Summary
O artigo descreve a quantificação de 1) o tamanho e o número de aderências focais e 2) índice de forma celular e sua distribuição a partir de imagens confocal das monocamadas confluentes das células MCF7.
Abstract
Os métodos aqui apresentados quantificam alguns parâmetros de monocamadas de células aderirentes confluentes de múltiplas imagens confocais adequadamente manchadas: adesão ao substrato em função do número e tamanho das aderências focais, e forma celular, caracterizada pelo índice de forma celular e outros descritores de forma. As aderências focais foram visualizadas pela coloração de paxillin e as bordas das células celulares foram marcadas pela plakoglobina de junção e actina. Os métodos de cultura celular e coloração eram padrão; as imagens representam planos focais únicos; a análise de imagens foi realizada utilizando-se software de processamento de imagens disponível publicamente. Os protocolos apresentados são usados para quantificar o número e o tamanho das aderências focais e as diferenças na distribuição de formas celulares nas monocamadas, mas podem ser reaproveitados para a quantificação do tamanho e forma de qualquer outra estrutura celular distinta que possa ser manchada (por exemplo, mitocôndrias ou núcleos). Avaliar esses parâmetros é importante na caracterização das forças dinâmicas na camada celular aderente, incluindo adesão celular e contratilidade de actomyosina que afeta a forma celular.
Introduction
As monocamadas de células epiteliais atuam como um coletivo no qual a adesão célula-célula e substrato de células, bem como forças e tensões contratuais representam parâmetros importantes e seu equilíbrio adequado contribui para a integridade geral da unidade1,,2,,3. Assim, avaliar esses parâmetros representa uma forma de estabelecer o estado atual da camada celular.
Os dois métodos descritos aqui representam uma análise bidimensional das monocamadas confluentes de células epiteliais aderentes (neste caso, linha de células cancerígenas de mama MCF7). A análise é realizada utilizando-se imagens confocal (fatias Z únicas) de diferentes regiões do eixo Z; região basal perto de um substrato para medições de adesão focal (FA) e região apical para medições de forma celular. Os métodos apresentados são relativamente simples e requerem técnicas de laboratório padrão e software de código aberto. A microscopia confocal é suficiente para este protocolo, por isso pode ser realizada sem empregar microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (Fluorescência Interna Total). Assim, o protocolo poderia ser implementado em um ambiente de laboratório relativamente padrão. Embora a precisão dos métodos seja limitada, eles podem distinguir diferenças básicas na adesão focal e na forma celular.
Ambos os métodos descritos aqui consistem nos procedimentos experimentais padrão, como cultivo de células, imunostaining, imagem confocal e análise de imagem realizadas por meio do ImageJ. No entanto, qualquer software de processamento de imagem com as funções apropriadas pode ser usado. Os métodos apresentados podem rastrear e comparar alterações infligidas pelo tratamento farmacológico ou modificação genética mínima. A obtenção de valores definidos não é recomendada, devido à precisão limitada desses métodos. Duas macros automatizadas foram incluídas, para facilitar as medições de muitas imagens.
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Protocol
1. Etapas preparatórias
- Semeadura celular para obter monocamadas confluentes
- Antes de semear, cubra os poços de um escorregador de câmara de 4 poços com colágeno I (ou outro componente ECM de escolha). Para revestimento de colágeno I, siga um protocolo comercial: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html a uma concentração de 8 μg/cm2.
- Semente 400.000 células para um poço de um deslizamento de câmara de 4 poços.
- Cultue as células por 24h (ou mais, dependendo dos pontos finais experimentais) antes de coloração, em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2. Esta etapa permite o amadurecimento dos contatos celulares e a formação de monocamadas.
- Use um microscópio óptico e invertido para verificar a confluência (cerca de 90% é necessário) e uma condição geral de monocamadas. Não prossiga se as células estiverem flutuando ou parecerem estressadas.
