Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En Ex vivo-analys att studera Candida albicans Hyphal Morphogenesis i mag-tarmkanalen

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61488
Automatic Translation
1, 2, 3
1College of Veterinary Medicine, Midwestern University, 2Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, 3Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

Ex vivo assay beskrivs i denna studie med gut homogenate extrakt och immunofluorescens färgning representerar en ny metod för att undersöka hyphal morphogenesis av Candida albicans i mag-tarmkanalen. Denna metod kan utnyttjas för att undersöka de miljösignaler som reglerar morfogogenetiska övergången i tarmen.

Abstract

Candida albicans hyfalan morfogenes i mag (GI) tarmkanalen är hårt styrs av olika miljösignaler, och spelar en viktig roll i spridning och patogenesen vid denna opportunistiska svamp patogen. Men metoder för att visualisera svamp hyfera i mag-tarmkanalen in vivo är utmanande som begränsar förståelsen av miljösignaler i att kontrollera denna morfogensprocess. Protokollet som beskrivs här visar en ny ex vivo metod för visualisering av hyphal morphogenesis i gut homogenate extrakt. Med hjälp av en ex vivo analys, denna studie visar att cecal innehåll från antibiotika behandlade möss, men inte från obehandlade kontroll möss, främja C. albicans hyphal morphogenesis i tarmen innehåll. Vidare, lägga tillbaka specifika grupper av gut metaboliter till cecal innehållet från antibiotika-behandlade möss differentially reglerar hyphal morphogenesis ex vivo. Sammantaget representerar detta protokoll en ny metod för att identifiera och undersöka de miljösignaler som styr C. albicans hyfalans morfogenes i mag-tarmkanalen.

Introduction

Candida albicans är en opportunistisk, polymorfa svamp patogen som normalt commensal, men kan genomgå en morfologisk förändring till en virulent form som kan orsaka livshotande infektioner hos immunkomprometteradeindivider 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans är en ledande orsak till systemiska nosokomala infektioner, med en 40\u201260% dödlighet även med svampdödande behandling2,14,15. Även C. albicans är bosatt i olika värd nischer inklusive den kvinnliga reproduktiva systemet16,17, munhålan av friska individer18 och mag -tarmkanalen (GI) tarmkanalen19,20, majoriteten av de systemiska infektioner härstammar från mag-tarmkanalen och vidare, källan till systemisk infektion bekräftas ofta vara mag-tarmkanalen21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. albicans patogenicitet i mag-tarmkanalen påverkas av ett brett spektrum av faktorer; emellertid, en ha som huvudämnekännetecken som är nödvändig för virulens, är övergången från en jästcellmorfologi in i en virulent hyphalcellmorfologi35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans fastsättning och spridning från mag-tarmkanalen under infektion är starkt förknippad med sin kapacitet att övergången från en commensal jäst i virulent hyfa, vilket gör att svamparna att orsaka invasiv sjukdom44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.

En mängd olika faktorer i tarmen, inklusive n-acetylglucosamin, reglera hyphal formation av C. albicans. Därför är det avgörande att minska klyftan i kunskap när det gäller hyfalans morphogenesis av denna svamp patogen imag-tarmkanalen 54,55,56. Nya bevis tyder på att olika gut metaboliter differentially kontrollera hyphal morfogens av C. albicans in vitro57,58,59,60. Dock, tekniska begränsningar presentera frågor när man försöker studera C. albicans hyferbildning i in vivo gut prover, särskilt färgning jäst och hyphae celler och kvantitativ analys av hyphal utveckling. För att förstå C. albicans hyfalans morfogenes i mag-tarmkanalen, en ex vivo metod utvecklades med hjälp av lösliga extrakt av homogeniserade gut innehåll från möss att studera effekten av metaboliter på svamp hyphal morphogenesis. Utnyttja gut prover från möss som är resistenta och mottagliga för C. albicans GI infektion, denna metod kommer att bidra till att identifiera och studera effekten av metaboliter, antibiotika och xenobiotika på svamp hyfalan morfogenes i GI-tarmkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla animaliska protokoll godkändes av Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) enligt beskrivningen före57. Den institutionella Animal Care and Use kommittén vid Midwestern University godkänt denna studie enligt MWU IACUC Protocol #2894. MWU:s djurvårdspolitik följer Folkhälsovårds (PHS) policy för human vård och användning av försöksdjur och den politik som fastställs i djurskyddslagen (AWA).

