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Immunology and Infection

Estabilidade e Estrutura do Complexo de Histocompatibilidade Maior do Morcego Classe I com β Heterologous2-Microglobulina

Published: March 10, 2021 doi: 10.3791/61462
Automatic Translation
*1,2, *3,4, *2,5, 1,2, 1,2, 2, 2, 4, 1, 4, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

O protocolo descreve métodos experimentais para obter substituições estáveis do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I através de substituições potenciais β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies. A comparação estrutural do MHC I estabilizada por homólogos e heteromaníacos β2m foram investigadas.

Abstract

O maior complexo de histocompatibilidade (MHC) desempenha um papel fundamental na apresentação de peptídeos de antígeno e respostas imunes de células T contra doenças infecciosas e desenvolvimento de tumores. O MHC híbrido I complexo com β substituição heterologous β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies pode ser estabilizado in vitro. Este é um meio viável para estudar MHC I de mamíferos, quando o homólogo β2m não está disponível. Enquanto isso, é indicado que a substituição de mamíferos β2m não afeta significativamente a apresentação de peptídeos. No entanto, há uma resumida limitada em relação à metodologia e à tecnologia para o MHC híbrido I complexizado com heterologos β 2-microglobulina (β2m). Nesse meio, são apresentados métodos para avaliar a viabilidade da β substituição de2m no estudo MHC I. Esses métodos incluem a preparação de construtos de expressão; purificação de corpos de inclusão e redobramento do complexo mhc; determinação da termoestabilidade proteica; triagem de cristal e determinação da estrutura. Este estudo fornece uma recomendação para a compreensão da função e estrutura do MHC I, e também é significativo para avaliação de resposta celular T durante doenças infecciosas e imunoterapia tumoral.

Introduction

O maior complexo de histocompatibilidade (MHC) existe em todos os vertebrados e é um conjunto de genes que determina a imunidade mediada por células a patógenos infecciosos. A classe I do MHC apresenta peptídeos endógenos, como componentes virais produzidos após a infecção por vírus, aos receptores de células T (TCR) na superfície das células CD8+ T para mediar a imunidade celular e participar da regulação imunológica1. Um estudo estrutural de MHC I vinculando-se aos peptídeos fornece informações sobre motivos de ligação de peptídeos e características de apresentação por moléculas de MHC I, que desempenha papéis vitais na avaliação das respostas imunes de células CD8+ T e desenvolvimento de vacinas.

Desde a primeira cristalização e determinação estrutural do MHC I molecular por Bjorkman et al.2, a análise da estrutura cristalina das moléculas de MHC I promoveu muito a compreensão de como os peptídeos se ligam às moléculas de MHC I, e ajuda a entender a interação das cadeias leves com correntes pesadas e peptídeos. Uma série de estudos de acompanhamento indicaram que, embora os genes que codificam a cadeia de luz não esteja associados ao MHC, a cadeia de luz é uma proteína chave para o montagem de moléculas de MHC I3,4. Ele interage com os três domínios das moléculas da classe I do MHC em múltiplas superfícies. Quando a cadeia de luz está ausente, as moléculas classe I do MHC não podem ser corretamente expressas na superfície das células que apresentam antígenos e não podem interagir com o TCR para exercer suas funções imunológicas.

MHC I é composto por uma corrente pesada (cadeia H) e cadeia leve (ou seja, β 2-microglobulina (β2m)), e é montado através de ligação a um peptídeo adequado5. O segmento extracelular da cadeia H consiste nos domínios α1, α2 e α36. Os domínios α1 e α2 formam o sulco de ligação de peptídeo (PBG). A cadeia βde 2m atua como subunidade estrutural do complexo conjunto em MHC I, estabilizando a conformação do complexo, e é uma acompanhante molecular para a cadeia MHC I H dobrando7,8,9. Uma série de estudos mostraram que cadeias MHC I H de vários mamíferos, como morcego (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhesus macaque (Primatas) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mouse (Rodentia) (H-2Kd)14,15, cão (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, gado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 e equino (Periss eodactyla) (Eqca-N*00602 e Eqca-N*00601)18 podem combinar com heterologos β2m(Tabela 1). Essas moléculas híbridas são frequentemente usadas em estudos estruturais e funcionais. No entanto, ainda não está resumida a metodologia para o estudo funcional e estrutural do HÍBRIDO MHC I com β heterologos de2m. Enquanto isso, a base estrutural para o intercambio β2m entre diferentes taxas permanece incerta.