- Manchas imunofluorescentes
NOTA: As células podem ser manchadas com um protocolo de escolha. Aqui, a imunofluorescência foi realizada como descrito anteriormente4.- Para análise de adesão focal, colori as células com uma proteína de adesão focal de escolha (neste protocolo paxillin). Para a análise da forma celular mancha com proteína de junção celular de escolha (neste protocolo plakoglobina de proteína desmosômica).
- Para o procedimento, use 0,5 mL de soluções especificadas, a menos que especificado o contrário.
- Fixar células em 4% de formaldeído em PBS por 30 minutos no gelo.
- Incubar com cloreto de amônio de 0,1 M (em PBS) por 10 min para saciar a auto-fluorescência.
- Adicione 0,5% Triton X-100 (em PBS) por 30 min (permeabilização).
- Bloqueie com 5% de leite (ou 1% BSA) em TBS-T por 1 h.
- Incubar com anticorpo primário a 4 °C durante a noite (anti-paxillin: coelho, 1:250, anti-plakoglobina: coelho, 1:400)
- Incubar com anticorpo secundário por 30 min (Alexa Fluor 594 anti-coelho de cabra, 1:500, 1:500)
- Mancha com DAPI de 300 nM por 1-5 min, protegida da luz.
NOTA: Opcionalmente, pode ser realizada uma coloração adicional de actina com conjugados fluorescentes de faloides (conc. 1:400); a faloideina deve ser adicionada no mesmo passo que o anticorpo secundário.
- Imagem confocal
- Tire imagens de fatias Z únicas usando um microscópio confocal (por exemplo, Zeiss LSM800).
NOTA: A coloração opcional da actina pode ajudar a avaliar o plano focal adequado. A coloração de actina cortical está presente na região apical enquanto as fibras de estresse actin estão presentes na região basal, próxima ao substrato, conforme ilustrado na Figura 1. - Imagem de adesão focal
- Escolha fatias Z para análise de adesão focal da região basal, perto do substrato.
- Use um objetivo com a maior abertura numérica disponível (preferível 63x N.A.: 1,4).
NOTA: A forma de FA é muito específica e facilmente reconhecível. Assim, recomenda-se iniciar a varredura a partir de um plano focal abaixo das células e, em seguida, escanear lentamente em direção a elas, até que as FAs estejam claramente visíveis. A análise da imagem será mais precisa a partir de campos de visão menores, que tendem a ser mais uniformes, mas isso implica que menos células serão calculadas em um único campo de visão.
- Imagens de contatos celulares
- Use um objetivo de 40x ou 63x.
- Selecione canais para coloração nuclear e a coloração preferencial da proteína de junção.
- Escolha fatias Z para análise de forma celular da região apical das monocamadas.
- Tire fotos para pelo menos 3 diferentes campos de visão (200-400 células).
- Tire imagens de fatias Z únicas usando um microscópio confocal (por exemplo, Zeiss LSM800).
2. Análise de imagem
NOTA: Desde que as macros funcionem de forma ideal na versão ImageJ 1.50f ou mais recente. Use para quantificação apenas de imagens com uma alta relação sinal-ruído e sem pixels sub ou supersaturados. Os métodos descritos incluem etapas que requerem ajuste manual do parâmetro. Assim, recomenda-se uma configuração de experiência cega/blindada. Para criptografar nomes de arquivos de imagem, plugins ImageJ como "Blind Analysis Tool" (disponível em: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) podem ser usados.
- Análise de adesão focal
NOTA: Os arquivos de entrada recomendados para os seguintes métodos são: imagens de FAs representadas em escala de cinza de 8 bits salvas no formato .tiff.- Imagem aberta usando ImageJ.
- Definir a escala de uma imagem para pixels (Analisar | Escala definida; Remova a escala e verifique a opção Global).
- Inclua o nome do arquivo e a área do ROI nas opções de medição (Analisar | Medidas de conjunto...); verificar as opções de etiquetas de área e exibição.
- Subtrair fundo (Processo | Subtrair fundo; definir parâmetro de raio de bola rolando para 50 pixels; verificar opção paraboloide deslizante). No caso de imagens RGB pseudocoloridas: canais RGB divididos, deixar o canal com FAs abertos, fechar canais restantes (Imagem | Cor | Canais Divididos).