1. Möss studera standardprotokoll

  1. Använd han- och honmöss C57BL/6J minst sex veckor gamla. Komplettera dem med sterilt vatten med eller utan cefoperazon (0,5 mg/mL).
    1. Co-house möss i grupper om 5, med varje bur som innehåller antingen alla manliga eller alla kvinnliga möss. Förse mössen standard mus chow och vatten (via en 400 mL flaska) hela tiden.
    2. Kontrollera burar dagligen för att säkerställa mat och vattennivåer är tillräckligt, och att undersöka möss för tecken på nöd.
  2. Ersätt vattnet med cefoperazone var 48 h för att säkerställa att färskt antibiotikum tillhandahålls oavsett kvarvarande vatten i buren utfodring flaskor.
  3. Efter 5\u20127 dagar av cefoperazonbehandling, avliva möss via CO2 kvävning observera etablerade IACUC protokoll. Bekräfta dödsfall via livmoderhalscancer förskjutning.
  4. Dissekera möss med hjälp av autoklav-steriliserade skarpa slutade sax och autoklav-steriliserade tlyktor.
    1. Efter dödshjälp, säkra djuret till en dissektion yta genom att fästa alla lemmar så att buken är utsatt.
    2. Spraya bukregionen med 70% etanol för att förhindra päls från att hålla sig till tlysen, saxar, eller tarmsektioner under dissekering.
    3. Använd tärna för att nypa och lyfta en del av huden vid basen av buken och skapa ett litet snitt genom huden och underliggande fascia med hjälp av sax. Var mycket försiktig när du gör detta snitt för att undvika punktering av cecum eller tarmväggen.
    4. Utvidga denna skärning till bröstkorgen, delvis utsätta peritoneal hålighet. Gör en klippa börjar vid punkten för den inledande snitt på vardera sidan sträcker sig uppåt och sidled.
    5. Dra dessa klaffar i lateralt och stift till dissekering ytan för att helt exponera peritoneal hålighet.
  5. Extrahera MAG-tarmkanalen med hjälp av tärnor, medan du använder sax för att göra nedskärningar överlägsen magen och vid den distala regionen i tjocktarmen för att säkerställa insamling av den största mängden tarminnehåll från varje avsnitt.
  6. När du tar bort mag-tarmkanalen, var noga med att undvika rupturing de enskilda komponenterna. Separera magen, tunntarmen, cecum, och tjocktarmen individuellt med hjälp av sax vid deras proximala och distala ändar.
  7. För insamling av varje tarminnehåll från varje avsnitt, gör ett enda snitt i den distala änden av varje avsnitt med hjälp av sax, följt av att manuellt utvisa tarminnehållet i ett 1,5 mL mikrocentrifugrör med hjälp av kraftklystor.
  8. Lagra tarminnehåll vid -80 °C för ex vivo-analyser.

2. Beredning av jästextrakt-pepton-dextros (YPD) agarplattor

  1. Till en 1 L glasflaska tillsätt 25 g jästextrakt pepton-dextros buljong pulver, 10 g agar, och ultraren vatten till en slutlig volym av 500 mL.
  2. Autoklav vid 121 °C i 30 min på en vätskecykel för att sterilisera media.
  3. Häll under en laminär flödeshuv cirka 20 mL agarmedia i en steril Petriplatta. 500 mL agarmedier bör ge ungefär 25 plattor.
  4. Förvara plattor vid 4 °C tills de är färdiga att användas.

