Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61488
Automatic Translation
1, 2, 3
1College of Veterinary Medicine, Midwestern University, 2Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, 3Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

مقايسة الجسم الحي السابق المذكورة في هذه الدراسة باستخدام مستخلصات التجانس الأمعاء وتلطيخ المناعة الفلوريس يمثل طريقة جديدة لدراسة التشكل الواصل من المبيضات albicans في الجهاز الهضمي. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في الإشارات البيئية التي تنظم التحول المورفوجينيك في القناة الهضمية.

Abstract

المبيضات albicans الواصلة morphogenesi في الجهاز الهضمي (GI) يتم التحكم بإحكام من قبل مختلف الإشارات البيئية، ويلعب دورا هاما في نشر والعوامل المسببة للأمراض الفطرية الانتهازية. ومع ذلك، طرق لتصور هيفا الفطرية في الجهاز الهضمي في الجسم الحي هي التحدي الذي يحد من فهم الإشارات البيئية في السيطرة على عملية تكوين هذه المورفون. البروتوكول الموصوف هنا يوضح طريقة رواية ex vivo للتصور من المورفينجينيات الواصلة في مقتطفات متجانسة الأمعاء. باستخدام مقايسة الجسم الحي السابق ، توضح هذه الدراسة أن محتويات cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، ولكن ليس من فئران التحكم غير المعالجة ، تعزز تولد الواصلة C. alphcans في محتوى الأمعاء. وعلاوة على ذلك، إضافة مجموعات محددة من الأيض الأمعاء مرة أخرى إلى محتويات cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ينظم بشكل تفاضلي الفرتال morphogenesis السابقين. يمثل هذا البروتوكول، الذي يُؤخذ معًا، طريقة جديدة لتحديد الإشارات البيئية التي تتحكم في التشكل الواصلي C. albicans في الجهاز الهضمي والتحقيق فيها.

Introduction

المبيضات albicans هو الانتهازية ، متعدد الأشكال المسببة للأمراض الفطرية التي عادة ما تكون commensal ، ولكن يمكن أن تخضع لتغيير مورفولوجية في شكل خبيث قادر على التسبب في التهابات تهدد الحياة في الأفراد المناعة1،2،3،4،5،6،8،9،11،12،13. C. albicans هو السبب الرئيسي للعدوى الانسومية الجهازية، مع معدل وفيات 40\u201260٪ حتى مع العلاج المضاد للفطريات2،14،15. على الرغم من أن C. albicans يقيم في مختلف المنافذ المضيفة بما في ذلك الجهاز التناسلي الإناث16,17, تجويف الفم من الأفراد الأصحاء18 والجهاز الهضمي (GI) المسالك19,20, الغالبية العظمى من الالتهابات الجهازية تنشأ من الجهاز الهضمي وعلاوة على ذلك, وكثيرا ما أكد مصدر العدوى الجهازية أن الجهاز الهضمي21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34. C. تتأثر الإمراضية albicans في الجهاز الهضمي بمجموعة واسعة من العوامل; ومع ذلك ، فإن السمة الرئيسية الضرورية للوعاء هي الانتقال من مورفولوجيا خلية الخميرة إلى مورفولوجيا الخلايا الواصلة35،36،37،38،39،40،41،42،43،44. C. albicans التعلق والنشر من الجهاز الهضمي أثناء العدوى يرتبط بشدة مع قدرته على الانتقال من خميرة commensal إلى hyphae ضراوة، مما يسمح للفطريات أن تسبب الأمراض الغازية44،45،46،47،48،49،50،51،52،53.

مجموعة متنوعة من العوامل في الأمعاء، بما في ذلك ن أسيتيلغلوسكامين، تنظيم تشكيل الواصلة من قبل C. albicans . ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتضييق الفجوة في المعرفة فيما يتعلق بتشكل الغشاء الواصل لهذا الممرض الفطري في الجهاز الهضمي54،55،56. تشير الأدلة الحديثة إلى أن مختلف الأيضات الأمعاء السيطرة بشكل تفاضلي في morphogenesis الواصلة من C. albicans في المختبر57,58,59,60. ومع ذلك، تشكل القيود التقنية قضايا عند محاولة دراسة تكوّن الأمعاء في عينات الأمعاء الحية في العينات، خاصة تلطيخ الخميرة وخلايا الواصلة والتحليل الكمي لتطوير الواصلة. لفهم C. albicans الواصلة morphogenesis في الجهاز الهضمي، تم تطوير طريقة فيفو السابق باستخدام مقتطفات قابلة للذوبان من محتوى الأمعاء المتجانسة من الفئران لدراسة تأثير الأيض على تكوين الواصلات الفطرية. استخدام عينات الأمعاء من الفئران التي هي مقاومة وعرضة لعدوى ج. albicans GI، وهذه الطريقة سوف تساعد على تحديد ودراسة تأثير الأيض والمضادات الحيوية وxenobiotics على تكوين الحمى الفطرية في الجهاز الهضمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوان من قبل جامعة الغرب الأوسط لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدام (IACUC) كما هو موضح قبل57. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة الغرب الأوسط على هذه الدراسة بموجب بروتوكول MWU IACUC #2894. وتتبع سياسات رعاية الحيوانات في وزارة المياه والحيوانات سياسة خدمات الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية والسياسات المنصوص عليها في قانون رعاية الحيوان.