- Determinar a área da menor região de interesse (ROI). Utilizando seleções à mão livre ou polígonos, delineia a menor adesão focal única e mede sua área (Analisar | Medida). Repita esta etapa para diferentes ROIs (FAs) a partir de algumas imagens escolhidas aleatoriamente (para um total de 20 ROIs). Calcule e salve a média dos resultados obtidos.
NOTA: Esta etapa só é necessária quando um determinado conjunto de imagens é analisado pela primeira vez (linha celular específica, slides de revestimento com componentes específicos da matriz extracelular, diferentes condições de cultura). - Converta a imagem em binária usando um dos seguintes métodos:
- Definir o limiar global (Imagem | Ajuste | Limiar; verificar as opções Padrão, B&W e Fundo Escuro, ajustar o limiar manualmente ou configurá-lo automaticamente).
- Definir o limiar local (Imagem | Ajuste | Limite local automático...; definir Método para Phansalkar e verificar objetos brancos na opção de fundo preto. Em seguida, inverta a imagem (Editar | Inverter).
- Meça o número e a área de ROIs. Selecionar analisar | Analisar partículas; verificar unidades pixel, resultados de exibição, resultados claros e opções de resumo, definir parâmetro de tamanho, como um limite inferior usar a média dos menores ROIs da etapa 2.1.5. O limite superior pode ser definido para 25% de uma área celular típica.
- Transferir dados (que inclui nome de imagem, número de FAs, área total e média de FAs; respectivamente Slice, Count, Total Area, Average Size) da janela Resumo para o programa de gerenciamento de dados de escolha.
- Determine o número de células por imagem contando núcleos manchados de DAPI. A contagem pode ser feita manualmente(Plugins | Analisar | Contador de células) ou como em protocolos disponíveis como: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
- Alternativamente, para facilitar a contagem de FAs, use a macro ImageJ anexada (FAs.ijm).
- Mova o arquivo .ijm com a macro para plugins ou pasta de macros localizada nas pastas de arquivos de origem ImageJ.
- Determine uma área do menor ROI conforme descrito na etapa 2.1.4.
- Arquivo macro aberto(Plugins | Macros | Editar...).
- Antes de executar a macro, defina o valor de três variáveis: valor de preenchimento de area_of_the_smallest_region_of_interest com um número adquirido durante a etapa 2.1.4. Defina threshold_type valor para manual ou automático.
- Salvar alterações (a macro deve estar pronta para uso).
- Ligue para a macro do painel ImageJ ou faça um atalho para ele. A macro começa com a janela de diálogo aberta padrão. Selecione a imagem a ser processada.
NOTA: Em caso de ajuste manual do limiar, será necessária a confirmação manual do valor do limiar (evite aceitar alterações usando o botão Aplicar na janela de diálogo Limiar, use a janela de diálogo personalizada Action Required). Os resultados obtidos trabalhando com a macro são os mesmos descritos na etapa 2.1.8 (incluído na janela de diálogo Resumo). Além disso, no caso do ajuste manual do limiar, o Nível inferior do limite é exibido em uma janela de diálogo Log, pois esse valor permite reproduzir resultados obtidos no futuro, se necessário. As Figuras Suplementares S1 e S2 foram incluídas como um conjunto de dados de treinamento para o FAs.ijm macro.
- Análise de forma celular
- Manual
- Abra uma imagem no ImageJ ou outro software de processamento de imagem com um conjunto semelhante de funções (instruções adicionais relativas ao ImageJ). Escolha os parâmetros a serem medidos selecionando no menu Análise | Defina medidas e descritores de forma de tique-taque na caixa de aparecimento.
- Delineie manualmente as bordas celulares, marcadas por proteínas de junção(s) de escolha, usando o ícone de seleções à mão livre. Os parâmetros escolhidos são calculados automaticamente para cada célula. Armazene os resultados depois de delinear cada célula clicando em Editar | Seleção | Adicione ao gerente. Apenas células completas e totalmente visíveis, com bordas ininterruptas devem ser contadas.