3. Ex vivo prep för hyphal morphogenesis assay

  1. Strimmig en fräsch kultur av C. albicans SC5314 på en YPD agar platta och inkubera över natten vid 30 °C.
  2. Plocka två till tre medelstora enskilda kolonier från över natten odlade C. albicans SC5314 kultur och åter avbryta i 1 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS).
  3. Hämta fryst tarminnehåll från frysen -80 °C och tina vid 25 °C.
  4. Väg in ca 150 mg tarminnehåll i ett nytt 1,5 mL-rör.
  5. Åter upphäva tarminnehållet med 150 μL PBS (tarminnehåll och PBS vid en 1:1 vikt till volymförhållande).
  6. Vortex i hög hastighet i 30 s för att homogenisera tarminnehållet och låta sitta i rumstemperatur i ungefär en minut.
  7. Centrifugera homogenaterna vid 1000 x g i 3 min.
  8. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL-rör.
  9. Upprepa steg 3.7 och 3.8 för att avlägsna allt skräp i supernatanten.
  10. Tillsätt 10 μL av C. albicans SC5314 inokulat beredd ovan till denna supernatant
  11. Blanda väl och inkubera vid 37 °C i 4 till 5 h.

4. Exogent tillsats av metaboliter till tarmen homogenat extrakt för den hyphal morphogenesis analysen

  1. Hämta djup innehåll i frysen -80 °C och åter upphängd i PBS vid 1:1-förhållande (vikt: volym).
  2. Tillsätt önskad koncentration av tarmmetaboliter till tarminnehållet och PBS-blandningen.
  3. Vortex i hög hastighet i 30 s för att homogenisera tarminnehållet som innehåller metaboliter och låt sitta i rumstemperatur i ca 10 min.
  4. Centrifugera homogenaterna vid 1000 x g i 3 min.
  5. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL-rör. Upprepa steg 4.4 och 4.5 för att avlägsna allt skräp i supernatanten.
  6. Tillsätt 10 μL av C. albicans SC5314 inokulat som beretts ovan till denna supernatant. Blanda väl och inkubera vid 37 °C i 4 till 5 h.

5. C. albicans morphogenesis assay (immunostaining och bildbehandling)

  1. Centrifugera proverna vid 1000 x g i 2 min och kassera supernatanten via pipettering.
  2. Fixera proverna i 100 μL av 2% paraformaldehyd (PFA) i 15 min.
  3. Centrifugera vid 1000 x g i 2 min och kassera supernatant via pipettering.
  4. Tvätta proverna två gånger med 1 mL PBS. För att tvätta prover, åter upphäva pelleten i PBS genom pipettering försiktigt. Vix inte provet eftersom detta kan skada hyphal strukturer. Efter återupphängning, centrifug vid 1000 x g i 2 min och kassera supernatanten via pipettering.
  5. Inkubera proverna i rumstemperatur i 100 μL PBS innehållande polyklonal C. albicans antikropp (1:100 utspädning) i 30 min.
  6. Tvätta proverna tre gånger med 1 mL PBS.
    OBS: Vid användning av en fluorescerande antikropp rekommenderas att alla utspädnings- och tvättsteg utförs i svagt ljus för att undvika fotoblekning och förbättra provspapprets livslängd.
  7. Inkubera proverna i rumstemperatur i 15 min i 100 μL PBS innehållande anti-Kanin IgG Alexafluor 488 antikropp vid 1:500 utspädning. Utför inkubation i en mörk låda eller rum för att undvika foto blekning.
  8. Tvätta proverna tre gånger med 1 mL PBS.
  9. Åter upphäva proverna i 100 μL PBS och överför till en 96-brunnsplatta för avbildning.
    OBS: När den inte avbildas rekommenderas att 96-brunnsplåten slås in i aluminiumfolie för att undvika fotoblekning.
  10. Bild svampceller med hjälp av 20x och 40x objektiva linser med hjälp av en fluorescens imaging mikroskop. Använd ett grönt fluorescerande protein (GFP) filter (excitation våglängd 470/40 och utsläpp våglängd 525/50) för att upptäcka fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dessa resultat tillsammans med tidigare resultat från Thangamani laboratoriet60 visar att när C. albicans odlas ex vivo i tarmen homogenate extrakt tas från magen, tunntarmen och tjocktarmen av obehandlade kontroll och antibiotika-behandlade möss, C. albicans i allmänhet utvecklas med en jäst morfologi (Figur 1B). Men när odlas i cecalextraktet från antibiotikabehandlade möss, genomgår C. albicans lätt morfogenes, vilket resulterar i prover som innehåller jäst och hyferformer (Figur 1B); detta sker inte i kontrollmöss. Detta stöder tidigare resultat, som visade en betydande ökning av hyfera former i prover som odlas i antibiotikabehandlade cecal extrakt, men inte i någon annan antibiotikabehandlad tarmextrakt60. Dessa resultat tyder på att antibiotikabehandling orsakar förändringar i cecal miljön, som inducerar hyphal morphogenesis av C. albicans. Dessutom, den specifika lokaliseringen av denna fenotyp märkte endast i det cecum också tyder på att dessa hyphae-främja villkor inte nödvändigtvis närvarande i hela mag-tarmkanalen, men i stället är begränsade till specifika segment av mag-tarmkanalen beroende på tillgången på näringsämnen, metaboliter och andra okända molekyler.