1. الفئران دراسة البروتوكول القياسي

  1. استخدام الفئران C57BL/6J الذكور والإناث على الأقل ستة أسابيع من العمر. تكملة لهم مع الماء المعقم مع أو بدون cefoperazone (0.5 ملغ / مل).
    1. شارك الفئران في مجموعات من 5 ، مع كل قفص يحتوي إما على جميع الفئران الذكور أو جميع الإناث. توفير الفئران الماوس القياسية تشاو والمياه (عن طريق زجاجة 400 مل) في جميع الأوقات.
    2. تحقق من الأقفاص يومياً لضمان أن تكون مستويات الطعام والماء كافية، وفحص الفئران بحثًا عن علامات الضيق.
  2. استبدال المياه مع cefoperazone كل 48 ح لضمان توفير المضادات الحيوية الطازجة بغض النظر عن المياه المتبقية في زجاجات التغذية القفص.
  3. بعد 5\u20127 أيام من العلاج cefoperazone، القتل الرحيم الفئران عن طريق CO2 الاختناق مراقبة بروتوكول IACUC المنشأة. تأكيد الموت عن طريق خلع عنق الرحم.
  4. تشريح الفئران باستخدام مقص حاد معقم الأوتوكلاف الحادة والملقط المعقم الأوتوكلاف.
    1. بعد القتل الرحيم ، قم بتأمين الحيوان على سطح تشريح عن طريق تثبيت جميع الأطراف بحيث يتعرض البطن.
    2. رش منطقة البطن مع الإيثانول 70٪ لمنع الفراء من الالتصاق بالملقط، مقص، أو أقسام الأمعاء أثناء تشريح.
    3. استخدام ملقط لقرصة ورفع قسم من الجلد في قاعدة البطن وخلق شق صغير من خلال الجلد واللفافة الكامنة باستخدام مقص. اتخاذ الحذر الشديد عند إجراء هذا الشق لتجنب ثقب الأعز أو جدار الأمعاء.
    4. تمديد هذا قطع إلى القفص الصدري، وفضح جزئيا تجويف البريتوني. جعل خفض بدءا من نقطة الشق الأولي على جانبي تمتد صعودا وشقيا.
    5. سحب هذه اللوحات بشكلٍ ثنائية، ودبوس على السطح المُشَرِّح لفضح التجويف البريتوني بشكل كامل.
  5. استخراج الجهاز الهضمي باستخدام ملقط، في حين استخدام مقص لجعل تخفيضات متفوقة على المعدة وفي منطقة القاصي من الأمعاء الغليظة لضمان جمع أكبر قدر من محتوى الأمعاء من كل قسم.
  6. عند إزالة الجهاز الهضمي، يجب الحرص على تجنب تمزق المكونات الفردية. فصل المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة والأمعاء الغليظة بشكل فردي باستخدام مقص في نهاياتها القريبة وفص.
  7. لجمع كل محتويات الأمعاء من كل قسم، وجعل شق واحد في نهاية بعيدة من كل قسم باستخدام مقص، تليها يدويا طرد محتوى القناة الهضمية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام ملقط.
  8. تخزين محتويات القناة الهضمية في -80 درجة مئوية لجراسيس الجسم الحي السابق.

2. إعداد الخميرة استخراج بيبتون ديكستروز (YPD) لوحات أجار

  1. إلى زجاجة 1 لتر إضافة 25 غرام من الخميرة استخراج بيبتون ديكستروز مرق مسحوق, 10 غرام من أجار, والمياه فائقة الخطورة إلى حجم النهائي من 500 مل.
  2. أوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على دورة سائلة لتعقيم الوسائط.
  3. تحت غطاء تدفق لارينار، صب ما يقرب من 20 مل من وسائل الإعلام أجار في لوحة بيتري العقيمة. 500 مل من وسائل الإعلام أجار ينبغي أن تسفر عن لوحات 25 تقريبا.
  4. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.