- Quando todas as células do campo de visão forem delineadas, faça a medição marcando todos os números que aparecem na caixa esquerda do ROI Manager (correspondente às células) e clicando em Medida Os resultados aparecem na caixa Resultados e podem ser transferidos para a planilha de escolha.
- Automatizado
NOTA: Para facilitar a quantificação dos descritores de forma celular (CSI, proporção, arredondamento, solidez) uma macro ImageJ foi preparada e anexada a este artigo (CSI.ijm). A macro é baseada principalmente no plugin ImageJ chamado MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)5. A macro executa as seguintes etapas: 1) Extensão de cada borda da imagem por 10 pixels pretos [MorpholibJ]; 2) Rodadas de dilatações e erosões - filtro morfológico [MorpholibJ]; 3) Geração de imagem binária das fronteiras das células por segmentação morfológica [MorpholibJ]; 4) Dilatação dos limites celulares; 5) Inversão do valor dos pixels; 6) Geração de seleções e medição de área e perímetro de células na imagem; e 7) Salvar imagem com células delineadas e seleções de ROI imageJ para um novo arquivo.- Mova o arquivo .ijm com a macro para a pasta de plugins ou macros localizada nas pastas de arquivos de origem ImageJ. Ligue para a macro do painel ImageJ ou faça um atalho para ele.
- Antes da quantificação de um novo conjunto de dados, determine valores das menores e maiores regiões de interesse. Contorno (seleção à mão livre ou polígono) alguns (3-10) exemplos das menores e maiores células da imagem e, em seguida, medir sua área (Analisar | Medida).
- Alternativamente, execute a macro com configurações padrão (limite de tamanho inferior é definido para 0 e limite superior é definido para o infinito), aguarde que a macro termine e selecione Definir limites de tamanho da célula. Meça a área das células menores e maiores clicando em seu rótulo e, em seguida, pressione Measure no ImageJ ROI Manager. Definir o valor das variáveis the_smallest_cell e the_biggest_cell. Salve as alterações, feche todas as janelas de diálogo macro e execute a macro novamente.
NOTA: A macro pode ser usada sem definir limites de tamanho do ROI, mas não é recomendada porque aumenta significativamente a chance de medir fragmentos celulares inadequados ou aglomerados celulares. - Inicie a macro com a janela de diálogo Padrão Aberto. Selecione a imagem a ser processada (escala de cinza).
- Analise os resultados. A saída fornecida pela macro consiste em: tabela dos resultados (rótulo de célula, etiqueta de imagem, área celular [pixels2],perímetro celular [pixels2],circularidade [CSI], proporção, arredondamento, solidez), imagem com células delineadas e lista de seleções de ROI (que também serão salvos em novo arquivo na subpasa Resultados). A tabela de resultados será copiada automaticamente para a área de transferência do usuário.
NOTA: As Figuras Suplementares S3 e S4 foram incluídas como conjunto de dados de treinamento para o CSI.ijm macro.
- Manual
3. Quantificação
- Quantificação das FAs
- Calcule o número médio de FAs e o tamanho médio da FA por célula/núcleos.
NOTA: Para algumas linhas de celular é possível contar as FAs separadamente em células distintas. Para linhas celulares que têm contatos fortes células-células e crescem como monocamadas como MCF7, número e tamanho de FAs por célula podem ser calculados dividindo os valores obtidos das FAs contando pelo número de núcleos em toda a imagem. - Avaliar a significância estatística das diferenças potenciais entre as populações (grupos experimentais). Dependendo da distribuição e variância dos dados, para a comparação dos dois grupos diferentes usam teste T (distribuição normal) ou U-test não paramétrico (Mann-Whitney). Para comparação de vários grupos, use ANOVA ou Kruskal-Wallis unidirecional em conjunto com os testes pós-hoc apropriados.
- Calcule o número médio de FAs e o tamanho médio da FA por célula/núcleos.