Eftersom cecal extrakt av antibiotikabehandlade möss främjar morfogenesen av C. albicans57,58,59,60, undersökte vi om exogent tillägg av en utvald grupp av gut metaboliter (identifieras från tidigare in vitro-studier) till cecal innehållet av CEF-behandlade möss kommer att påverka morfogenogenesen hos C. albicans ex vivo. Tidigare arbete som utförts av Thangamani laboratoriet har karakteriserat metabolomik profilen av cecal innehåll homogenat utvinns från obehandlade och antibiotikabehandlade möss, avslöjar betydande förändringar i överflödet av olika metaboliter till följd av antibiotikabehandling-specifikt, minskad förekomst av sekundära gallsyror och ökad förekomst av kolhydrater60. Vidare, denna studie identifierat att sekundära gallsyror och karboxylsyror hämmar hyfer utveckling, medan kolhydrater inklusive glukos, främja hyfalan morfogenes av C. albicans in vitro60. Resultaten visar att lägga tillbaka en pool av hämmande gut metaboliter som innehåller deoxicholsyra (DCA, 0,5 mg/mL), lithocholic syra (LCA, 0,1 mg/mL), palmitinsyra (0,1 mg/mL), p-tolytetinsyra (0,1 mg/mL), sebacinsyra (0,5 mg/mL), 2-metylsmörsyra (0,5 mg/mL), och mjölksyra (5 mg/mL) till cekal homogenatet av cef-behandlade möss helt hämmade hyfalansmorogenes ex vivo. Å andra sidan visade exogent tillsats av glukos (1 mg/mL) till cecal homogenatet av cef-behandlade möss en massiv hyphal utveckling ex vivo (Figur 2B). Tillsammans indikerar dessa resultat att tillägg av gut metaboliter tillbaka till cecal homogenate av cef-behandlade möss differentially reglerar morfogenes av C. albicans, vilket bekräftar tidigare in vitro-fynd. Dessa resultat visar att gut metaboliter spelar en avgörande roll i hyphal morfogens av C. albicans och förstå genen mål och signalering vägar moduleras av dessa metaboliter kommer stöd i utvecklingen av nya terapeutiska metoder för att förebygga och behandla C. albicans infektioner.

Figure 1
Figur 1: Ex vivo-analys för att bestämma effekten av cefoperazonbehandling på C. albicans hyfalansmorfogena i tarminnehållet. (A) Protokoll schematisk disposition. (B) Antibiotikabehandlade (topppaneler) och icke-behandlade (botten paneler) tarminnehåll togs från magar, tunntarmar, cecums, och tjocktarmen av C57BL/6J möss. Gut innehåll inokulerade med C. albicans SC5314 inkuberades vid 37 °C för 4\u20125 h och färgas med C. albicans antikropp. Celler avbildades vid 40x förstoring. Representativa bilder visas här. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Exogent tillsats av gutmetaboliter till cecalinnehållet från cefbehandlade möss på hyfabildning av C. albicans ex vivo. (A) Protokoll schematisk disposition. (B) Hämmande tarmmetaboliter pool som innehåller DCA (0,5 mg/mL), LCA (0,1 mg/mL), palmitinsyra (0,1 mg/mL), p-tolytetika (0,1 mg/mL), sebacic acid (0.5 mg/mL); 2-metylsmörsyra (0,5 mg/mL), och mjölksyra (5 mg/mL) eller glukos (1 mg/mL) lades tillbaka till cekalhalten i cef-behandlade möss, blandades noggrant och inkuberades vid 37 °C i 15 min för att genomföra ex vivo hyphae-analysen. Cecal innehåll inokulerade med C. albicans SC5314 inkuberades vid 37 °C för 4\u20125 h och färgas med C. albicans antikropp. Celler avbildades vid 40x förstoring. Representativa bilder visas här. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som beskrivs här presenterar ett nytt sätt att undersöka effekten av antibiotika, kost, xenobiotiska och terapeutiska effekter på C. albicans hyfalans morphogenesis i mag-tarmkanalen. Eftersom majoriteten av systemiska infektioner härstammar från mag-tarmkanalen21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 och hyphae bildas är en kritisk virulensfaktor som främjar spridningen av C. albicans från mag-tarmkanalen, förstå de faktorer som styr denna morfogenes i mag-tarmkanalen kommer att utöka kunskapen om patogenes mekanismer och identifiera nya behandlingsalternativ.