3. السابقين فيفو الإعدادية لم مقايسة الغشاء الواصل

  1. 11 ثقافة جديدة من C. albicans SC5314 على لوحة YPD أجار واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
  2. اختيار اثنين إلى ثلاثة مستعمرات الفردية المتوسطة الحجم من بين عشية وضحاها نمت C. albicans SC5314 الثقافة وإعادة تعليق في 1 مل من الفوسفات المالحة المخزنة (PBS).
  3. استرداد محتويات الأمعاء المجمدة من -80 درجة مئوية والفريزر وذوبان في 25 درجة مئوية.
  4. تزن حوالي 150 ملغ من محتويات الأمعاء في أنبوب جديد 1.5 مل.
  5. إعادة تعليق محتويات القناة الهضمية مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (محتوى القناة الهضمية وبرنامج تلفزيوني في 1:1 الوزن إلى نسبة حجم).
  6. دوامة بسرعة عالية لمدة 30 s لتجانس محتويات الأمعاء والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة تقريبا.
  7. الطرد المركزي المتجانس في 1000 س ز لمدة 3 دقائق.
  8. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
  9. كرر الخطوتين 3.7 و3.8 لإزالة كل الحطام في المُنَاط.
  10. إضافة 10 μL من C. albicans SC5314 inoculum أعدت أعلاه لهذا مكبر
  11. تخلط جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 4 إلى 5 ساعات.

4. إضافة خارجية من المستقلبات إلى مستخلصات الأمعاء المتجانسة لم مقايسة المورفينية الواصلية

  1. استرداد محتويات الأمعاء المجمدة من -80 درجة مئوية والفريزر وإعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني بنسبة 1:1 (الوزن: حجم).
  2. إضافة التركيز المطلوب من الأيض الأمعاء لمحتوى الأمعاء وخليط برنامج تلفزيوني.
  3. دوامة بسرعة عالية لمدة 30 s لتجانس محتويات الأمعاء التي تحتوي على الأيض والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. الطرد المركزي المتجانس في 1000 س ز لمدة 3 دقائق.
  5. نقل فائقة إلى أنبوب جديد 1.5 مل. كرر الخطوتين 4.4 و 4.5 لإزالة كل الحطام في المُنَاط.
  6. إضافة 10 ميكرولتر من C. albicans SC5314 inoculum أعدت أعلاه لهذا مكبر. تخلط جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 4 إلى 5 ساعات.

5. C. albicans morphogenesis فحص (مناعة والتصوير)

  1. الطرد المركزي العينات في 1000 س ز لمدة 2 دقيقة والتخلص من افرط عن طريق الأنابيب.
  2. إصلاح العينات في 100 ميكرولتر من 2٪ شبهفورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة.
  3. جهاز طرد مركزي في 1000 × ز لمدة 2 دقيقة والتخلص من افرا عن طريق الأنابيب.
  4. غسل العينات مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. لغسل العينات، إعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب بلطف. لا دوامة العينة لأن هذا يمكن أن تلحق الضرر هياكل الواصلة. بعد إعادة التعليق، الطرد المركزي في 1000 س ز لمدة 2 دقيقة والتخلص من افرط عن طريق الأنابيب.
  5. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على الأجسام المضادة متعددة النسيلة C. albicans (1:100 تخفيف) لمدة 30 دقيقة.
  6. غسل العينات ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: عند استخدام جسم مضاد فلوري، يوصى بأن يتم تنفيذ جميع خطوات التخفيف والغسيل في ضوء خافت لتجنب تبييض الصور وتحسين طول العمر العينة.
  7. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على المضادة للأرانب IgG Alexafluor 488 في 1:500 تخفيف. قم بإجراء حضانة في درج أو غرفة مظلمة لتجنب تبييض الصور.
  8. غسل العينات ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  9. إعادة تعليق العينات في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى لوحة 96-جيدا للتصوير.
    ملاحظة: عندما لا يتم تصويرها، فمن المستحسن أن لوحة 96-جيدا أن تكون ملفوفة في رقائق الألومنيوم لتجنب تبييض الصورة.
  10. الخلايا الفطرية الصورة باستخدام العدسات 20x و 40x الهدف باستخدام مجهر التصوير الفلوري. استخدم فلتر البروتين الفلورسنت الأخضر (الطول الموجي للإثارة 470/40 والطول الموجي للانبعاثات 525/50) للكشف عن الفلوريسنس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذه النتائج جنبا إلى جنب مع النتائج السابقة من مختبر ثانغاماني60 تشير إلى أنه عندما يتم زراعة C. albicans السابقين في مستخلصات تجانس الأمعاء مأخوذة من المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة من السيطرة غير المعالجة والفئران المعالجة بالمضادات الحيوية، C. albicans يتطور عموما مع مورفولوجيا الخميرة(الشكل 1B). ومع ذلك، عندما تزرع في مستخلص cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية، C. albicans يخضع بسهولة morphogenesis، مما أدى إلى عينات تحتوي على الخميرة وأشكال hyphae (الشكل 1B); لا يحدث هذا في أجهزة الماوس التحكم. وهذا يدعم النتائج السابقة، والتي أظهرت زيادة كبيرة في أشكال hyphae في العينات التي تزرع في مستخلصات cecal المعالجة بالمضادات الحيوية، ولكن ليس في أي مستخلصات الأمعاء الأخرى المعالجة بالمضادات الحيوية60. وتشير هذه النتائج إلى أن العلاج بالمضادات الحيوية يسبب تغييرات في بيئة cecal، مما يؤدي إلى تكوين الغشاء الواصلي من C. albicans. بالإضافة إلى ذلك، فإن التعريب المحدد لهذا النمط الظاهري الذي لوحظ فقط في ال cecum يشير أيضًا إلى أن هذه الظروف المعززة للهيبا قد لا تكون موجودة بالضرورة في جميع أنحاء الجهاز الهضمي، ولكن بدلاً من ذلك تقتصر على أجزاء محددة من الجهاز الهضمي اعتمادًا على توافر العناصر الغذائية، المستقلبات والجزيئات الأخرى غير المعروفة.

