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Biochemistry

अरबीडोप्सिस में ऑस्मोटिक स्ट्रेस सिग्नलिंग के लिए फॉस्फोप्रोटेओमिक रणनीति

Published: June 25, 2020 doi: 10.3791/61489
Automatic Translation
1,3, 2, 3,4, 5
1Department of Plant Biology, Carnegie Institute for Science, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University, 3Department of Biochemistry, Purdue University, 4Department of Chemistry, Purdue University, 5Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

यहां प्रस्तुत एक फॉस्फोप्रोटेओमिक दृष्टिकोण है, अर्थात् स्टॉप एंड गो एक्सट्रैक्टिंग टिप आधारित फॉस्फोप्रोटेओमिक, जो अरबीडोप्सिस फॉस्फोप्रोटेम के उच्च-थ्रूपुट और डीप कवरेज प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण अरबीडोप्सिस में ऑस्मोटिक तनाव सिग्नलिंग के अवलोकन को चित्रित करता है।

Abstract

प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन ऑस्मोटिक स्थिति के तहत एंजाइम गतिविधि और जीन अभिव्यक्ति के नियमन के लिए महत्वपूर्ण है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित फॉस्फोप्रोटेओमिक्स ने पौधों के सिग्नल ट्रांसडक्शन का अध्ययन करने का तरीका बदल दिया है। हालांकि, कवरेज की गहराई को प्राप्त करने के लिए बहुत सारी सामग्रियों और लंबे समय तक एमएस माप समय की आवश्यकता पौधों में वैश्विक फॉस्फोप्रोटेओमिक परिवर्तनों के उच्च थ्रूपुट अध्ययन के लिए सीमित कारक रही है। पौधे फॉस्फोप्रोटेओमिक्स की संवेदनशीलता और थ्रूपुट में सुधार करने के लिए, हमने ऑस्मोटिक तनाव के जवाब में पौधे फॉस्फोरिलेशन क्षोभ के तेजी से और व्यापक विश्लेषण के लिए टैंडेम मास टैग (टीएमटी) लेबलिंग के साथ मिलकर एक स्टॉप एंड गो एक्सट्रैक्टेशन (स्टेज) टिप आधारित फॉस्फोप्रोटेमिक्स दृष्टिकोण विकसित किया है। चरण टिप तकनीक की सादगी और उच्च थ्रूपुट का लाभ उठाते हुए, पूरी प्रक्रिया में फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन, अंश और नमूना सफाई चरणों को खत्म करने के लिए दो युक्तियों का उपयोग करके लगभग एक घंटे लगते हैं, जो दृष्टिकोण की आसान-से-उपयोग और उच्च दक्षता का सुझाव देते हैं। यह दृष्टिकोण न केवल एक गहन संयंत्र फॉस्फोप्रोटेमिक्स विश्लेषण (> 11,000 फॉस्फोपेप्टाइड पहचान) प्रदान करता है, बल्कि निकटवर्ती अंशों के बीच बेहतर पृथक्करण दक्षता (< 5% ओवरलैप) को भी दर्शाता है। इसके अलावा, वाइल्ड-टाइप और snrk2 डिकुपल म्यूटेंट पौधों के फॉस्फोप्रोटेमोमिक बदलावों की मात्रा निर्धारित करने के लिए टीएमटी लेबलिंग का उपयोग करके मल्टीप्लेक्सिंग हासिल की गई है । इस दृष्टिकोण का सफलतापूर्वक उपयोग ओस्मोटिक तनाव के जवाब में आरएएफ जैसी किनेस की फॉस्फोरिलेशन घटनाओं को प्रकट करने के लिए किया गया है, जो भूमि संयंत्रों में प्रारंभिक ऑस्मोटिक सिग्नलिंग की समझ पर प्रकाश डालता है।