Medan den metod som presenteras här är relativt okomplicerad, identifierades vissa steg som diskuteras nedan som kritiska och viktiga. (i) Den initiala inokulaten av C. albicans bör vara optimal för att möjliggöra både tillväxt och hyfalansmorkogenesis av svampar. Med den begränsade tillgången på näringsämnen i tarmen homogenate extrakt, högre volym av inokulat kan avsevärt minska svamptillväxt och morfogensprocess. Tillväxten av olika kliniska isolat och stammar är dock sannolikt att vara varierande, och på så sätt optimera inokulat och inkubationstid för specifika C. albicans isolat är väsentligt. (ii) Flera centrifugeringssteg vid beredning av tarmhomogenatextraktet befanns vara avgörande för att avlägsna skräpet i tarminnehållet så mycket som möjligt. (iii) På grund av den relativt låga hastigheten på centrifugeringen (för att undvika att skada hyfalstrukturer) måste man vara försiktig med att undvika cellförlust under immunofärgningssteg i detta protokoll.

Alternativa metoder för att visualisera svamp hyfa i mag-tarmkanalen har använts tidigare, med vissa fördelar och begränsningar i samband med varje metod. En relativt anmärkningsvärd metod med hjälp av fluorescerande in situ hybridisering (FISH) för att visualisera svamp hyphae i mag-tarmkanalen har nyligen visats av Witchley et al.61,62. Detta är en lovande in vivo metod som för närvarande finns för att upptäcka C. albicans hyphae direkt i mag-tarmkanalen, men komplexiteten i detta protokoll gör det svårt att anpassa den till snabba, storskaliga inledande screeningstudier. Traditionella histopatologi metoder har också använts i det förflutna för att vitalisera C. albicans jäst och hyphae former i mag-tarmkanalen. Observation och bildframställning av svampceller med grundläggande histopatologi, och Hematoxylin och Eosin (H/E) fläckar förblir dock utmanande, eftersom många standardfixeringsmetoder har potential att störa det slemhinna lagret av gi-tarmkanalen prover, ofta skadar hyphal strukturer i processen och leder till motsägelsefulla rapporter över den relativa förekomsten av hyphal cell morfologi under infektion63,64,65,66. Denna metod har utvecklats för att undvika skador på hyphae under bearbetningen för att ta itu med det här problemet. Dessutom vävnad explants har använts som ett sätt att undersöka biologiska förhållanden ex vivo, men dessa metoder är i allmänhet fokuserad och användbar för att undersöka följsamhet eller invasion potential C. albicans67, men också de i allmänhet utesluta majoriteten av metabolomics och mikrobiomet komponenter som bidrar till in vivo patogenes. Även om ex vivo-protokollet som beskrivs här inte helt efterlikna in vivo GI miljö som beskrivstidigare 61,62, det ger närmast möjliga förhållanden som C. albicans möter i tarmen miljön jämfört med in vitro-metoder med hjälp av konstgjorda tillväxt villkor.