منذ استخراج cecal الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية يعزز morphogenesis من C. albicans57,58,59,60, درسنا ما إذا كانت إضافة خارجية لمجموعة مختارة من الأيض الأمعاء (التي تم تحديدها من الدراسات المختبرية السابقة) إلى محتوى cecal من الفئران cef المعالجة سوف تؤثر على تشكيل مورف من C. albicans ex vivo. وقد تميزت الأعمال السابقة التي قام بها مختبر ثانغاماني ملف تعريف الأيض من التجانس محتوى cecal المستخرجة من الفئران غير المعالجة والمضادات الحيوية، وكشف عن تغييرات كبيرة في وفرة من الأيض المختلفة نتيجة للعلاج بالمضادات الحيوية - على وجه التحديد، وانخفاض وفرة من الأحماض الصفراوية الثانوية وزيادة وفرة الكربوهيدرات60. وعلاوة على ذلك، حددت هذه الدراسة أن الأحماض الصفراوية الثانوية والأحماض الكربوكسيلية تمنع التنمية hyphae، في حين أن الكربوهيدرات بما في ذلك الجلوكوز، وتعزيز morphogenesi الواصلة من C. albicans في المختبر60. وتشير النتائج إلى أن إضافة إلى الوراء مجموعة من المستقلبات الأمعاء المثبطة التي تحتوي على حمض ديوكسيكوليك (DCA, 0.5 ملغ / مل), حمض ليثوخوليك (LCA, 0.1 ملغم /مليلتر), حمض البالمتيك (0.1 ملغ / مل), p-حمض السلال (0.1 ملغ / مل), حمض السيباسيك (0.5 ملغ / مل), 2 حمض الميثيلbutyric (0.5 ملغ / مل) ، وحمض اللاكتيك (5 ملغ / مل) إلى التجانس cecal من الفئران cef المعالجة تماما منعت الواصلة morphogenesis السابقين. من ناحية أخرى، إضافة خارجية من الجلوكوز (1 ملغ / مل) إلى التجانس cecal من الفئران cef المعالجة أظهرت تطوير الواصلة الضخمة ex vivo (الشكل 2B). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن إضافة المستقلبات الأمعاء مرة أخرى إلى تجانس cecal من الفئران المعالجة cef ينظم بشكل تفاضلي morphogenesis من C. albicans ، وبالتالي تأكيد النتائج السابقة في المختبر. وتشير هذه النتائج إلى أن الأيضات الأمعاء تلعب دورا حاسما في التشكل الواصلي من C. albicans وفهم الأهداف الجينية وإشارات مسارات التضمين من قبل هذه الأيضات سوف تساعد في تطوير نهج علاجية جديدة لمنع وعلاج العدوى C. albicans.