Aqui, o procedimento para expressão de MHC I, redobramento, cristalização, coleta de dados de cristal e determinação da estrutura são resumidos. Além disso, são analisadas substituições potenciais de β2m de diferentes espécies através da comparação da conformação estrutural do MHC I estabilizada por β homônomo e heteróloga de2m. Esses métodos serão úteis para mais estudo estrutural MHC I e avaliação de resposta imune de células CD8+ T em câncer e doenças infecciosas.

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Protocol

1. Preparação de construções de expressão

  1. Recuperar as sequências de genes classe I do MHC (incluindo genes previstos) de morcegos do banco de dados NCBI.
  2. Recuperar maiores sequências de cadeia pesada mhc i do Banco de Dados de Polimorfismo de Imuno (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) e do banco de dados UniProt (www.uniprot.org).
  3. Para obter complexos solúveis de MHC, mutagenize as sequências para remover as regiões citosolicas e transmembranas.
  4. Clone os genes que codificam os ectodomínios do morcego Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (resíduos 1-277) e bat β2m (GenBank no. XP_006920478.1) (resíduos 1-98) em vetores pET-28a (Novagen, Pequim, China), respectivamente.
  5. Inserir as sequências otimizadas (para Escherichia coli) foram inseridas entre os locais NcoI e EcoR1 de um vetor pET-28a modificado.
  6. Construa β plasmídeos de expressão de2m de expressão humanos como descrito anteriormente20.

2. Síntese de peptídeos

  1. Previsão de peptídeos
    1. Como descrito anteriormente10, para tela para peptídeos que podem se ligar a Ptal-N*01:01, prever peptídeos candidatos usando os corpos proteicos de vírus relacionados com morcegos hendra vírus (HeV). Para obter peptídeos de alta afinidade com base no modelo estrutural do servidor online, o servidor NetMHCpan 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 e o Rosetta FlexPepDock22 previram potencial de ligação na fração de peptídeo selecionado. Além disso, outros softwares e bancos de dados, incluindo BIMAS, o Immune Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2 e SYFPEITHI também podem ser usados, todos eles integrando a previsão de afinidade de ligação peptídeo-MHC, transportador associado à eficiência de transporte de antígenos (TAP), decote terminal C proteasomal e meio tempo de dissociação de moléculas classe I peptídeo-HLA em suas leituras.
    2. Para prever peptídeos de alta vinculação, use tanto o servidor NetMHCpan quanto o Rosetta FlexPepDock.
      NOTA: Infelizmente, nem as previsões produzidas coincidiram com os dados experimentais. Isso pode indicar que as previsões atuais de peptídeos de ligação do MHC não eram adequadas para mamíferos não humanos e não-camundongos, como morcegos, que podem ter uma maneira diferente de ligação de peptídeos. Portanto, precisamos combinar vários softwares de predição e resultados experimentais para análise abrangente para obter peptídeos de alta afinidade.
  2. Preparação e preservação de peptídeos
    1. Em vez de gerar peptídeos personalizados, use prestadores de serviços especializados. Compre todos os peptídeos comercialmente seguindo as ferramentas de previsão de peptídeos, que têm uma pontuação de ligação mais alta. A pureza do peptídeo foi determinada a ser >95% pelo HPLC e espectrometria de massa.
    2. Armazene todos os peptídeos adquiridos como pó congelado a −80 °C e dissolva em sulfóxido de dimetila (DMSO) antes de usar.