Introduction

उच्च लवणता, कम तापमान, और सूखे के कारण ओस्मोटिक तनाव होता है, जो एक प्रमुख पर्यावरणीय कारक है जो पौधों की उत्पादकता को प्रभावित करता है1,2। प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन सबसे महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में से एकहै जो ओस्मोटिक तनाव3,4,5के पौधे के जवाब में संकेत धारणा और लेनदेन मध्यस्थता करता है। SNF1 से संबंधित प्रोटीन kinase 2s (SnRK2s) ऑस्मोटिक तनाव संकेत6में शामिल हैं । एसएनआरके2 परिवार के दस में से नौ सदस्य ों में ऑस्मोटिक स्ट्रेस7,8के जवाब में महत्वपूर्ण सक्रियता दिखाई दे रही है . snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)उत्परिवर्ती सभी दस SnRK2 में उत्परिवर्तन होने ओस्मोटिक तनाव के लिए अतिसंवेदनशीलता प्रदर्शित किया । snrk2-dec उत्परिवर्ती में, इनोसिटोल 1,4,5-ट्राइस्फोस्फेट (आईपी3),एब्सिसिक एसिड (एबीए) बायोसिंथेसिस, और जीन अभिव्यक्ति दृढ़ता से कम कर रहे हैं, ओस्मोटिक तनाव प्रतिक्रियाओं में SnRK2s की महत्वपूर्ण भूमिका को उजागर6के ऑस्मोटिक तनाव-प्रेरित संचय । हालांकि, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि SnRK2s kinases इन जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित कैसे । ऑस्मोटिक तनाव के जवाब में फॉस्फोप्रोटेओमिक परिवर्तनों की प्रोफाइलिंग इस अंतर को पाटने और पौधों में ऑस्मोटिक तनाव-ट्रिगर रक्षा तंत्र को चित्रित करने का एक कुशल तरीका है।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) मैपिंग प्लांट फॉस्फोप्रोटेम9के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। हालांकि, पौधे फॉस्फोप्रोटेओमिक्स का लक्षण वर्णन, पौधे प्रोटेम की गतिशील रेंज और पौधों की जटिलता4के कारण एक चुनौती बनी हुई है। इन चुनौतियों से उबरने के लिए, हमने एक सार्वभौमिक संयंत्र फॉस्फोप्रोटेओमिक वर्कफ्लो विकसित किया, जो फोटोसिंथेटिक पिगमेंट और माध्यमिक मेटाबोलाइट्स जैसे अवांछित हस्तक्षेपों को समाप्त करता है, और पौधे फॉस्फोप्रोटेम10के गहरे कवरेज को सक्षम करता है। एमएस विश्लेषण 11 ,12 , 13 , 14 , 15,16से पहले फॉस्फोपेप्टाइड्स को समृद्ध करने के लिए स्थिर धातु आयन एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) और धातु ऑक्साइड क्रोमेटोग्राफी (एमओसी) जैसे कई फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन विधी विकसित की गई हैं । फॉस्फोपेप्टाइड्स के साथ सह-शुद्ध अम्लीय गैर-फॉस्फोपेप्टाइड फॉस्फोपेप्टाइड का पता लगाने के लिए प्रमुख हस्तक्षेप हैं। पहले, हमने प्री-फ्रैक्शन चरण11को दरकिनार करते हुए 90% से अधिक संवर्धन विशिष्टता प्राप्त करने के लिए, गैर-फॉस्फोपेप्टाइड्स के बंधन को खत्म करने के लिए आईमैक लोडिंग बफर के पीएच मूल्य और कार्बनिक एसिड एकाग्रता को मानकीकृत किया।

फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन और अंश की बहु-चरण प्रक्रिया में नमूना हानि फॉस्फोपेप्टाइड पहचान की संवेदनशीलता और फॉस्फोप्रोटेडोमिक कवरेज की गहराई को बाधित करती है। स्टॉप-एंड-गो-एक्सट्रैक्टिंग टिप्स (स्टेज टिप्स) पिपेट टिप्स हैं जिनमें टिप के अंत को सीमित करने के लिए छोटे डिस्क होते हैं, जिन्हें पेप्टाइड आंशिकता और सफाई17के लिए क्रोमेटोग्राफी के साथ शामिल किया जा सकता है। चरण टिप प्रक्रिया के दौरान नमूना हानि ट्यूबों के बीच नमूना हस्तांतरण से बचने के द्वारा कम किया जा सकता है। हमने जीए3 + -आईमैक और फे3 +-आईमैक में स्टेज टिप को सफलतापूर्वक लागू किया है ताकि कम प्रचुर मात्रा में कई फॉस्फोरिलेटेड पेप्टाइड्स को अकेले फॉस्फोरिलेटेड पेप्टाइड्स से अलग किया जा सके, जिससे मानव फॉस्फोप्रोटेम15की गहराई में सुधार हुआ। इसके अलावा, उच्च पीएच रिवर्स-फेज (एचपी-आरपी) चरण टिप के उपयोग ने मजबूत आयन एक्सचेंज (एससीएक्स) और मजबूत एनियन एक्सचेंज (एसएक्स) क्रोमेटोग्राफी18की तुलना में मानव झिल्ली प्रोटेम के व्यापक कवरेज का प्रदर्शन किया है। इसलिए, आईमैक और एचपी-आरपी स्टेज टिप तकनीकों को एकीकृत करने से सादगी, उच्च विशिष्टता और उच्च थ्रूपुट के साथ पौधे फॉस्फोप्रोटेम कवरेज में वृद्धि हो सकती है। हमने दिखा दिया है कि इस रणनीति ने अरबीडोप्सिस रोपण से 20,000 से अधिक फॉस्फोरिलेशन साइटों की पहचान की, जो पौधे फॉस्फोप्रोटेम19की बढ़ी हुई गहराई का प्रतिनिधित्व करती है।