Figure 1
الشكل 1: مقايسة الجسم الحي السابق لتحديد تأثير علاج cefoperazone على C. albicans الظهارة الواصلة مورفوجينسيس في محتويات الأمعاء. (A) مخطط بروتوكول التخطيطي. (ب)تم أخذ محتويات الأمعاء المعالجة بالمضادات الحيوية (الألواح العلوية) وغير المعالجة (الألواح السفلية) من المعدة والأمعاء الدقيقة وال cecums والأمعاء الغليظة للفئران C57BL/6J. تم احتضان محتويات الأمعاء الملقّح مع C. albicans SC5314 عند 37 درجة مئوية مقابل 4\u20125 ساعة وملطخة بالأجسام المضادة C. albicans. تم تصوير الخلايا في التكبير 40x. تظهر الصور التمثيلية هنا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إضافة خارجية من المستقلبات الأمعاء لمحتويات cecal من الفئران المعالجة cef على تشكيل هيفاي من C. albicans السابقين فيفو. (A) مخطط بروتوكول التخطيطي. (ب) بركة مستقلبات الأمعاء المثبطة التي تحتوي على DCA (0.5 ملغ /مل), LCA (0.1 ملغ /مليلتر), حمض البالميتيك (0.1 ملغ/مل), p-tolylace acid (0.1 ملغ/مل), حمض sebacic (0.5 ملغ/مل); 2-حمض الميثيلbutyric (0.5 ملغ / مل), وحمض اللاكتيك (5 ملغ / مل) أو الجلوكوز (1 ملغ / مل) وأضيفت مرة أخرى إلى محتوى cecal من الفئران cef المعالجة, مختلطة جيدا ومحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتنفيذ اختبار الهينة الكفو ex. محتويات Cecal تلقيح مع C. albicans SC5314 كانت محتضنة في 37 درجة مئوية ل 4\u20125 ح وملطخة مع الأجسام المضادة albicans C. تم تصوير الخلايا في التكبير 40x. تظهر الصور التمثيلية هنا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا تقدم طريقة جديدة للتحقيق في تأثير المضادات الحيوية، والآثار الغذائية، وxenobiotic والعلاجية على C. albicans الهضاب المورفيجن في الجهاز الهضمي. منذ غالبية الالتهابات الجهازية تنشأ من الجهاز الهضمي21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34 ، تشكيل hyphae هو عامل الفوعة الحرجة التي تعزز نشر C. albicans من الجهاز الهضمي ، وفهم العوامل التي تتحكم في هذا morphogenesis في الجهاز الهضمي توسيع المعرفة حول آليات التسبب في الأمراض وتحديد خيارات العلاج جديدة.

10 - وفي حين أن الطريقة المعروضة هنا واضحة نسبيا، فإن بعض الخطوات التي نوقشت أدناه قد حددت بوصفها خطوات حاسمة وهامة. '1' ينبغي أن يكون الإبوكولوم الأولي للفوسفات الـ C. albicans الأمثل للسماح بنمو الفطريات وتشكلها الواصلة. مع محدودية توافر المواد الغذائية في مستخلصات الأمعاء المتجانسة، قد يقلل حجم أكبر من الإنوكولوم بشكل كبير من النمو الفطري وعملية تكوين المورفين. ومع ذلك، فإن نمو العزلات السريرية المختلفة والسلالات من المرجح أن تكون متغيرة، وبالتالي تحسين وقت الحضانة وحضانة معينة C. albicans عزل أمر ضروري. '2' تبين أن خطوات الطرد المركزي المتعددة عند إعداد مستخلصات الأمعاء المتجانسة هي خطوات حاسمة لإزالة الحطام الموجود في محتويات الأمعاء قدر الإمكان. '3' نظراً للسرعة المنخفضة نسبياً للطرد المركزي (لتجنب تلف الهياكل الواصلة)، يجب توخي الحذر لتجنب فقدان الخلايا أثناء خطوات الاحتواء المناعي في هذا البروتوكول.

وقد استخدمت أساليب بديلة لتصور هيفا الفطرية في الجهاز الهضمي في الماضي، مع بعض المزايا والقيود المرتبطة بكل طريقة. وقد أظهرت مؤخرا طريقة واحدة بارزة نسبيا باستخدام التهجين الفلورسنت في الموقع (FISH) لتصور hyphae الفطرية في الجهاز الهضمي من قبل Witchleyوآخرون. 61،62. هذا هو واعد في طريقة vivo المتاحة حاليا للكشف عن hyphae C. albicans مباشرة في الجهاز الهضمي، ولكن تعقيد هذا البروتوكول يجعل من الصعب تكييفها مع دراسات الفحص الأولية السريعة واسعة النطاق. كما استخدمت أساليب علم الأنسجة التقليدية في الماضي لإضفاء الحيوية على الخميرة وhyphae C. albicans أشكال في الجهاز الهضمي. ومع ذلك ، فإن الملاحظة والتصوير للخلايا الفطرية مع علم الأنسجة الهستوولوجي الأساسي ، و البقع الهماتوسيلين و Eosin (H / E) لا تزال صعبة ، حيث أن العديد من طرق التثبيت القياسية لديها القدرة على تعطيل الطبقة المخاطية لعينات المسالك الهضمية ، وغالبا ما تضر بهياكل الواصل في العملية وتؤدي إلى تقارير متناقضة حول الوفرة النسبية لتحول الخلايا الواصلة خلال العدوى63،64،65،66. وقد تم تطوير هذه الطريقة لتجنب تلف الهين أثناء المعالجة لمعالجة هذه المسألة. بالإضافة إلى ذلك، وقد استخدمت explants الأنسجة كوسيلة لدراسة الظروف البيولوجية السابق vivo، ولكن هذه الأساليب عموماً مركزة ومفيدة لدراسة الالتزام أو الغزو المحتملة من C. albicans67، ولكن أيضا أنها تستبعد عموماً غالبية مكونات المستقلبومي والميكروبيوم التي تساهم في التسبب في أمراض الجسم الحي. على الرغم من أن البروتوكول السابق vivo الموصوف هنا لا يحاكي تماما في بيئة GI الجسم الحي كما هو موضح سابقا61،62، فإنه يوفر أقرب الظروف الممكنة التي يواجهها C. albicans في بيئة الأمعاء بالمقارنة مع الأساليب في المختبر باستخدام ظروف النمو الاصطناعي.