3. Purificação de corpos de inclusão

  1. Transformação de E. coli
    1. Transforme 10 ng de plasmid contendo morcego MHC I Ptal-N*01:01 H cadeia, ou humano β2m ou morcego β2m em 100 μL de BL21(DE3) E. coli. Tome banho no gelo por 30 minutos.
    2. Choque térmico a 42 °C para 90 s, seguido de banho no gelo por 2 min.
    3. Adicione 800 μL de caldo de lise (LB: extrato de levedura, tripona e NaCl; consulte a Tabela de Materiais) para pisar 3.1.2 e agitar a 200 rotações por minuto (rpm) em uma plataforma de balanço a 37 °C por 20 min.
    4. Aplique 100 μL de suspensão bacteriana na placa contendo a resistência a antibióticos correspondente (ampicilina: 100 ng/mL), que são iguais às construções anteriores.
  2. Culturas inoculadas
    1. Escolha um único clone bacteriano recentemente transformado em 3 mL de LB com meio antibiótico (ampicillina: 100 ng/mL) e cultura a 37 °C, enquanto treme a 200 rpm em uma plataforma de balanço para ativar a bactéria. Culturas podem ser inoculadas tarde da noite, para estarem prontas para indução na manhã seguinte.
    2. Uma noite antes, transfira 500 μL do estoque bacteriano ativado para 50 mL de LB com meio antibiótico (ampicillina: 100 ng/mL) e incubar durante a noite a 37 °C, tremendo a 200 rpm. Para conveniência ao preparar o próximo inoculado, congele o estoque bacteriano ativado restante em alíquotas de 1 mL (500 μL de cultura com 500 μL de 40% de glicerol) a −80 °C até que a próxima preparação seja necessária.
    3. Para gerar grandes quantidades de proteína recombinante, transfira a preparação bacteriana para 2 L de LB com meio antibiótico (ampicillina: 100 ng/mL) a uma proporção de 1:100, incubar a 37 °C enquanto treme a 200 rpm. Cultura até que uma absorção de 0,6 a 600 nm seja alcançada. Adicionar 1 mM isopropílico-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (variar a concentração de IPTG para diferentes MHCs, principalmente entre 0,1 mM-1 mM) ao frasco para indução de expressão proteica.
  3. Bactérias de colheita
    1. Transfira a bactéria para garrafas centrífugas e centrífuga a 5000 x g por 20 min a 4 °C. Todos os passos a partir de agora devem ser realizados a 4 °C.
    2. Resuspenque as bactérias em 60 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e liblua a proteína recombinante expressa por disruptor de células ultrassônicas.
      NOTA: Em geral, o programa que definimos nesta máquina é ultrassônico 6S, intervalo 12S, 300 W, 99 vezes).
  4. Purificação de corpos de inclusão
    1. Centrifugar a suspensão bacteriana sônica a 12.000 x g por 30 min. Descarte o supernasciente e resuspenque a pelota em um volume apropriado de tampão de lavagem (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Repita este processo mais uma vez.
    2. Centrifugar a 12.000 x g por 10-20 min. Descarte o supernasciente e resuspense os corpos de inclusão no tampão de resuspensão (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Remova uma amostra de 20 μL (corpos de inclusão no buffer de ressuspensão) para SDS-PAGE para testar a pureza dos corpos de inclusão.
    3. Centrifugar a preparação restante em 12.000 x g para 10-20 min. Descarte o supernaspeso. Pesar a pelota contendo os corpos de inclusão e adicionar tampão de dissolução (6 M Gua-HCl, 10% glicerina, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) a uma concentração final de 30 mg/mL. Mexa lentamente usando um agitador magnético a 4 °C até que os corpos de inclusão sejam dissolvidos no tampão de dissolução.
    4. Centrífuga 12.000 x g por 10-20 min. Descarte os precipitados. Armazene os corpos de inclusão a −20 °C ou −80 °C.
      NOTA: Antes de prosseguir com a purificação dos corpos de inclusão, confirme que a indução e a expressão da proteína recombinante foram bem sucedidas. Executar amostras de cada cultura (colhida antes e depois da indução do IPTG) em um gel de proteína; 15% SDS-PAGE (goma concentrada SDS-PAGE: H2O, 30% acrilamida, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS e TEMED; Gel de separação SDS-PAGE: H2O, 30% acrilamida, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS e TEMED; consulte a Tabela de Materiais ) para o β2m, 10% SDS-PAGE para a cadeia H.

4. Redobramento do complexo MHC

NOTA: A eficiência dos corpos de inclusão reamoscados afetará o rendimento da proteína obtida. O dobrável compete com a polimerização, por isso é geralmente aceito que re dobrar em baixas concentrações proteicas é o método mais bem sucedido. Neste artigo, a concentração dos corpos de inclusão é de 30 mg/mL.