यहां, हम अरबीडोप्सिस में फॉस्फोप्रोटेओमिक प्रोफाइलिंग के लिए एक चरण टिप-आधारित फॉस्फोप्रोटेओमिक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। यह कार्यप्रवाह ऑस्मोटिक तनाव के जवाब में जंगली प्रकार और snrk2-dec उत्परिवर्ती रोपण के फॉस्फोप्रोटेओमिक क्षोभ का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। फॉस्फोप्रोटेओमिक विश्लेषण से किनेस एक्टिवेशन और अर्ली ऑस्मोटिक स्ट्रेस सिग्नलिंग में फंसा फॉस्फोरिलेशन साइट्स का पता चला । जंगली प्रकार और snrk2-dec उत्परिवर्ती फॉस्फोप्रोटेम डेटा के तुलनात्मक विश्लेषण ने आरएएफ की तरह किनेज़ (आरएएफ) की खोज का नेतृत्व किया-SnRK2 kinase झरना जो उच्च पौधों में ओसमोर तनाव संकेत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।

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Protocol

1. नमूना तैयार करना

  1. एक एल्यूमीनियम पन्नी में नियंत्रण और तनाव का इलाज रोपण (1 ग्राम) फसल और फ्लैश तरल नाइट्रोजन में नमूनों फ्रीज ।
    नोट: उच्च प्रोटीन एकाग्रता आमतौर पर परिपक्व पौधों की तुलना में दो सप्ताह पुराने रोपण से मनाया जाता है । एक ग्राम रोपण लगभग 10 मिलीग्राम प्रोटीन lysate उत्पन्न करता है, जो एमएस विश्लेषण के लिए पर्याप्त है। सभी अपकेंद्रित्र कदम चरण 1 में 16,000 x g पर होते हैं।
  2. तरल नाइट्रोजन से भरे मोर्टार और मूसल का उपयोग करके जमे हुए रोपण को एक महीन पाउडर में पीस लें।
  3. लाइसिस बफर के 1 एमएल जोड़ें ((100 mM Tris-HCl में 6 एम ग्वानिडीन-एचसीएल, पीएच 8.5) 10 एमएम ट्रिज़ (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड (टीएमईपी), 40 एमएम 2-क्लोरोसेटामाइड (सीएए), प्रोटीज अवरोधक और फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल) के साथ मोर्टार और मूसल की सहायता से मिलाएं।
  4. पौधे को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी करें।
  5. ट्यूब को 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। 10 एस के लिए बर्फ पर ट्यूब को सोनिकेट करें, 10 एस के लिए रोकें, और तीन बार दोहराएं।
  6. 20 मिनट के लिए ट्यूब और एलिकोट 150 माइक्रोन के लिए ट्यूब को 1.5 एमएल ट्यूब में ले जाते हैं।
  7. ट्यूब में 100% मेथनॉल का 600 माइक्रोन जोड़ें। भंवर और ट्यूब नीचे स्पिन।
  8. ट्यूब में 100% क्लोरोफॉर्म का 150 माइक्रोल जोड़ें। भंवर और ट्यूब नीचे स्पिन।
  9. ट्यूब में डीडीएच 2 ओ के 450माइक्रोनजोड़ें। भंवर और 3 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  10. ऊपरी जलीय परत को त्यागें। ट्यूब में 100% मेथनॉल का 600 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब को 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें और फिर समाधान को त्याग दें।
  11. प्रोटीन छर्रों को 100% मेथनॉल के 600 माइक्रोन के साथ धोएं। घोल को त्यागें और प्रोटीन पेलेट को हवा सूखी दें।
  12. 100 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.5) में प्रोटीन छर्रों को 600 माइक्रोन पाचन बफर (12 एमएम सोडियम डिऑक्सीकोटेलेट (एसडीसी) /12 एमएम सोडियम लॉरॉयल सरकोसिनेट (एसएलएस) में रिस्सपेंड करें। निलंबन समरूप होने तक ट्यूब को सोनिकेट करें।
  13. बीसीए किट का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें और पाचन बफर के साथ एकाग्रता को 4 माइक्रोन/माइक्रोन में समायोजित करें। एक नई ट्यूब में lysate (400 μg प्रोटीन) के 100 μL स्थानांतरित करें।
  14. ट्यूब में 50 एमएम ट्राइथिलेलैम्बोनियम बाइकार्बोनेट (टीईबी) के 292 माइक्रोन और 8 माइक्रोन लिस-सी (2.5 यूनिट/एमएल) जोड़ें। 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट।
  15. ट्यूब में 8 माइक्रोन ट्राइप्सिन के साथ 50 mM TEAB के 100 माइक्रोन जोड़ें। 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट।
  16. ट्यूब में 10% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) के 25 माइक्रोन जोड़ें। भंवर और अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  17. सुपरनेट को डीसल्टिंग के लिए एक वातानुकूलित डीसलटिंग कॉलम में स्थानांतरित करें। वैक्यूम सेंट्रलाइज सासेंटर का उपयोग करके एलुएट को सुखा लें।
    नोट: मेथनॉल के 1 एमसीएल के साथ राल को सक्रिय करें और इसके बाद 80% एसीटोनिएट्रिल (एसीएन) में 0.1% टीएफए के 1 एमसीएल हों। 5% ACN में 0.1% टीएफए के कम से कम 3 एमएल के साथ कार्बनिक सॉल्वेंट को धोएं। कॉलम में चरण 1.16 में तैयार अम्लीय पेप्टाइड नमूनों को लोड करें और फिर कॉलम को 5% एसीएन में 0.1% टीएफए के कम से कम 3 एमएल के साथ धोएं। उच्च नमक सांद्रता वाले नमूनों के लिए अधिक वॉश की आवश्यकता हो सकती है। 80% एसीएन में 0.1% टीएफए के 1 एमसीएल के साथ फॉस्फोपेपाइड्स।