Detta protokoll kan användas för grundläggande screening analyser för att identifiera inverkan av miljösignaler i mag-tarmkanalen på C. albicans hyphal morphogenesis. Denna metod möjliggör stora grupper av föreningar inklusive små molekylhämmare, nya antimykotiska medel, och metaboliter som ska screenas snabbt för hyphal utveckling, och kan användas i screening terapeutiska behandlingar eller identifiera riskfaktorer för systemisk sjukdom. Eftersom C. albicans koloniserar hela mag-tarmkanalen, kommer detta protokoll ytterligare stöd för att identifiera de miljösignaler som finns i de specifika segmenten av mag-tarmkanalen som styr hyphal morphogenesis hos individer som tar antibiotika, kemoterapeutiska medel, och hos patienter med metaboliska sjukdomar inklusive diabetes mellitus. I slutändan den metod som beskrivs här möjliggör snabb karakterisering av hyphal morphogenesis i C. albicans över ett brett spektrum av miljöfaktorer på ett sätt som är mer biologiskt relevant än nuvarande in vitro-metoder och är väsentligen snabbare och mer resurseffektiv än nuvarande in vivo metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna erkänner resurser och stöd från Midwestern University Cellular and Molecular Core Research facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 - 10 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-454 Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-400 Misc
20 - 200 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-451 Misc
2-methylbutyric acid Sigma 193070-25G hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG Invitrogen (Fisher) A11008 IF Staining secondary ab
Agar Fisher BP1423-500 YPD agar component
Automated Imaging Microscope Keyence BZX700
Candida Albicans Antibody Invitrogen (Fisher) PA1-27158 IF Staining primary ab
cefoperazone Cayman 16113 antibiotic
deoxycholic acid Sigma 30960 hyphal-inhibitory compound
D-Glucose Fisher D16-500 hyphal-promoting compound
forceps Fisher 08-885
lactic acid Alfa Aesar AAAL13242-06 hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid Sigma L6250-10G hyphal-inhibitory compound
palmitic acid Sigma P5585-10G hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313 IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x Alfa Aesar J62692 PBS component
p-tolylacetic acid SCBT sc-257959 hyphal-inhibitory compound
sebacic acid Sigma 283258-250G hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors Fisher 28301
sterile Milli-Q water N/A N/A Misc
YPD Broth BD Biosciences 242810 YPD agar component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huffnagle, G. B., Noverr, M. C. The emerging world of the fungal microbiome. Trends in Microbiology. 21 (7), 334-341 (2013).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Hajjeh, R. A., et al. Incidence of Bloodstream Infections Due to Candida Species and In Vitro Susceptibilities of Isolates Collected from 1998 to 2000 in a Population-based Active Surveillance Program. Journal of Clinical Microbiology. 42 (4), 1519-1527 (2004).
  4. Lockhart, S. R., et al. Species Identification and Antifungal Susceptibility Testing of Candida Bloodstream Isolates from Population-Based Surveillance Studies in Two U.S. Cities from 2008 to 2011. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3435-3442 (2012).
  5. Pfaller, M., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance(R)) registry, 2004-2008. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 74 (4), 323-331 (2012).
  6. Angarone, M. Fungal infections in cancer patients. Cancer Treatment and Research. 161, 129-155 (2014).
  7. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  8. Calton, E. A., et al. Invasive bacterial and fungal infections in paediatric patients with cancer: incidence, risk factors, aetiology and outcomes in a UK regional cohort 2009-2011. Pediatric Blood & Cancer. 61 (7), 1239-1245 (2014).
  9. Carter, J. H., et al. Medical management of invasive fungal infections of the central nervous system in pediatric cancer patients. Pediatric Blood & Cancer. 62 (6), 1095-1098 (2015).
  10. Low, C. Y., Rotstein, C. Emerging fungal infections in immunocompromised patients. F1000 Medicine Reports. 3, 14 (2011).
  11. Mousset, S., et al. Treatment of invasive fungal infections in cancer patients-updated recommendations of the Infectious Diseases Working Party (AGIHO) of the German Society of Hematology and Oncology (DGHO). Annals of Hematology. 93 (1), 13-32 (2014).
  12. Perfect, J. R., Hachem, R., Wingard, J. R. Update on epidemiology of and preventive strategies for invasive fungal infections in cancer patients. Clinical Infectious Diseases. 59, Suppl 5 352-355 (2014).