  1. Prepare o tampão de re dobramento.
    1. Varie a composição do tampão de repato, dependendo da proteína. Por exemplo, o pH, a força iônica, as condições de redox e a presença de ligantes afetarão os resultados de re dobramento. O mais comum é usar buffers à base de Tris ou HEPES em um pH neutro com a concentração de NaCl de 50-500 mM, mas isso também depende da proteína alvo. A seguir, a fórmula tampão de redobramento usada neste artigo.
    2. Prepare o buffer dobrável com 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginine, 2 mM EDTA-2Na.
    3. Esfrie o tampão a 4 °C em um frasco de 250-300 mL e, em seguida, adicione 5 mM de glutationa reduzida (GSH) e 0,5 mM glutationa oxidada (GSSG). Mexa lentamente usando um agitador magnético a 4 °C por mais 10-20 minutos antes de adicionar os corpos de inclusão e peptídeos.
  2. Injeção e diluição da cadeia H MHC e β2m
    NOTA: A temperatura em que o recadamento é realizado pode variar, embora geralmente, para minimizar a agregação, 4 °C é melhor. Usamos diluição para redobrar as proteínas.
    1. Utilizando uma agulha de uma seringa de 1 mL, injete 1 mL de corpos de inclusão hβ2m ou corpos de inclusão bβ2m em dois buffers de repato (1 litro cada), respectivamente. Injete perto da haste de agitação vigorosamente rotativa para obter diluição rápida e eficiente. β2m se reamtobra relativamente fácil e permanece estável mesmo na ausência da cadeia H.
    2. Após a β2m foi dissolvido em solução de redobramento, dissolver peptídeos (5 mg/mL) em DMSO e injetar rapidamente 200 μL na solução de repato. Mexa lentamente por 10-20 min antes de adicionar a corrente H.
    3. Injete a corrente H com o mesmo procedimento descrito acima para β2m. A cadeia H é muito instável; portanto, a ordem da injeção é bastante importante. Injete 3 mL de corpos de inclusão da cadeia H em dois buffers de repato diferentes (1 litro cada) com hβ2m ou bβ2m, respectivamente. A injeção consecutiva de pequenas alíquotas em vez da aplicação única de toda a quantidade de proteína aumenta o rendimento do MHC reutado. Deixe a redobramento a 4 °C para 8-10 h.
  3. Concentração de proteína reu dobrada
    1. Use ultrafiltração em uma câmara pressurizada com membrana MMCO de 10 kDa para concentração das proteínas de reabastece. Este método é conveniente e pode ser combinado com troca de buffer. Adicione buffer de troca (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) à câmara e concentre-se em um volume final de 30-50 mL.
    2. Transfira a solução de reabascamento para um tubo de centrífuga, gire a 12.000 x g por 15 min a 4 °C para remover precipitados.
    3. Transfira cuidadosamente o supernaste e concentre-se ainda mais em um volume final de ~1 mL.
    4. Centrifugar a 12.000 xg por 10-20 min. Transfira o supernante para um tubo estéril e purifique as proteínas usando uma coluna de exclusão de tamanho de GL de 10/300.
    5. Colete as amostras no pico e analise-as usando SDS-PAGE (gel de poliacrilamida de 15%).
    6. Colete o pico complexo de MHC e concentre-se em uma concentração final de 15 mg/mL.
    7. Diluir o complexo para 7,5 mg/mL e 15 mg/mL para cristalização.

5. Cristalização, coleta de dados e processamento

  1. Realize a cristalização de MHC complexo e peptídeo usando a técnica de difusão de vapor de gota sentada.
  2. Tela os complexos Ptal-N*01:01/peptídeos com kits de cristal comercial (por exemplo, kit crystal screen I/II, Index Screen kit, PEGIon kit I/II, e o kit PEGRx).
  3. Selar a solução resultante e equilibrar-se contra 100 μL de solução de reservatório a 4 ou 18 °C.
  4. Observe o crescimento cristalino da cultura por 3 dias, 1 semana, 2 semanas, 1 mês, 3 meses e 6 meses. Use um microscópio para ver se cada gota na placa de cristal tem cristais.
    NOTA: Os cristais Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) foram observados em 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) e 25% (w/v) glicol de polietileno 3.350 a uma concentração de 7,5 mg/mL. Os cristais ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) foram observados em 0,1 M HEPES, pH 7.0, 2% w/v polietileno glicol 3.350 em uma concentração de 7,5 mg/mL.
  5. Para proteção criogênica, transfira os cristais para uma solução de armazenamento contendo 20% de glicerol e depois esfrie rapidamente em um fluxo de nitrogênio gasoso de 100 K.
  6. Colete dados de difração de raios-X da linha de luz BL19U da instalação de radiação síncrotron de Xangai (Xangai, China).