- Análise de forma celular
- Cálculo dos descritores de forma
- Análise manual: Calcular índice de forma celular (CSI, também chamado de circularidade ou forma celular) na planilha de escolha para cada célula medida a partir da área e perímetro apropriados usando a fórmula:
NOTA: CSI assume valores entre 1 (circular) e 0 (alongado). Os exemplos de várias formas celulares (com a mesma área) e seus respectivos CSIs são apresentados na Figura 2. Na análise automatizada, os valores dos descritores de forma (alistados e definidos abaixo) são calculados automaticamente e aparecem na caixa de resultado:
(1) CSI = 4π*área/(perímetro)2
(2) AR = eixo principal/eixo menor
(3) Arredondamento = 4*área/π*(eixo principal)2
(4) Solidez = área/área convexa
- Análise manual: Calcular índice de forma celular (CSI, também chamado de circularidade ou forma celular) na planilha de escolha para cada célula medida a partir da área e perímetro apropriados usando a fórmula:
- Histogramas da distribuição da forma celular
- Distribuição da forma celular do enredo como um histograma de circularidade (CSI). Classificar as células de acordo com seu valor CSI (calculado para o mínimo de 200-400 células), para um dos dez intervalos uniformes (intervalo: 0-1, largura da lixeira: 0,1). O histograma exibe o número de células em todas as categorias.
NOTA: O histograma que mostra a distribuição da forma da camada típica de célula MCF7 mostra um pico de cerca de 0,7-0,8 CSI. Se a forma das células é distorcida por algum fator (por exemplo, o tratamento paclitaxel, que causa a prisão da fase G2/M e, na consequência, mais células são redondas) deve ser refletida no histograma.
- Distribuição da forma celular do enredo como um histograma de circularidade (CSI). Classificar as células de acordo com seu valor CSI (calculado para o mínimo de 200-400 células), para um dos dez intervalos uniformes (intervalo: 0-1, largura da lixeira: 0,1). O histograma exibe o número de células em todas as categorias.
- Parcelas de distribuição cumulativas
- Compare as distribuições cumulativas de CSI para cada linha celular, pois é a melhor maneira de avaliar diferenças estatisticamente importantes nas mudanças de forma celular (ou quaisquer outras alterações na distribuição. Por exemplo, ele pode ser aplicado para acompanhar a mudança de distribuição das FAs.
- Calcule a Função de Distribuição Cumulativa (CDF) para comparar distribuições. CDF atribui para um determinado valor CSI (plotado no eixo X) a porcentagem (ou contagem relativa) para a qual todos os valores são menores ou iguais a este valor CSI (plotado no eixo Y). Assim, à medida que o valor CSI aumenta, o percentual do conjunto de valores que são menores ou iguais a esse valor também fica maior. O CDF pode ser calculado pelo software estatístico de escolha, ou manualmente.
- Para análise estatística, use o teste não paramétrico kolgomorov-smirnov.
- Cálculo dos descritores de forma
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Representative Results
Análise de adesão focal
O knockdown do gene HAX1 foi anteriormente mostrado para afetar as aderências focais6. As células foram cultivadas na superfície revestida de colágeno por 48 h. Imagens das células de controle MCF7 e células MCF7 com um knockdown HAX1 (HAX1 KD) de três experimentos independentes manchados com proteína de adesão focal paxillin foram obtidos usando um microscópio confocal (imagem de plano focal único/fatia Z da região basal). As FAs de cerca de 2.000-2.500 células de cada linha celular foram quantificadas usando o protocolo descrito. O valor médio para a menor adesão focal foi definido para 50 (pixel2). Imagens representativas de FAs contam com ImageJ, incluindo os contornos finais numerados e a sobreposição dos contornos dos FAs com a imagem original, são mostrados para ambas as linhas de células na Figura 3A. Diferenças no número e tamanho das FAs em ambas as linhas celulares são apresentadas na Figura 3B.