  13. Sipsas, N. V., Kontoyiannis, D. P. Invasive fungal infections in patients with cancer in the Intensive Care Unit. International Journal of Antimicrobial Agents. 39 (6), 464-471 (2012).
  14. Falagas, M. E., Apostolou, K. E., Pappas, V. D. Attributable mortality of candidemia: a systematic review of matched cohort and case-control studies. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 25 (7), 419-425 (2006).
  15. Chi, H. W., et al. Candida albicans versus non-albicans bloodstream infections: the comparison of risk factors and outcome. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (5), 369-375 (2011).
  16. Drell, T., et al. Characterization of the vaginal micro- and mycobiome in asymptomatic reproductive-age Estonian women. PLoS One. 8 (1), 54379 (2013).
  17. Merenstein, D., et al. Colonization by Candida species of the oral and vaginal mucosa in HIV-infected and noninfected women. AIDS Research and Human Retroviruses. 29 (1), 30-34 (2013).
  18. Ghannoum, M. A., et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy individuals. PLoS Pathogens. 6 (1), 1000713 (2010).
  19. Hoffmann, C., et al. Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents. PLoS One. 8 (6), 66019 (2013).
  20. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nature Reviews Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  21. Samonis, G., et al. Prospective evaluation of effects of broad-spectrum antibiotics on gastrointestinal yeast colonization of humans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 37 (1), 51-53 (1993).
  22. Sahni, V., et al. Candidemia--an under-recognized nosocomial infection in Indian hospitals. The Journal of the Association of Physicians of India. 53, 607-611 (2005).
  23. Meijer-Severs, G. J., Joshi, J. H. The effect of new broad-spectrum antibiotics on faecal flora of cancer patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 24 (4), 605-613 (1989).
  24. Kennedy, M. J., Volz, P. A., Edwards, C. A., Yancey, R. J. Mechanisms of association of Candida albicans with intestinal mucosa. Journal of Medical Microbiology. 24 (4), 333-341 (1987).
  25. Miranda, L. N., et al. Candida colonisation as a source for candidaemia. Journal of Hospital Infections. 72 (1), 9-16 (2009).
  26. Nucci, M., Anaissie, E. Revisiting the source of candidemia: skin or gut. Clinical Infectious Diseases. 33 (12), 1959-1967 (2001).
  27. Raponi, G., Visconti, V., Brunetti, G., Ghezzi, M. C. Clostridium difficile infection and Candida colonization of the gut: is there a correlation. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 1648-1649 (2014).
  28. Guastalegname, M., Russo, A., Falcone, M., Giuliano, S., Venditti, M. Candidemia subsequent to severe infection due to Clostridium difficile: is there a link. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 772-774 (2013).
  29. Nerandzic, M. M., Mullane, K., Miller, M. A., Babakhani, F., Donskey, C. J. Reduced acquisition and overgrowth of vancomycin-resistant enterococci and Candida species in patients treated with fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. Clinical Infectious Diseases. 55, Suppl 2 121-126 (2012).
  30. Krause, R., Krejs, G. J., Wenisch, C., Reisinger, E. C. Elevated fecal Candida counts in patients with antibiotic-associated diarrhea: role of soluble fecal substances. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 167-168 (2003).
  31. Krause, R., et al. Role of Candida in antibiotic-associated diarrhea. The Journal of Infectious Diseases. 184 (8), 1065-1069 (2001).
  32. Zuo, T., et al. Gut fungal dysbiosis correlates with reduced efficacy of fecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection. Nature Communications. 9 (1), 3663 (2018).
  33. Delaloye, J., Calandra, T. Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient. Virulence. 5 (1), 161-169 (2014).
  34. Cole, G. T., Halawa, A. A., Anaissie, E. J. The role of the gastrointestinal tract in hematogenous candidiasis: from the laboratory to the bedside. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 73-88 (1996).
  35. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  36. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  37. Bendel, C. M., et al. Systemic infection following intravenous inoculation of mice with Candida albicans int1 mutant strains. Molecular genetics and metabolism. 67 (4), 343-351 (1999).
  38. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial agents and chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  39. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 599-604 (2009).