6. Determinação e análises estruturais

  1. Com dados estruturais de alta resolução, processe e dimensione a força da coleta utilizando o programa Denzo e o pacote de software HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Após a escolha de um modelo inicial melhor no Protein Data Bank (PDB), determine as estruturas utilizando substituição molecular com o programa Phaser MR em CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). O modelo utilizado foi a estrutura coordenadas com o código 5F1I do Protein Data Bank (Banco de Dados de Proteínas).
  3. Use o modelo de raio-X refinado para o refinamento inicial da articulação. Use os modos de refino Phenix e articulação apenas para o raio-X e o refinamento de nêutrons e raios-X, respectivamente.
  4. Após cada rodada de refinamento, verifique manualmente o modelo contra Fo − Fc e 2Fo − Mapas de densidade nuclear positiva em Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Isso facilita a colocação adequada de águas e certos átomos D. Todas as figuras de estruturas foram criadas pelo PyMOL (http://www.pymol.org/).

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Representative Results

Trabalhos anteriores relataram que o peptídeo HeV-derivado do HeV (DFANTFLP) foi apresentado por Ptal-N*01:0110,19. Aqui, foi avaliada a capacidade de ligação deste peptídeo para Ptal-N*01:01 com morcego homólogo β2m (bβ2m) e β humanaheterologous de 2m (hβ2m) (Figura1C,1D). Foram formados cristais com maior resolução, respectivamente (Figura 1E,1F). Um cristal é formado a partir do complexo Ptal-N*01:01/HeV1, que foi formado através de renaturação com bβ2m, e a resolução é de 2,31 Å. Um cristal é formado a partir do complexo Ptal-N*01:01/HeV1, que foi formado através de renaturação com hβ2m, e a resolução é de 1,6 Å. O complexo Ptal-N*01:01/HeV1 foi formado com sucesso através de renaturação com bβ2m e hβ2m(Figura 1C,1D). Nesse contexto, mostramos que o complexo Ptal-N*01:01/HeV1 não foi formado sem a presença de β2m(Figura 1A) e o H-2Kd que dobra corretamente através do hβ2m(Figura 1B).

As estruturas de Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m e Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m foram então analisadas. Na estrutura Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, resíduos R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 de bβ2m ligados aos resíduos da cadeia H através do fundo do PBG e resíduos Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 ligados ao domínio α3 da cadeia H. Semelhante ao complexo Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, na estrutura Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, resíduos conservados H31, D53, W60, Y63 de hβ2m que correspondem a bβ2m, fizeram contato com o fundo do PBG e conservaram resíduos Q8, Y10, R12, N24 que correspondem a bβ2m ligados ao domínio α3(Figura 2A,2B).

Nas estruturas gerais Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m e Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, o desvio médio raiz-médio-quadrado (RMSD) dos resíduos 1-184 das cadeias H (formando o α1α2 PBG) foi de 0,248 sob todas as superposições Cα átomos(Figura 3A). Esse achado indicou que não havia diferença entre esses dois complexos. As conformações dos peptídeos similares nos complexos com diferentes β2m foram então comparadas. A estrutura do alinhamento do peptídeo mostrou que as conformações dos peptídeos HeV1 nesses dois complexos eram bastante semelhantes(Figura 3B). Além disso, as estruturas de gp33 (KAVYNFATM) apresentadas por H-2Db e complexas com β de mouse de2m (mβ2m) ou hβ2m foram alinhadas. O RMSD do α1α2 PBG de H-2Db foi de 0,283 e as conformações globais de peptídeos nessas duas estruturas também foram semelhantes (Figura 3C,3D). Esses dados indicam que a substituição βde 2m entre bβ2m e hβ2m, e mβ2m e hβ2m não afetam as conformações dos peptídeos apresentados.

O alinhamento da sequência mostrou que os aminoácidos de β2m de diferentes espécies são altamente conservados(Figura 4). Após análise do β2m de diferentes espécies mostrou que a maioria dos aminoácidos de β2m que formavam as ligações de hidrogênio com a cadeia H de MHC I foram conservados(Figura 4, Tabela 2). Enquanto isso, os diversos resíduos também eram aminoácidos com propriedades químicas semelhantes em mamíferos. No entanto, os principais resíduos envolvidos em β ligação de2m à cadeia H de MHC I apresentaram polimorfismos em galinhas, peixes e anfíbios(Figura 4).

Tabela 1: Os vários mamíferos combinam-se com β heterologosde 2m. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Interações de ligação de hidrogênio entre heterologos β cadeia de2m e pesada em MHC I de várias espécies. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figure 1
Figura 1: Purificação do solúvel e redobrado Ptal-N*01:01/HeV1 proteínas complexas e fotografias do cristal utilizado para análise de difração. O M é marcadores de peso molecular em kDa. O P1 são os agregados. O P2 é o complexo MHC. O complexo P3 é o β2m.(A) O complexo Ptal-N*01:01/HeV1 não foi formadosem a presença de β complexo H-2Kd de2m foi formado através de renaturação com hβ2m.(C) O complexo Ptal-N*01:01/HeV1 foi formado através da renaturação com bβ2m. O perfil é marcado com as posições aproximadas dos padrões de massa molecular de 75,0, 44,0 e 13,7 kDa. (D) O complexo ptal-n*01:01/ HeV1 foi formado através de renaturação com hβ2m. (E) O cristal é formado a partir do complexo Ptal-N*01:01/HeV1, que foi formado através de renaturação com bβ2m. A seta preta representa o cristal usado para coletar dados durante a difração de raios-X. (F) O cristal é formado a partir do complexo Ptal-N*01:01/HeV1 que foi formado através da renaturação com hβ2m. A seta preta representa o cristal usado para coletar dados durante a difração de raios-X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Ligação de hidrogênio entre βcadeia de 2m e cadeia pesada em complexos híbridos DE MHC I. Ligação de hidrogênio entre β cadeiade 2m e H em(A) Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 e (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC. As interações de ligação de hidrogênio são representadas por uma linha pontilhada preta. O quadrado representa a área ampliada e mostrada à direita nas caixas coloridas correspondentes. O vermelho representa que os homólogos β2m e os heteromanecos β2m usam os mesmos aminoácidos para formar ligações de hidrogênio com a cadeia H. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Conformação semelhante do complexo MHC e dos peptídeos antigênicos em complexos híbridos de MHC I. (A) A superposição dos domínios α1α2 de Ptal-N*01:01/bβ2m (verde) e Ptal-N*01:01/hβ2m (cinza). (B) A superposição do peptídeo HeV1 com a superposição do domínio α1α2 de cada molécula Ptal-N*01:01. HeV1 Peptídeo é representado como rosa em Ptal-N*01:01/bβ2m e como amarelo em Ptal-N*01:01/hβ2m. (C) A superposição dos domínios α1α2 de H-2Db /mouse β2m (mβ2m) (verde) e H-2Db /hβ2m (cinza). (D) A superposição do peptídeo gp33 com a superposição do domínio α1α2 de cada molécula H-2Db. Peptídeo gp33 é representado como azul em H-2Db /mβ2m e como rosa em H-2Db /hβ2m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Alinhamento de sequência de estrutura de hβ2m com β2m de outras espécies. As flechas negras denotam β fios. Os resíduos destacados em vermelho são completamente conservados, e os resíduos em caixas azuis são altamente (>80%) Conservada. Os triângulos amarelos representam os principais aminoácidos para a interação entre as cadeias β2m e H. O alinhamento de sequência foi gerado usando Clustal X32 e ESPript33. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A construção de um complexo proteico híbrido por meio de substituição heteróloga de diferentes taxas é uma estratégia comum para investigações funcionais e estruturais quando o complexo homólogo não está disponível, como no MHC I e seus ligantes. No entanto, há uma resumida limitada em relação à metodologia e à tecnologia. Aqui, foi analisada a estrutura do morcego MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizada por bβ2m ou hβ2m. Os principais aminoácidos de β ligação de2m ao Ptal-N*01:01 foram encontrados para serem conservados entre morcego e humano. Após análises mais aprofundadas, o resíduo-chave envolvido em β ligação de2m à cadeia H de MHC I foi encontrado conservado em mamíferos, mas polimorfos em galinhas, peixes e anfíbios. Esses dados indicam que a substituição heteróloga β2m é um meio viável para estudar o MHC I dos mamíferos. No entanto, a substituição entre mamíferos e aves, peixes ou anfíbios pode não ser viável.