Análise de forma celular
Avaliação manual: As células MCF7 foram cultivadas por 24 h, o meio foi trocado pelo mesmo meio fresco (não tratado) ou pelo meio com paclitaxel de 0,1 μM (PTX) – para induzir arredondamento celular – e cultivado por mais 24 h. Imagens das monocamadas CONfluentes MCF7 manchadas com anticorpo anti-plakoglobina e DAPI foram obtidas usando um microscópio confocal (única fatia Z da região apical). Cerca de 200-400 células (2-3 campos de visão) de cada experimento (não tratado/tratado) foram documentadas (40x objetivo) e as imagens foram avaliadas utilizando-se do software de processamento de imagem ImageJ(Figura 4A). Regiões representativas de cada camada celular com células delineadas são mostradas na Figura 4A (células não tratadas e tratadas com PTX). Todas as células foram categorizadas de acordo com seus valores CSI (10 intervalos, largura da lixeira 0,1) e apresentadas nos respectivos histogramas(Figura 4B),que mostram um aumento na última caixa (0,9-1) e o achatamento dos principais picos (0,6-0,9) para as células tratadas com PTX, comparando com o controle não tratado. As diferenças na distribuição cumulativa do CSI foram calculadas para significância estatística utilizando o teste de Kolgomorov-Smirnov (K-S), um teste não paramétrico da igualdade das distribuições de probabilidade unidimensionais. Histogramas de distribuição de frequência e parcelas de distribuição cumulativa(Figura 4C) foram gerados com software.
Avaliação automatizada: As células MCF7 foram cultivadas por 24h, fixas e manchadas com falooidina conjugada fluorohore para visualizar a actina. As imagens foram tiradas usando um microscópio confocal (única fatia Z da região apical). As imagens em escala de cinza das monocamadas foram analisadas utilizando-se o arquivo macro anexado, de acordo com o protocolo incluído (Figura 5A-C). Ao todo, foram quantificadas 512 células de 12 campos de visão. Os resultados foram traçados como um histograma apresentando distribuição da circularidade (Figura 5D).
Figura 1: Coloração de actina com falooidina conjugada fluorohore, duas fatias Z diferentes do mesmo campo de visão. (A) A região apical com actina cortical. (B) Região basal com fibras de estresse actin. Bar: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de diferentes valores do Índice de Forma celular (CSI) para as formas com perímetros distintos, mas a mesma área. A forma muito alongada à esquerda tem CSI perto de 0, enquanto o círculo ideal à direita tem CSI de 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de adesão focal. (A) Imagens representativas das linhas celulares baseadas em MCF7: CONTROL e HAX1 KD manchadas com paxillin; da esquerda para a direita: (1) paxillin e núcleos (2) delineados e numerados FAs (3) sobreposição de contornos de FAs e a imagem original. Bar: 20 μm. Os insets (abaixo de cada imagem) mostram áreas encaixotadas ampliadas. (B) Parcelas mostrando a diferença entre o tamanho e o número das FAs entre as duas linhas celulares. A significância estatística foi avaliada por meio do teste T do Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Alterações na forma celular induzidas pelo paclitaxel (PTX) na camada celular MCF7; contagem manual. (A) Regiões representativas de monocamadas MCF7, células não tratadas e tratadas com PTX, manchadas com plakoglobina de proteína de junção e DAPI, barra: 20 μm. O painel à direita mostra a imagem processada no ImageJ; bordas celulares são delineadas e todas as células contadas são numeradas. (B) Histogramas mostrando distribuição de CSI em células não tratadas e tratadas com PTX, 200-400 células em cada experimento (não tratada/tratada), largura da lixeira: 0,1. As parcelas foram geradas utilizando-se análise de distribuição de frequências com frequências relativas como fração. (C) O parcela de distribuição cumulativa para as monocamadas não tratadas e tratadas com PTX. Diferença estatística calculada utilizando-se o teste não paramétrico de Kolgomorov-Smirnov (KS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Forma celular em monocamadas MCF7 avaliadas usando o método automatizado. (A-C) Um exemplo da análise automática de imagem ilustrando etapas subsequentes executadas pela macro anexada. (A) Imagem de entrada; actina cortical; escala de cinza, barra de escala 10 μm (para fins informativos; barras de escala não devem ser incorporadas em imagens analisadas). (B) Camada celular após a segmentação; bordas celulares delineadas; células sem fronteiras completas eliminadas. (C) Sobreposição dos contornos da célula na imagem original. (D) Um histograma mostrando a distribuição de CSI no conjunto de dados analisado, 512 células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1, S2: Células MCF7, paxillin e DAPI manchadas para visualizar FAs e núcleos. Fornecido como um conjunto de dados de treinamento para o FAs.ijm macro.