2. टैंडेम मास टैग (टीएमटी) लेबलिंग

  1. सूखे पेप्टाइड्स को 200 एमएम 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) के 100 माइक्रोल में फिर से खर्च करें- 1-पिपराज़ीनीथानेसुल्फोनिक एसिड (एचईपीई), पीएच 8.5।
  2. 40 μL में प्रत्येक चैनल (0.8 मिलीग्राम) के टीएमटी रिएजेंट को भंग करें। भंवर टीएमटी रिएजेंट ट्यूब को 5 मिनट के लिए और इसे स्पिन डाउन करें।
  3. नमूना ट्यूब के लिए टीएमटी के 40 μL स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: इस प्रयोग में, चैनल १२६ से १२८ मैनिटोल उपचार के बिना पौधों के तीन जैविक प्रतिकृति के साथ लेबल थे, और चैनल १२९ से १३१ मैनिटोल उपचार के साथ पौधों के तीन जैविक प्रतिकृति के साथ लेबल थे ।
  4. 15 मिनट के लिए 5% हाइड्रोक्सिलमाइन और इनक्यूबेट के 8 माइक्रोन जोड़ें।
  5. 5 एमएल ट्यूब में 6 नमूने मिलाएं और 10% टीएफए के 14 माइक्रोन जोड़ें।
  6. ट्यूब में 0.1% टीएफए के 3,876 माइक्रोन जोड़ें। भंवर और नीचे स्पिन।
  7. डिसल्टिंग के लिए एक वातानुकूलित डीसल्टिंग कॉलम में समाधान स्थानांतरित करें। वाष्पीकरण का उपयोग करके एलुएट को सुखा लें।

3. आईमैक स्टेज टिप की तैयारी

  1. पॉलीप्रोपाइलीन फ्रिट डिस्क में प्रवेश करने के लिए 16 जी कुंद-एंडेड सुई का उपयोग करें।
    नोट: डिस्क की सतह पर कटर लंबवत पकड़ो और कटर को एक-दो बार रोल करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि डिस्क पूरी तरह से उत्पादित है। स्टोरेज के लिए डिस्क को पेट्री डिश में रखें। सुई को 200 माइक्रोट टिप में रखें और एक प्लंजर का उपयोग करके फ्रिट को टिप में धकेल दें।
  2. टिप के अंत को कैप करने के लिए एक प्लंजर का उपयोग करके फ्रिट को धीरे-धीरे टिप में दबाएं।
    1. फ्रिट डिस्क को उसी दबाव के साथ टिप्स में रखें, जो बेहतर प्रजनन प्रदान करता है। स्टेज टिप्स उत्पादन की प्रजनन क्षमता निरंतर पीठ दबाव के लिए महत्वपूर्ण है, जो अपकेंद्रित्र चरणों के समय को प्रभावित करता है और तकनीकी प्रतिकृति के बीच प्रजनन क्षमता को प्रभावित करता है।
    2. यदि चरण सुझाव कंडीशनिंग चरण के दौरान उच्च पीठ दबाव दिखाते हैं, तो नमूने लोड करते समय संभावित टिप क्लोजिंग से बचने के लिए युक्तियों को त्यागें। यह हो सकता है कि डिस्क स्थिति में भी मुश्किल दबाया गया हो सकता है ।
  3. उलटा नी-एनटीए स्पिन कॉलम और एक 1.5 एमएल ट्यूब पर जगह है।
  4. नी-एनटीए मोतियों के फ्रिट को धीरे-धीरे दबाने और मोतियों को ट्यूब में धकेलने के लिए एक प्लंजर का उपयोग करें।
    नोट: स्पिन कॉलम पर संभावित मनका हानि या सोखने से बचने के लिए फ्रिट को धीरे से पुश करना सुनिश्चित करें।