Estudos estruturais desempenham papéis fundamentais na compreensão dos mecanismos moleculares de apresentação de peptídeos por moléculas de MHC I. A substituição heteróloga β2m é comumente utilizada em estudos estruturais MHC I14,16,17,18,26,27,28. Trabalhos anteriores mostraram que no MHC bovino I, N*01801, murine β2m e bovinos β2m se comportaram da mesma forma durante a vinculação aos domínios α1α2 da cadeia17N*01801 H . Aqui, foi analisada a estrutura de um único peptídeo apresentado pela mesma cadeia H de MHC I, mas diferente β2m. Esses dados mostram que as conformações do peptídeo são semelhantes quando estabilizadas por β2m de taxa cruzada, indicando que a substituição heteróloga β2m não afeta a apresentação de peptídeos.

Peptídeos de antígeno apresentados pelo MHC I são reconhecidos pelo TCR para mediar a ativação de células T29. Durante a infecção viral, a avaliação das respostas imunes de células T específicas do antígeno melhorará muito a compreensão das infecções virais e das respostas imunes do hospedeiro. O tetramer peptídeo-MHC é uma técnica importante para avaliar as respostas das células T; é uma técnica para tetramerizar a molécula monômera MHC, melhorar sua afinidade e combiná-la com múltiplos TCRS em células T. Tetramers são amplamente utilizados em pesquisa e diagnóstico clínico14,29,30. Recentemente, as células T (TCR-T) projetadas pela TCR tornaram-se um tema quente na imunoterapia tumoral por sua eficácia potencial no tratamento de tumores malignos31. A coloração do tetramer MHC I é um método crucial para a triagem de TCR específico ligado a peptídeos de antígeno relacionados ao câncer apresentados pelas moléculas DE MHC I29. Portanto, a preparação do tetramer MHC I desempenha um papel vital na triagem de TCR. Além da ligação da cadeia MHC I H, β2m também se liga ao CD8 na superfície da célula T, o que pode levar a manchas não específicas durante a triagem do TCR pela coloração do tetramer MHC I. A substituição heteróloga β2m pode diminuir essa ligação não específica do tetramer MHC I.

No entanto, existem algumas limitações para o protocolo. Em primeiro lugar, embora a E. coli continue sendo o hospedeiro de expressão dominante para proteínas recombinantes, muitas modificações pós-translacionais não podem ser realizadas e os produtos proteicos expressos formam corpos de inclusão insolúveis. Então, devido à substituição similar de alguns β não-mamíferosde 2m por mamíferos β2m, não se sabe se o βnão-mamíferos de 2m pode ser substituído por β heterologosde 2m para ajudar e estabilizar sua estrutura de MHC. No protocolo, incluímos uma descrição em nossas análises testadas usando o servidor NetMHCpan e Rosetta FlexPepDock. Infelizmente, nem as previsões produzidas coincidiram com os dados experimentais. Isso pode indicar que as previsões atuais de peptídeos de ligação do MHC não eram adequadas para mamíferos não humanos e não-camundongos, como morcegos, que podem ter uma maneira diferente de ligação de peptídeos. Portanto, precisamos combinar vários softwares de predição e resultados experimentais para análise abrangente para obter peptídeos de alta afinidade.

No protocolo descrito aqui, o passo chave é que o MHC pode ser renaturado corretamente. É muito importante obter um complexo de MHC com alta eficiência de revasamento. Por isso, é fundamental prestar atenção à seleção de peptídeos adequados e aumentar a pureza dos corpos de inclusão.

Em conclusão, aqui é resumido um protocolo para expressão MHC I, redobramento, cristalização, coleta de dados de cristal e determinação da estrutura. Além disso, analisou-se a viabilidade de β substituição heteróloga de2m no estudo MHC I. Este estudo fornece uma referência sólida para a compreensão do MHC I em estudos estruturais e funcionais. Além disso, esses dados também são significativos para avaliação das respostas das células T durante a doença infecciosa e a imunoterapia tumoral.

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Disclosures

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pelo fundo aberto do laboratório de biotecnologia farmacêutica da Universidade de Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (concede 81971501). William J. Liu é apoiado pelo Excelente Programa de Jovens Cientistas do NSFC (81822040) e pelo Plano de Ciência e Tecnologia de Pequim (Z181100006218080).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

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References

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Imunologia e Infecção Questão 169 Maior histocompatibilidade antígeno complexo (MHC) moléculas classe I β estrutura complexa de 2-microglobulina (β2m) peptídeo TCR tetramer
Estabilidade e Estrutura do Complexo de Histocompatibilidade Maior do Morcego Classe I com β Heterologous<sub>2</sub>-Microglobulina
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Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

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