Figura S1: Clique aqui para baixar este número.
Figura S2: Clique aqui para baixar este número.
Figura Suplementar S3, S4: Células MCF7, plakoglobina e DAPI manchadas para visualizar junções celulares e núcleos. Fornecido como um conjunto de dados de treinamento para o CSI.ijm macro.
Figura S3: Clique aqui para baixar este número.
Figura S4: Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
A adesão célula-célula e substrato celular constituem atributos inerentes às células epiteliais e desempenham o papel crítico na morfogênese tecidual e embriogênese. Nos tecidos adultos, a regulação adequada das propriedades mecânicas da camada celular é crucial na manutenção da homeostase e na prevenção de respostas patológicas como progressão do tumor e metástase. O tamanho e o número de aderências focais dependem da força da adesão do substrato celular, enquanto a forma celular depende das forças contratuais e está relacionada com o status dos contatos célula-células.
Aqui, descrevemos dois métodos simples de análise quantitativa da área, número e forma de estruturas celulares manchadas pela imunofluorescência, neste caso aderências focais e todas as células da camada celular. No entanto, as ferramentas propostas podem ser reaproveitadas para a quantificação de qualquer estrutura escolhida. A questão-chave para essas análises é a qualidade da coloração imunofluorescente e da imagem confocal. Esses métodos podem ser implementados em qualquer laboratório padrão equipado com uma unidade de cultura celular e um microscópio confocal. Eles são projetados para comparar linhas celulares, especialmente quando as diferenças (naturais ou induzidas por tratamento específico) nos parâmetros medidos são substanciais. Não são recomendados medir diferenças minuciosas ou estabelecer medidas absolutas, pois são sensíveis a mudanças mínimas nas configurações arbitrárias iniciais, especialmente no caso de aderências focais. Este método de quantificação de FAs é inferior a métodos mais avançados e específicos como a microscopia TIRF, mas tem uma vantagem de não exigir equipamentos sofisticados.
Métodos semelhantes de medidas de adesão focal foram descritos antesde 7,8,9,10. Aqui, especificamos as configurações e criamos uma macro ImageJ gratuita, com várias opções, para facilitar as medições.
A análise da forma celular foi descrita muitas vezes, incluindo métodos muito complexos e detalhados11,12. Aqui, apresentamos um método simples para acompanhar as mudanças nas monocamadas de células epiteliais, o que pode ser muito importante para comparar morfologia celular ou alterações no desenvolvimento. O método manual de análise de formas celulares nas monocamadas apresentadas neste protocolo foi descrito em um relatório anterior6. A fórmula CSI como forma de descrever e comparar a forma de um objeto é amplamente utilizada em diferentes disciplinas13,14, incluindo geologia da qual se originou. A apresentação dos resultados em uma forma de histograma e/ou como função de distribuição cumulativa é comumente utilizada para comparações de distribuições de qualquer tipo8,,10,,15.
Notavelmente, apresentamos aqui uma ferramenta para a análise automatizada de forma celular baseada no plugin ImageJ MorhpLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ). Fornecemos um arquivo macro, que pode realizar essa análise de forma rápida e eficiente. Este método nem sempre reconhece as bordas celulares corretas, mas a porcentagem de medidas defeituosas (que estão presentes em todas as análises automatizadas) é mínima e não deve afetar significativamente o resultado final, especialmente se o número suficiente de células for analisado. Células sem fronteiras completas são eliminadas. A análise automatizada da forma celular tem vantagens inegáveis e apresentamos esse método para que ele possa ser apreciado pela comunidade científica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência polonês sob a concessão nº 2014/14/M/NZ1/00437.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
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