  40. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  41. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature genetics. 45 (9), 1088 (2013).
  42. Bar-Yosef, H., Gonzalez, N. V., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific reports. 7 (1), 5692 (2017).
  43. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans hypha-inducing transcription factor Ume6 by the CDK1 cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), 00248 (2017).
  44. Vila, T., et al. Targeting Candida albicans filamentation for antifungal drug development. Virulence. 8 (2), 150-158 (2017).
  45. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
  46. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  47. Bar-Yosef, H., Vivanco Gonzalez, N., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific Reports. 7 (1), 5692 (2017).
  48. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 599-604 (2009).
  49. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans Hypha-Inducing Transcription Factor Ume6 by the CDK1 Cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), (2017).
  50. Bendel, C. M., et al. Effects of Alteration of the Candida albicans Gene INT1 on Cecal Colonization in Orally Innoculated Mice. Pediatric Research. 45, 156 (1999).
  51. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  52. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  53. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  54. Naseem, S., Gunasekera, A., Araya, E., Konopka, J. B. N-acetylglucosamine (GlcNAc) induction of hyphal morphogenesis and transcriptional responses in Candida albicans are not dependent on its metabolism. Journal of Biological Chemistry. 286 (33), 28671-28680 (2011).
  55. Piispanen, A. E., Hogan, D. A. PEPped up: induction of Candida albicans virulence by bacterial cell wall fragments. Cell Host & Microbe. 4 (1), 1-2 (2008).
  56. Xu, X. L., et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host & Microbe. 4 (1), 28-39 (2008).
  57. Guinan, J., Thangamani, S. Antibiotic-induced alterations in taurocholic acid levels promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. FEMS microbiology letters. 365 (18), (2018).
  58. Guinan, J., Villa, P., Thangamani, S. Secondary bile acids inhibit Candida albicans growth and morphogenesis. Pathogens and disease. 76 (3), (2018).
  59. Guinan, J., Wang, S., Hazbun, T. R., Yadav, H., Thangamani, S. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids correlate with increased gastrointestinal colonization of Candida albicans. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  60. Gutierrez, D., et al. Antibiotic-induced gut metabolome and microbiome alterations increase the susceptibility to Candida albicans colonization in the gastrointestinal tract. FEMS microbiology ecology. 96 (1), 187 (2020).
  61. Witchley, J. N., et al. Candida albicans morphogenesis programs control the balance between gut commensalism and invasive infection. Cell Host & Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
  62. Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (153), e60283 (2019).
  63. Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Mucins. , Springer. 229-235 (2012).
  64. Lossinsky, A. S., et al. The histopathology of Candida albicans invasion in neonatal rat tissues and in the human blood-brain barrier in culture revealed by light, scanning, transmission and immunoelectron microscopy scanning. Histology and histopathology. , (2006).
  65. Rosenbach, A., Dignard, D., Pierce, J. V., Whiteway, M., Kumamoto, C. A. Adaptations of Candida albicans for growth in the mammalian intestinal tract. Eukaryotic Cell. 9, 1075-1086 (2010).
  66. Vautier, S., et al. C andida albicans colonization and dissemination from the murine gastrointestinal tract: the influence of morphology and T h17 immunity. Cellular Microbiology. 17, 445-450 (2015).
  67. Lyman, C., Navarro, E., Garrett, K., Roberts, D., Pizzo, P., Walsh, T. Adherence of Candida albicans to bladder mucosa: development and application of a tissue explant assay. Mycoses. 42, 255-259 (1999).

Tags

Immunologi och infektion Candida albicans hyphal morphogenesis ex vivo analys glukos sekundära gallsyror och MAG-tarmkanalen
En Ex vivo-analys att studera <em>Candida albicans</em> Hyphal Morphogenesis i mag-tarmkanalen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monasky, R., Villa, S., Thangamani,… More

Monasky, R., Villa, S., Thangamani, S. An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract. J. Vis. Exp. (161), e61488, doi:10.3791/61488 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter