Immunology and Infection

前体内分析研究胃肠道的念珠菌血脂磷

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61488

Ross Monasky¹, Sonia Villa², Shankar Thangamani³

¹College of Veterinary Medicine, Midwestern University, ²Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, ³Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

本研究中描述的利用肠道同质化提取物和免疫荧光染色的外体检测是一种研究胃肠道中念珠菌的催眠形态的新方法。该方法可用于研究调节肠道形态遗传过渡的环境信号。

Abstract

胃肠道（GI） 的白种病膜形成受到各种环境信号的严格控制，在这种机会性真菌病原体的传播和发病机制中起着重要作用。然而，在体内的GI道道中可视化真菌催眠的方法具有挑战性，这限制了对控制这种形态过程的环境信号的理解。此处描述的协议演示了一种新颖的外生体方法，用于在肠道同质性提取物中可视化催眠形态。使用体外测定，这项研究证明，来自抗生素治疗小鼠的切克萨尔含量，但不是来自未经治疗的对照小鼠，促进肠道内 C.albicans 催眠膜形成。此外，从抗生素治疗的小鼠中加入特定组肠道代谢物，可不同地调节生外膜形成。综合起来，该协议代表了一种识别和研究控制胃肠道中 C.albicans 催眠形态形成的环境信号的新方法。

Introduction

念珠菌是一种机会主义的多态性真菌病原体，通常是共生性的，但可以经历形态变化，形成一种致命的形式，能够引起免疫功能低下的个体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13等危及^{生命的感染}。C. albicans是全身性耳部感染的主要原因，即使抗真菌治疗 2、14、15，死亡率也是^40~u201260%。虽然C.albicans居住在不同的宿主利基，包括女性生殖系统16，17，口腔^{健康个体18}和胃肠道^{（GI）19，20，}大多数全身感染来自胃肠道，此外，全身感染的来源通常被证实为胃肠道21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34。GI道区中的二比二丹致病性受多种因素的影响;然而，毒性所需的一个主要特征是，从酵母细胞形态过渡到毒性催眠细胞形态35，36，37，38，39，40，41，42，43，44。感染期间从胃肠道附着和传播的C.albicans与它从共生酵母转化为毒催眠剂的能力高度相关，使真菌能够引起^{侵入性疾病44，45，46，47，48，49，50，51，52，53。}

肠道中的各种因素，包括n-乙酰葡萄糖胺，调节由C.albicans形成催眠。因此，缩小有关这种真菌病原体在胃肠道^54、55、56中催眠形态^{的知识差距}^至关重要。最近的证据表明，各种肠道代谢物在体外^{57、58、59、60}中对C.albicans的催眠^{形态进行差}^分控制。然而，技术约束在尝试研究体内肠道样本中的C.albicans催眠形成时存在问题，特别是染色酵母和催眠细胞以及催眠细胞的定量分析。为了了解胃肠道中C.albicans催眠病的形态，利用小鼠同质化肠道含量的可溶性提取物，开发出一种外生殖方法，以研究代谢物对真菌催眠形态生成的影响。利用来自具有抗药性且易感染C.albicans GI感染的小鼠的肠道样本，此方法将有助于识别和研究代谢物、抗生素和异体生物对胃肠道真菌性脂肪形态生成的影响。

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Protocol

所有动物协议都经过中西部大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，如^{57之前所述}。中西部大学机构动物护理和使用委员会根据MWU IACUC协议批准了这项研究#2894。MWU 动物护理政策遵循公共卫生服务（PHS）关于实验室动物的人道护理和使用政策以及《动物福利法》中制定的政策。

1. 小鼠学习标准协议

使用雄性和雌性C57BL/6J小鼠至少六周大。补充无菌水与或不带西福拉酮（0.5毫克/千升）。
1. 合二为一的小鼠为5组，每个笼子包含所有雄性或所有雌性小鼠。提供小鼠标准鼠标周和水（通过400毫升瓶）在任何时候。
2. 每天检查笼子，以确保食物和水位足够，并检查小鼠是否有危难迹象。
每 48 小时更换一次西福球菌酮水，以确保无论笼中喂养瓶中的剩余水如何，都能提供新鲜的抗生素。
经过5\u20127天的cefoperazone治疗后，通过CO₂ 窒息观察已建立的亚共和症协议对小鼠实施安乐死。通过宫颈脱位确认死亡。
使用灭菌灭菌式尖端剪刀和自化钳子解剖小鼠。
1. 安乐死后，通过固定所有四肢，使腹部暴露，将动物固定在解剖表面。
2. 用 70% 乙醇喷洒腹部区域，以防止毛皮在解剖过程中粘在钳子、剪刀或肠道部分。
3. 使用钳子捏合和抬起腹部底部的一部分皮肤，并使用剪刀通过皮肤和底膜创建一个小切口。切开时要小心，避免刺穿切库姆或肠壁。
4. 将此切口扩展到肋骨保持架，部分露出腹腔。从两侧初始切口点开始切割，向上和横向延伸。
5. 横向拉动这些活门并固定到解剖表面，以完全暴露腹腔。
使用钳子提取胃肠道，同时使用剪刀使切口优于胃和大肠的远腹区域，以确保从每个部分收集最大的肠道内容。
取出胃肠道时，注意避免损坏各个部件。单独分离胃，小肠，cecum和大肠单独使用剪刀在他们的近端和近端。
要收集每个部分的每个肠道内容物，使用剪刀在每个部分的远端进行单个切口，然后使用钳子手动将肠道内容物排出到 1.5 mL 微离心管中。
将肠道内物储存在-80°C，进行外体检测。

2. 制备酵母提取物-肽-葡萄糖（YPD）的糖板

到1L玻璃瓶添加25克酵母提取物肽-葡萄糖汤粉，10克的阿加，和超纯水到500毫升的最终体积。
在液体循环下在 121 °C 下灭菌 30 分钟，以消毒介质。
在层流罩下，将大约 20 mL 的阿加介质倒入无菌培养板中。500 mL 的阿加介质应产生大约 25 个板。
将板存放在4°C，直到准备好使用。

3. 催眠形态分析的外体准备

将 C. albicans SC5314 的新鲜文化带到 YPD 阿加盘上，并在 30°C 下孵育过夜。
从隔夜生长的 C. albicans SC5314 培养中挑选两到三个中等大小的个体菌落，并在 1 mL 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重新悬浮。
从-80°C冷冻机中取出冷冻肠道内装物，并在25°C下解冻。
重量约150毫克的肠道内容到一个新的1.5 mL管。
使用 150 μL 的 PBS（肠道含量和 PBS 以 1：1 的重体积比重新悬浮肠道内容）。
高速度的涡流为30秒，使肠道内装物均匀，并允许在室温下坐约一分钟。
以 1000 x g 离心均质 3 分钟。
将上一液转移到新的 1.5 mL 管中。
重复步骤 3.7 和 3.8 以清除上最后一个液位中的所有碎屑。
将上面制备的 C. albicans SC5314 中分值添加到此上流水
混合好，在37°C孵育4至5小时。

4. 肠道同质物提取物中代谢物的外源性添加，用于催眠形态发生测定

从-80°C冷冻机中取出冷冻肠道内装物，以1：1的比例（重量：体积）在PBS中重新悬浮。
将所需的肠道代谢物浓度添加到肠道含量和 PBS 混合物中。
高速度的涡流为30秒，使含有代谢物的肠道内容物均质化，并允许在室温下坐约10分钟。
以 1000 x g 离心均质 3 分钟。
将上一液转移到新的 1.5 mL 管中。重复步骤 4.4 和 4.5 以清除上一液中的所有碎屑。
将上面制备的 C. albicans SC5314 中分的 10 μL 添加到此上流液中。混合好，在37°C孵育4至5小时。

5. C. 阿尔比肯人形态发生测定（免疫污化和成像）

将样品以1000 x g 离心2分钟，然后通过移液将上流水液丢弃。
将样品在 100 μL 中固定 2% 甲醛（PFA） 15 分钟。
在 1000 x g 下离 心 2 分钟，通过移液丢弃上流水。
用 1 mL PBS 清洗样品两次。要清洗样品，请轻轻移液，将颗粒重新悬浮在 PBS 中。不要涡旋样品，因为这会损害催眠结构。重新悬浮后，在1000 x g下离心 2分钟，通过移液丢弃上流液。
在室温下在含有多克隆 C.albicans 抗体（1：100稀释）的PBS中孵育样品30分钟。
用 1 mL PBS 清洗样品三次。
注：使用荧光抗体时，建议在昏暗的光线下进行所有稀释和洗涤步骤，以避免照片漂白并延长样品的寿命。
在室温下在含有抗兔IgG Alexafluor 488抗体的100μLPBS中孵育样品15分钟，稀释时间为1：500。在黑暗的抽屉或房间进行孵育，以避免照片漂白。
用 1 mL PBS 清洗样品三次。
将样品重新悬浮在 100 μL 的 PBS 中，并转移到 96 井板进行成像。
注：未成像时，建议将 96 井板包裹在铝箔中，以避免照片漂白。
使用荧光成像显微镜使用 20 倍和 40 倍物镜成像真菌细胞。使用绿色荧光蛋白（GFP）过滤器（激发波长 470/40 和发射波长 525/50）检测荧光。

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Representative Results

这些结果以及丹加马尼实验室⁶⁰ 的先前发现表明， 当C.albicans 在未经治疗的对照组和抗生素治疗小鼠的胃、小肠和大肠的肠道同质提取物中生长时 ，C.albicans 通常与酵母形态一起发展（图1B）。然而，当从抗生素处理的小鼠的cesal提取物中生长时 ，C.albicans 很容易经历形态生成，导致含有酵母和催眠素形式的样本（图1B）;这不会发生在对照小鼠中。这支持了先前的结果，结果显示，在抗生素治疗的cesal提取物中生长的样品中，催眠形式显著增加，但在任何其他抗生素治疗的肠道提取物^{60中则没有}显著增加。这些结果表明，抗生素治疗会导致细胞环境的变化，从而诱发 C.albicans的催眠形态。 此外，仅在 cecum 中注意到的这种表型的特定定位也表明，这些促进催眠的条件不一定存在于整个胃肠道中，而是局限于胃肠道的特定部分，具体取决于营养物质、代谢物和其他未知分子的可用性。

由于抗生素治疗小鼠的切克提取促进C.albicans57、58、59、60的形态发生，我们检查了从原生中添加一组选定的肠道代谢物（从以前的体外研究中鉴定）到由Cef治疗的小鼠的切克含量是否会影响C.albicans前体的影响。Thangamani实验室先前的工作已经特征于从未经治疗和抗生素治疗的小鼠中提取的cesal含量同质酸盐的代谢组形，揭示了抗生素治疗导致各种代谢物丰度的显著变化——具体来说，二次胆汁酸的丰度减少^{，碳水化合物的丰度增加60。}此外，本研究还发现，继发性胆汁酸和碳水化合物酸抑制了催眠的发生，而包括葡萄糖在内的碳水化合物则促进体外⁶⁰的C.albicans的催眠形态。结果表明，加入含有脱氧胆酸（DCA，0.5毫克/mL）、脂质酸（LCA， 0.1毫克/mL），棕榈酸（0.1毫克/千升），p-托拉西酸（0.1毫克/千升），西巴奇酸（0.5毫克/mL）， 2-甲基丁酸（0.5毫克/mL）和乳酸（5毫克/mL）对乙型甲酸的甲酸均质完全抑制了催眠形态形成。另一方面，葡萄糖（ 1mg / mL ）的外源性添加到经过治疗的小鼠的 ceal 均质，在体内显示出巨大的催眠发育（图 2B ）。总的来说，这些发现表明，将肠道代谢物添加回经塞夫治疗的小鼠的切萨尔均质中，对C.albicans的形态进行差异调节，从而证实了先前的体外发现。这些结果表明，肠道代谢物在C.albicans的催眠形态发生中起着关键作用，了解这些代谢物调节的基因靶点和信号通路将有助于开发预防和治疗C.albicans感染的新治疗方法。

图1：外体检测，以确定西福拉酮治疗对 肠道内C.albicans 催眠膜形成的影响。（A）协议示意图大纲。（B）从C57BL/6J小鼠的胃、小肠、切库姆和大肠中取取抗生素处理（顶板）和非处理（底板）肠道内。用 C.albicansSC5314 接种的古特含量在37°C下孵育4°C，4°u20125小时，并染色于 C.albicans 抗体。以 40 倍放大倍率对细胞进行成像。此处显示了代表性图像。请单击此处查看此图的较大版本。

图2：在经过治疗的小鼠体内，在C.albicans前体内形成催眠的细胞 物质中，肠道代谢物的外源 性添加。（A）协议示意图大纲。（B）含有 DCA （0.5 mg/mL）、LCA （0.1 mg/mL）、棕榈酸（0.1 mg/mL）、p-托利乳酸（0.1毫克/mL）、塞巴奇酸（0.5毫克/mL）的抑制性肠道代谢物池;2-甲基丁酸（0.5毫克/mL）和乳酸（5毫克/mL）或葡萄糖（1毫克/mL）被添加回经过治疗的小鼠的cesal含量中，在37°C下彻底混合并孵育15分钟，进行外体膜检测。接种 C.albicans SC5314的Ceal含量在37°C下孵育4°C，4°u20125小时，并染色于 C.albicans 抗体。以 40 倍放大倍率对细胞进行成像。此处显示了代表性图像。请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

本文描述的方法提出了一种新方法，用于研究抗生素、饮食、异种生物和治疗对胃肠道中C.albicans催眠膜形成的影响。由于大部分全身感染来自胃肠道^{21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34，}^而催眠形成是促进C传播的关键病毒因素。来自胃肠道的阿尔比肯人，了解控制胃肠道中这种形态形成的因素将扩大有关发病机制的知识，并确定新的治疗方案。

虽然此处介绍的方法相对简单，但下面讨论的某些步骤被确定为关键和重要。（i） C. albicans的初始孵 化应是最佳的，以利于真菌的生长和催眠形态。由于肠道同质化提取物中营养物质的供应量有限，高量的中分可能会显著减少真菌生长和形态形成过程。然而，不同临床分离物和菌株的生长可能是可变的，因此优化特定 C.albicans 分离物的孵化和孵育时间至关重要。（二）在制备肠道同质提取物时，发现多个离心步骤对于尽可能清除肠道内物的碎屑至关重要。（iii）由于离心速度相对较低（为避免损害催眠结构），在该协议中的免疫破坏步骤中，必须注意避免细胞丧失。

过去曾使用过在胃肠道中可视化真菌催眠剂的替代方法，每种方法都有一些优点和限制。Witchley等人^最近演示了一种使用荧光原位杂交（FISH）来可视化胃肠道真菌催眠^法^的方法。这是一种很有前途的体内方法，可用于直接在胃肠道中检测C.albicans催眠，然而，这个协议的复杂性使得它很难适应快速、大规模的初始筛选研究。传统的组织病理学方法在过去也被用来在胃肠道中使C.albicans酵母和催眠形式的活力。然而，对具有基本组织病理学的真菌细胞的观察和成像，以及血红素和Eosin（H/E）染色仍然具有挑战性，因为许多标准固定方法有可能破坏胃肠道样本的粘膜层，往往在这个过程中破坏催眠结构，导致^{在感染63、64、65、66}^期间对催眠细胞形态的相对丰度产生^{矛盾的报告}。开发此方法是为了避免在处理过程中对催眠的损害而开发，以解决此问题。此外，组织外植物已被用作一种检查生物条件外活体，但这些方法一般是重点和有用的检查C.albicans⁶⁷的坚持或入侵潜力，但通常他们排除大多数代谢组和微生物群成分，有助于体内发病机制。虽然这里描述的外体协议并不完全模仿前^{文GI环境，如前面描述的61，62，}它提供了与使用人工生长条件的体外方法相比，C.albicans在肠道环境中遇到的最接近的条件。

该协议可用于基本筛选检测，以确定胃肠道环境信号对 C.albicans催眠 膜发生的影响。这种方法允许对包括小分子抑制剂、新型抗真菌剂和代谢物在内的大群化合物进行快速筛查，以进行催眠发育，并可用于筛查治疗或识别全身性疾病的危险因素。由于 C.albicans 在整个胃肠道中殖民，该协议将进一步帮助识别在胃肠道的特定部分存在的环境信号，这些信号控制服用抗生素、化疗剂的个体和代谢紊乱患者（包括糖尿病）的催眠形态。最终，此处描述的方法允许对 C. albicans 的海发形态发生进行快速表征，其方式与当前体外方法在生物学上更相关，并且比当前体内方法更快、更资源高效。

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Disclosures

作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。

Acknowledgments

作者承认中西部大学细胞和分子核心研究机构的资源和支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 - 10 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-454	Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-400	Misc
20 - 200 µL Pipet Tips	Fisher Scientific	02-707-451	Misc
2-methylbutyric acid	Sigma	193070-25G	hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen (Fisher)	A11008	IF Staining secondary ab
Agar	Fisher	BP1423-500	YPD agar component
Automated Imaging Microscope	Keyence	BZX700
Candida Albicans Antibody	Invitrogen (Fisher)	PA1-27158	IF Staining primary ab
cefoperazone	Cayman	16113	antibiotic
deoxycholic acid	Sigma	30960	hyphal-inhibitory compound
D-Glucose	Fisher	D16-500	hyphal-promoting compound
forceps	Fisher	08-885
lactic acid	Alfa Aesar	AAAL13242-06	hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid	Sigma	L6250-10G	hyphal-inhibitory compound
palmitic acid	Sigma	P5585-10G	hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313	IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x	Alfa Aesar	J62692	PBS component
p-tolylacetic acid	SCBT	sc-257959	hyphal-inhibitory compound
sebacic acid	Sigma	283258-250G	hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors	Fisher	28301
sterile Milli-Q water	N/A	N/A	Misc
YPD Broth	BD Biosciences	242810	YPD agar component