يمكن استخدام هذا البروتوكول للفحص الأساسي لتحديد تأثير الإشارات البيئية في الجهاز الهضمي على الفروغينات الضمانية C. alphcans. هذه الطريقة تسمح لمجموعات كبيرة من المركبات بما في ذلك مثبطات جزيء صغير، مضادة الميكيكوtic الجديدة، و المستقلبات ليتم فحصها بسرعة لتطوير الواصلة، ويمكن استخدامها في فحص العلاجات العلاجية أو تحديد عوامل الخطر للأمراض الجهازية. منذ C. albicans استعمار في جميع أنحاء الجهاز الهضمي، وهذا البروتوكول سوف تساعد في تحديد الإشارات البيئية الموجودة في أجزاء محددة من الجهاز الهضمي التي تتحكم في الحمى الواصلة مورفوجينسيس في الأفراد الذين يتناولون المضادات الحيوية، وكلاء العلاج الكيميائي، وفي المرضى الذين يعانون من اضطرابات التمثيل الغذائي بما في ذلك داء السكري. في نهاية المطاف الأسلوب الموصوف هنا يسمح للتوصيف السريع لmorphogenesi الواصلة في C. albicans على مجموعة واسعة من العوامل البيئية بطريقة أكثر أهمية بيولوجيا من الطرق الحالية في المختبر وأسرع بكثير وأكثر كفاءة في الموارد من الحالية في أساليب الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يملك أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو تضارباً آخر في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب الاعتراف الموارد والدعم من جامعة الغرب الأوسط الخلوية والجزيئية مرفق البحوث الأساسية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 - 10 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-454 Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-400 Misc
20 - 200 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-451 Misc
2-methylbutyric acid Sigma 193070-25G hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG Invitrogen (Fisher) A11008 IF Staining secondary ab
Agar Fisher BP1423-500 YPD agar component
Automated Imaging Microscope Keyence BZX700
Candida Albicans Antibody Invitrogen (Fisher) PA1-27158 IF Staining primary ab
cefoperazone Cayman 16113 antibiotic
deoxycholic acid Sigma 30960 hyphal-inhibitory compound
D-Glucose Fisher D16-500 hyphal-promoting compound
forceps Fisher 08-885
lactic acid Alfa Aesar AAAL13242-06 hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid Sigma L6250-10G hyphal-inhibitory compound
palmitic acid Sigma P5585-10G hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313 IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x Alfa Aesar J62692 PBS component
p-tolylacetic acid SCBT sc-257959 hyphal-inhibitory compound
sebacic acid Sigma 283258-250G hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors Fisher 28301
sterile Milli-Q water N/A N/A Misc
YPD Broth BD Biosciences 242810 YPD agar component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huffnagle, G. B., Noverr, M. C. The emerging world of the fungal microbiome. Trends in Microbiology. 21 (7), 334-341 (2013).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Hajjeh, R. A., et al. Incidence of Bloodstream Infections Due to Candida Species and In Vitro Susceptibilities of Isolates Collected from 1998 to 2000 in a Population-based Active Surveillance Program. Journal of Clinical Microbiology. 42 (4), 1519-1527 (2004).
  4. Lockhart, S. R., et al. Species Identification and Antifungal Susceptibility Testing of Candida Bloodstream Isolates from Population-Based Surveillance Studies in Two U.S. Cities from 2008 to 2011. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3435-3442 (2012).
  5. Pfaller, M., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance(R)) registry, 2004-2008. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 74 (4), 323-331 (2012).
  6. Angarone, M. Fungal infections in cancer patients. Cancer Treatment and Research. 161, 129-155 (2014).
  7. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  8. Calton, E. A., et al. Invasive bacterial and fungal infections in paediatric patients with cancer: incidence, risk factors, aetiology and outcomes in a UK regional cohort 2009-2011. Pediatric Blood & Cancer. 61 (7), 1239-1245 (2014).
  9. Carter, J. H., et al. Medical management of invasive fungal infections of the central nervous system in pediatric cancer patients. Pediatric Blood & Cancer. 62 (6), 1095-1098 (2015).
  10. Low, C. Y., Rotstein, C. Emerging fungal infections in immunocompromised patients. F1000 Medicine Reports. 3, 14 (2011).
  11. Mousset, S., et al. Treatment of invasive fungal infections in cancer patients-updated recommendations of the Infectious Diseases Working Party (AGIHO) of the German Society of Hematology and Oncology (DGHO). Annals of Hematology. 93 (1), 13-32 (2014).
  12. Perfect, J. R., Hachem, R., Wingard, J. R. Update on epidemiology of and preventive strategies for invasive fungal infections in cancer patients. Clinical Infectious Diseases. 59, Suppl 5 352-355 (2014).
  13. Sipsas, N. V., Kontoyiannis, D. P. Invasive fungal infections in patients with cancer in the Intensive Care Unit. International Journal of Antimicrobial Agents. 39 (6), 464-471 (2012).
  14. Falagas, M. E., Apostolou, K. E., Pappas, V. D. Attributable mortality of candidemia: a systematic review of matched cohort and case-control studies. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 25 (7), 419-425 (2006).
  15. Chi, H. W., et al. Candida albicans versus non-albicans bloodstream infections: the comparison of risk factors and outcome. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (5), 369-375 (2011).
  16. Drell, T., et al. Characterization of the vaginal micro- and mycobiome in asymptomatic reproductive-age Estonian women. PLoS One. 8 (1), 54379 (2013).
  17. Merenstein, D., et al. Colonization by Candida species of the oral and vaginal mucosa in HIV-infected and noninfected women. AIDS Research and Human Retroviruses. 29 (1), 30-34 (2013).
  18. Ghannoum, M. A., et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy individuals. PLoS Pathogens. 6 (1), 1000713 (2010).
  19. Hoffmann, C., et al. Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents. PLoS One. 8 (6), 66019 (2013).
  20. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nature Reviews Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  21. Samonis, G., et al. Prospective evaluation of effects of broad-spectrum antibiotics on gastrointestinal yeast colonization of humans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 37 (1), 51-53 (1993).
  22. Sahni, V., et al. Candidemia--an under-recognized nosocomial infection in Indian hospitals. The Journal of the Association of Physicians of India. 53, 607-611 (2005).
  23. Meijer-Severs, G. J., Joshi, J. H. The effect of new broad-spectrum antibiotics on faecal flora of cancer patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 24 (4), 605-613 (1989).
  24. Kennedy, M. J., Volz, P. A., Edwards, C. A., Yancey, R. J. Mechanisms of association of Candida albicans with intestinal mucosa. Journal of Medical Microbiology. 24 (4), 333-341 (1987).
  25. Miranda, L. N., et al. Candida colonisation as a source for candidaemia. Journal of Hospital Infections. 72 (1), 9-16 (2009).
  26. Nucci, M., Anaissie, E. Revisiting the source of candidemia: skin or gut. Clinical Infectious Diseases. 33 (12), 1959-1967 (2001).
  27. Raponi, G., Visconti, V., Brunetti, G., Ghezzi, M. C. Clostridium difficile infection and Candida colonization of the gut: is there a correlation. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 1648-1649 (2014).
  28. Guastalegname, M., Russo, A., Falcone, M., Giuliano, S., Venditti, M. Candidemia subsequent to severe infection due to Clostridium difficile: is there a link. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 772-774 (2013).
  29. Nerandzic, M. M., Mullane, K., Miller, M. A., Babakhani, F., Donskey, C. J. Reduced acquisition and overgrowth of vancomycin-resistant enterococci and Candida species in patients treated with fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. Clinical Infectious Diseases. 55, Suppl 2 121-126 (2012).
  30. Krause, R., Krejs, G. J., Wenisch, C., Reisinger, E. C. Elevated fecal Candida counts in patients with antibiotic-associated diarrhea: role of soluble fecal substances. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 167-168 (2003).
  31. Krause, R., et al. Role of Candida in antibiotic-associated diarrhea. The Journal of Infectious Diseases. 184 (8), 1065-1069 (2001).
  32. Zuo, T., et al. Gut fungal dysbiosis correlates with reduced efficacy of fecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection. Nature Communications. 9 (1), 3663 (2018).
  33. Delaloye, J., Calandra, T. Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient. Virulence. 5 (1), 161-169 (2014).
  34. Cole, G. T., Halawa, A. A., Anaissie, E. J. The role of the gastrointestinal tract in hematogenous candidiasis: from the laboratory to the bedside. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 73-88 (1996).
  35. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  36. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  37. Bendel, C. M., et al. Systemic infection following intravenous inoculation of mice with Candida albicans int1 mutant strains. Molecular genetics and metabolism. 67 (4), 343-351 (1999).
  38. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial agents and chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  39. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 599-604 (2009).
  40. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  41. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature genetics. 45 (9), 1088 (2013).
  42. Bar-Yosef, H., Gonzalez, N. V., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific reports. 7 (1), 5692 (2017).
  43. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans hypha-inducing transcription factor Ume6 by the CDK1 cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), 00248 (2017).
  44. Vila, T., et al. Targeting Candida albicans filamentation for antifungal drug development. Virulence. 8 (2), 150-158 (2017).
  45. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
  46. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  47. Bar-Yosef, H., Vivanco Gonzalez, N., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific Reports. 7 (1), 5692 (2017).
  48. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 599-604 (2009).
  49. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans Hypha-Inducing Transcription Factor Ume6 by the CDK1 Cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), (2017).
  50. Bendel, C. M., et al. Effects of Alteration of the Candida albicans Gene INT1 on Cecal Colonization in Orally Innoculated Mice. Pediatric Research. 45, 156 (1999).
  51. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  52. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  53. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  54. Naseem, S., Gunasekera, A., Araya, E., Konopka, J. B. N-acetylglucosamine (GlcNAc) induction of hyphal morphogenesis and transcriptional responses in Candida albicans are not dependent on its metabolism. Journal of Biological Chemistry. 286 (33), 28671-28680 (2011).
  55. Piispanen, A. E., Hogan, D. A. PEPped up: induction of Candida albicans virulence by bacterial cell wall fragments. Cell Host & Microbe. 4 (1), 1-2 (2008).
  56. Xu, X. L., et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host & Microbe. 4 (1), 28-39 (2008).
  57. Guinan, J., Thangamani, S. Antibiotic-induced alterations in taurocholic acid levels promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. FEMS microbiology letters. 365 (18), (2018).
  58. Guinan, J., Villa, P., Thangamani, S. Secondary bile acids inhibit Candida albicans growth and morphogenesis. Pathogens and disease. 76 (3), (2018).
  59. Guinan, J., Wang, S., Hazbun, T. R., Yadav, H., Thangamani, S. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids correlate with increased gastrointestinal colonization of Candida albicans. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  60. Gutierrez, D., et al. Antibiotic-induced gut metabolome and microbiome alterations increase the susceptibility to Candida albicans colonization in the gastrointestinal tract. FEMS microbiology ecology. 96 (1), 187 (2020).
  61. Witchley, J. N., et al. Candida albicans morphogenesis programs control the balance between gut commensalism and invasive infection. Cell Host & Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
  62. Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (153), e60283 (2019).
  63. Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Mucins. , Springer. 229-235 (2012).
  64. Lossinsky, A. S., et al. The histopathology of Candida albicans invasion in neonatal rat tissues and in the human blood-brain barrier in culture revealed by light, scanning, transmission and immunoelectron microscopy scanning. Histology and histopathology. , (2006).
  65. Rosenbach, A., Dignard, D., Pierce, J. V., Whiteway, M., Kumamoto, C. A. Adaptations of Candida albicans for growth in the mammalian intestinal tract. Eukaryotic Cell. 9, 1075-1086 (2010).
  66. Vautier, S., et al. C andida albicans colonization and dissemination from the murine gastrointestinal tract: the influence of morphology and T h17 immunity. Cellular Microbiology. 17, 445-450 (2015).
  67. Lyman, C., Navarro, E., Garrett, K., Roberts, D., Pizzo, P., Walsh, T. Adherence of Candida albicans to bladder mucosa: development and application of a tissue explant assay. Mycoses. 42, 255-259 (1999).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 161، المبيضات ألبيكانس، الفرتال مورفوجينسيس، مقايسة الجسم الحي السابق، الجلوكوز، الأحماض الصفراوية الثانوية، والجهاز الهضمي
مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة <em>المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة</em> الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monasky, R., Villa, S., Thangamani,… More

Monasky, R., Villa, S., Thangamani, S. An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract. J. Vis. Exp. (161), e61488, doi:10.3791/61488 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter