche come la progressione del tumore e la metastasi. La dimensione e il numero di adere focali dipendono dalla forza dell’adesione delle cellule-substrato, mentre la forma cellulare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Nazionale Scientifico Polacco sotto la concessione n. 2014/14/M/ NÀ1/00437.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
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