4. हिमाचल प्रदेश-आरपी स्टेज टिप की तैयारी

  1. C8 डिस्क का उपयोग करके आईमैक स्टेज टिप के लिए वर्णित एचपी-आरपी स्टेज टिप तैयार करें।
    नोट: डिस्क पर बड़ी ताकत लागू न करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप घनी पैक फ्रिट हो सकता है और चरण टिप के पीछे का दबाव बढ़ सकता है। सभी अपकेंद्रित्र कदम 4 चरणों में 5 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर होते हैं।
  2. 100 माइक्रोन 100% मेथनॉल में C18 मोतियों की 1 मिलीग्राम निलंबित करें और टिप के माध्यम से मोतियों के समाधान को पारित करें।
  3. बफर 8 के 20 माइक्रोन (80% ACN/20% 200 mm NH4HCO2,पीएच 10.0) को स्टेज टिप में जोड़ें और अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से बफर 8 पास करें।
  4. स्टेज टिप में बफर ए (200 एमएम एनएच4एचसीओ2) के 20माइक्रोन जोड़ें और अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से बफर ए पास करें।
    नोट: उपयोग के दौरान अपकेंद्रित्र को संतुलित करें और सुनिश्चित करें कि एचपी-आरपी स्टेज टिप पूरी तरह से सूख न जाए।

5. स्पिन एडाप्टर की तैयारी

  1. 1.5 एमएल ट्यूब के ढक्कन के केंद्र में एक छेद को पंचर करने के लिए तेज अंत चिमटी का उपयोग करें।
  2. स्पिन एडाप्टर के छेद में आईमैक स्टेज टिप या एचपी-आरपी स्टेज टिप डालें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चरण टिप स्पिन एडाप्टर के नीचे के करीब नहीं है।

6. फास्फोपेप्टाइड संवर्धन आईमैक स्टेज टिप का उपयोग करके

  1. 10 मिलीग्राम नी-एनटीए मोतियों को लोडिंग बफर (6% एसीटिक एसिड (एए), पीएच 3.0) के 400 माइक्रोन के साथ निलंबित करें और प्रति टिप में मोतियों के समाधान के सभी लोड करें। अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से समाधान पारित करें।
    नोट: सभी अपकेंद्रित्र कदम चरण 6.8 चरण के अलावा चरण 6 में 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर होते हैं।
  2. आईमैक स्टेज टिप से निकल आयनों को पट्टी करने और अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से समाधान पारित करने के लिए 50 एमएम एथिलेंडियामाइनेट्राएक्टेटिक एसिड (ईडीटीए) के 100 माइक्रोल लोड करें।
  3. स्टेज टिप पर बफर लोड करने के 100 माइक्रोन लोड करें और अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से समाधान पारित करें।
  4. 6% एए में 50 mM FeCl3 के 100 माइक्रोन को स्टेज टिप पर लोड करें और अपकेंद्रण द्वारा टिप के माध्यम से समाधान पारित करें। Fe3 + आयनों IMAC मंच टिप करने के लिए चेलेट होगा।
  5. चरण टिप को कंडीशन करने के लिए बफर लोड करने के लिए 100 माइक्रोन लोड करें और अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से समाधान पारित करें।
  6. चरण टिप के लिए चरण 2.7 में तैयार नमूना पेप्टाइड्स के साथ बफर लोड करें और अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से समाधान पारित करें।
    नोट: नमूने के प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करने और भविष्य के विश्लेषण के लिए फ्रीजर में प्रवाह के माध्यम से स्टोर करने के लिए एक स्पिन एडाप्टर के रूप में एक नई ट्यूब लें।
  7. स्टेज टिप के लिए वाशिंग बफर (4.5% एए और 25% एसीएन) के 100 माइक्रोन लोड करें और अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से समाधान पारित करें।
  8. लोडिंग बफर के साथ दूसरा वॉश करें। स्टेज टिप पर बफर लोड करने के 100 माइक्रोन लोड करें और 3 मिनट के लिए 1000 × जी अपकेंद्रित्र का उपयोग करके टिप के माध्यम से समाधान पारित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि वॉशिंग बफर को स्प्यूशन स्टेप के दौरान फॉस्फोपेप्टाइड्स के नुकसान को खत्म करने के लिए स्टेज टिप में बफर लोड करके प्रतिस्थापित किया गया है। ACN की एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए फॉस्फोपेप्टाइड एल्यूशन से पहले आईमैक चरण टिप को बराबर करें 5% से नीचे है।
  9. एक कैंची के साथ सामने पर IMAC चरण टिप ट्रिम और हिमाचल प्रदेश-आरपी टिप के अंदर छंटनी की IMAC मंच टिप जगह है । सुनिश्चित करें कि स्टेज टिप्स की दो परतें अपकेंद्रित्र के ढक्कन को न छुएं।

7. हिमाचल प्रदेश-आरपी C18 चरण टिप का उपयोग कर फॉस्फोपेप्टाइड अंश

  1. छंटनी की गई आईमैक स्टेज टिप में एल्यूशन बफर (200 mm अमोनियम फॉस्फेट (एनएच4एच2पीओ4))के 100 माइक्रोन जोड़ें और अपकेंद्रण द्वारा स्टेज टिप्स की दो परतों के माध्यम से समाधान पारित करें।
    नोट: यदि समाधान चरण टिप के माध्यम से पारित नहीं होता है, तो स्पिन की गति को बढ़ाएं। सभी अपकेंद्रित्र कदम 7 चरणों में 5 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर होते हैं। सभी हिमाचल प्रदेश-आरपी बफ़र्स तालिका 1में सूचीबद्ध हैं ।
  2. चिमटी का उपयोग करके आईमैक स्टेज टिप को त्यागें और एचपी-आरपी स्टेज टिप में बफर ए के 20 माइक्रोन जोड़ें और अपकेंद्रित्र द्वारा टिप के माध्यम से बफर को पारित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी एल्यूशन बफर इसे त्यागने से पहले आईमैक चरण टिप से गुजरें।
  3. अंश 1 को elute करने के लिए बफर 1 के 20 μL जोड़ें और अपकेंद्रित्र द्वारा एक नई ट्यूब में eluate इकट्ठा । एक नई ट्यूब में प्रत्येक अंश को इकट्ठा करने के लिए बफ़र्स 2, 3, 4, 5, 6, 7 और 8 के साथ प्रक्रिया दोहराएं। वैक्यूम सांतुरी का उपयोग करके प्रत्येक अंश के अंतिम एल्यूएट को सुखा लें।
    नोट: ताजा अंश बफ़र्स तैयार करें। प्रत्येक अंश के स्पिन एडाप्टर के रूप में 8 नई ट्यूब लें। एक अलग स्पिन एडाप्टर में प्रत्येक अंश के एल्यूएट लीजिए। फॉस्फोपेप्टाइड्स बुनियादी परिस्थितियों में स्थिर नहीं होते हैं, इसलिए एलुएट्स को एक सांता या 10% टीएफए द्वारा तुरंत अम्लीय बनाकर सुखा लें।

8. एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण और डेटा विश्लेषण

  1. 0.1% फोर्मिक एसिड (एफए) के 5 माइक्रोन जोड़ें और एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा नमूने का विश्लेषण करें।
  2. प्रत्येक अंश के लिए 6-30% बफर बी (80% एसीएन और 0.1% एफए) के साथ 90 मिनट ढाल चलाएं।
  3. उच्च टकराव ऊर्जा वियोजन (एचसीडी) का उपयोग करके शीर्ष 10 लेबल पेप्टाइड्स को खंडित करें। फॉस्फोरिलेशन साइटों की पहचान करने के लिए डेटाबेस खोज पूरी करें।
  4. मैक्सक्विंट सॉफ्टवेयर में कच्ची फाइलों को लोड करें, प्रयोगों का नाम दें, और अंश और पीटीएम सेट करें।
    नोट: Maxquant सॉफ्टवेयर के ट्यूटोरियल https://www.maxquant.org/ पर पाया जा सकता है।
  5. आइसोकर्क लेबल के रूप में एलसी-एमएस/एमएस रन और 6प्लेक्स टीएमटी के प्रकार में रिपोर्टर आयन एमएस2 का चयन करें। पीआईएफ फ़ंक्शन द्वारा फ़िल्टर सक्षम करें और न्यूनतम पीआईएफ को 0.75 के रूप में सेट करें।
  6. वेरिएबल संशोधनों के पैनल में एसीटाइल (प्रोटीन एन-टर्म), ऑक्सीडेशन (एम), और फॉस्फो (एसटीटी) का चयन करें। निश्चित संशोधनों के रूप में कार्बामिडोमेथिल (सी) का चयन करें।
  7. पाचन मोड को विशिष्ट के रूप में सेट करें, पाचन एंजाइम के रूप में ट्रिप्सिन/पी का चयन करें, और दो चूक गए दरार।
  8. पीएसएम झूठी खोज दर (एफडीआर) और प्रोटीन एफडीआर को 0.01 के रूप में सेट करें। संशोधित पेप्टाइड्स के लिए न्यूनतम स्कोर 40 के रूप में सेट करें।
  9. फास्टा फ़ाइलों के पैनल में अरबीडोप्सिस थैलियाना डेटाबेस जोड़ें और डेटाबेस खोज चलाएं।
  10. खोज किया जाता है के रूप में Perspho (STY) साइटों की txt फ़ाइल Perseus सॉफ्टवेयर के लिए लोड करें।
    नोट: Perseus सॉफ्टवेयर के विस्तृत ट्यूटोरियल https://www.maxquant.org/perseus/ पर पाया जा सकता है।
  11. रिवर्स फॉस्फोरिलेशन साइटों को फ़िल्टर करें। स्थानीयकरण संभावना का उपयोग करके अनलोकलाइज्ड फॉस्फोरिलेशन साइटों को 75% कट-ऑफ के रूप में फ़िल्टर करें।
  12. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए फॉस्फोरिलेशन साइटों की तीव्रता का उपयोग करें।

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Representative Results

इस कार्यप्रवाह के प्रदर्शन को प्रदर्शित करने के लिए, हमने 30 मिनट के लिए मैनिटॉल उपचार के साथ या बिना मानव के साथ या बिना स्नर्क 2-डीईसी उत्परिवर्ती रोपण में फॉस्फोप्रोटेओमिक परिवर्तनों को मापने के लिए एचपी-आरपी स्टेज टिप आंशिकता के साथ मिलकर आईमैक स्टेज टिप का शोषण किया। प्रत्येक नमूना जैविक त्रिपाल में किया गया था, और प्रायोगिक कार्यप्रवाह चित्र 1में दर्शाया गया है। प्रत्येक नमूने के पचा पेप्टाइड्स (400 माइक्रोन) को एक टीएमटी-6प्लेक्स चैनल, पूल्ड और डेसाल्टेड के साथ लेबल किया गया था। फास्फोपेप्टाइड्स को आईमैक चरण टिप का उपयोग करके और समृद्ध किया गया था, और शुद्ध फॉस्फोपेंपाइड को बाद में एचपी-आरपी चरण टिप द्वारा आठ अंशों में बदल दिया गया था। प्रत्येक अंश का विश्लेषण 90 मिनट एलसी ढाल विश्लेषण द्वारा किया गया था। अरबीडोप्सिस थैलियाना डाटाबेस के खिलाफ सर्च इंजन का इस्तेमाल करते हुए कच्ची फाइलों की तलाशी ली गई ।

अरबीडोप्सिस फॉस्फोपेप्टोम के व्यापक कवरेज का संकेत देते हुए 6,852 स्थानीयकृत फॉस्फोरिलेशन साइटों (कक्षा 1, स्थानीयकरण संभावना और जीटी; 0.75) के साथ कुल 11,077 अद्वितीय फॉस्फोपेप्टाइड्स की पहचान की गई थी। कुल ८,१०७ और ७,२४८ फॉस्फोपेप्टाइड्स की पहचान क्रमशः वाइल्ड-टाइप और snrk2-dec उत्परिवर्ती नमूने से की गई थी । यह अरबीडोप्सिसमें सिग्नल ट्रांसडक्शन के वैश्विक दृष्टिकोण को चित्रित करने के लिए गहराई से कवरेज प्रदान करने में कार्यप्रवाह की दक्षता को दर्शाता है। हमने 8 अंशों में पहचाने गए फॉस्फोपेप्टाइड्स की संख्या की तुलना की। पहले दो अंशों, अंश 1 और 2 में कुछ फॉस्फोपेप्टाइड्स की पहचान की गई थी। हालांकि, अधिकांश फॉस्फोपेप्टाइड्स को बाकी 6 अंशों(चित्रा 2 ए)में समान रूप से वितरित किया गया था, यह सुझाव देता है कि यह दृष्टिकोण पौधे फॉस्फोप्रोटेम से जटिल फॉस्फोपेप्टाइड्स को अलग करने की क्षमता प्रदान करता है। इस कार्यप्रवाह की पृथक्करण दक्षता को और प्रदर्शित करने के लिए, हमने दो आसन्न अंशों (eq. F1-to-F2) के बीच फॉस्फोपप्डाइड्स के ओवरलैप का मूल्यांकन किया। 5% से कम फॉस्फोपेप्टिड्स आसन्न अंशों में ओवरलैप करते हैं, जो एचपी-आरपी स्टेज टिप(चित्रा 2B)की मजबूत अंश दक्षता का संकेत देता है।

वर्कफ़्लो द्वारा प्राप्त डेटा का उपयोग करके, हमने मैनिटोल उपचार पर जंगली प्रकार और snrk2-dec उत्परिवर्ती के फॉस्फोप्रोटेओमिक प्रोफाइल की तुलना की। जंगली प्रकार और snrk2-dec उत्परिवर्ती नमूने में मैनिटोल उपचार के बाद क्रमशः(चित्र 3)में कुल 433 और 380 फॉस्फोरिलेशन साइटों में वृद्धि हुई थी। इनमें से ३१२ फॉस्फोसाइट्स ने वाइल्ड-टाइप में इंडक्शन (एफडीआर < ०.०१) दिखाया, लेकिन snrk2-dec म्यूटेंट प्लांट्स में नहीं । जीन ओंटोलॉजी (जीओ) विश्लेषण से पता चला है कि फॉस्फोरिलेशन और प्रोटीन किनेज की सक्रियता, फॉस्फेट मेटाबोलिक प्रक्रिया का नियमन, सिग्नल ट्रांसडक्शन, SnRK2-निर्भर फॉस्फोप्रोटीन में काफी समृद्ध हैं । दिलचस्प बात यह है कि मूल विकास से संबंधित गो शब्द को SnRK2-निर्भर समूह में भी समृद्ध किया गया था, जो ऑस्मोटिक तनाव6के तहत रूट विकास मंदता के फेनोटाइप के अनुरूप था। हमने जंगली प्रकार और snrk2-dec उत्परिवर्ती दोनों में मैनिटोल उपचार द्वारा 116 फॉस्फोसाइट्स को भी पहचाना। ये फॉस्फोप्रोटीन SnRK2 से स्वतंत्र थे, या उम्मीदवार जो SnRK2s सक्रियण से पहले ऑस्मोटिक तनाव-ट्रिगर सिग्नलिंग में मध्यस्थता करते हैं। हमने देखा कि कई बी 4 उपसमूह RAFs जैसे RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050), और RAF42 (AT3G46920), काफी ऊपर थे ओस्मोटिक तनाव द्वारा विनियमित । आगे के अध्ययन से पता चला है कि आरएएफ किनासेस को ऑस्मोटिक तनाव द्वारा जल्दी से सक्रिय किया जाता है और फॉस्फोरिलेशन और SnRK2s20के सक्रियण के लिए आवश्यक होता है।

Figure 1
चित्रा 1: स्टेज टिप-आधारित फॉस्फोप्रोटेओमिक विधि का वर्कफ्लो। प्रोटीन को जंगली प्रकार और snrk2-dec उत्परिवर्ती रोपण के साथ या बिना मैनिटॉल के इलाज से निकाला और पचाया गया था। प्रत्येक दोहराने के पचा पेप्टाइड्स एक अद्वितीय TMT6-plex चैनल के साथ लेबल किया गया । फॉस्फोपेप्टाइड्स को जमा किया गया और फिर आईमैक चरण टिप का उपयोग करके समृद्ध किया गया। शुद्ध फॉस्फोपेप्टाइड्स को एचपी-आरपी स्टेज टिप से अलग किया गया था । प्रत्येक अंश का विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आईमैक स्टेज टिप और एचपी-आरपी अंश द्वारा जंगली प्रकार और snrk2 डिकुपल उत्परिवर्ती रोपण की फॉस्फोप्रोटेओमिक प्रोफाइलिंग। (क)प्रति अंश चिन्हित फॉस्फोपेप्टाइड्स की संख्या। (ख)स्टेज टिप बेस्ड एचपी-आरपी क्रोमेटोग्राफी की सेपरेशन एफिशिएंसी । आसन्न अंशों के बीच ओवरलैप आसन्न अंशों में पहचाने गए समान पेप्टाइड के प्रतिशत द्वारा दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ऑस्मोटिक तनाव के जवाब में फॉस्फोप्रोटेओमिक परिवर्तनों का मात्राकरण। ज्वालामुखी भूखंडों में(ए)जंगली प्रकार और(बी) snrk2-dec उत्परिवर्ती रोपण में मेनिटोल उपचार के जवाब में फॉस्फोरिलेशन साइटों के log2 गुना परिवर्तन दिखाते हैं । काला वृत्त मैनिटोल द्वारा प्रेरित किनेस फॉस्फोरिलेशन साइटों का प्रतिनिधित्व करता है। लाल सर्कल मैनिटोल के जवाब में आरआईएफ की फॉस्फोरिलेशन साइटों को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बफर ए 200 mm अमोनियम formate (NH4HCO2), पीएच 10.0.
बफर बी 100% एसीएन।
बफर 1 5% बफर बी, 95% बफर ए।
बफर 2 8% बफर बी, 92% बफर ए.
बफर 3 11% बफर बी, 89% बफर ए।
बफर 4 14% बफर बी, 86% बफर ए।
बफर 5 17% बफर बी, 83% बफर ए।
बफर 6 20% बफर बी, 80% बफर ए।
बफर 7 23% बफर बी, 77% बफर ए।
बफर 8 80% बफर बी, 20% बफर ए।

तालिका 1: हिमाचल प्रदेश-आरपी चरण टिप अंश के लिए बफ़र्स।

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Discussion

पौधे प्रोटेम और फॉस्फोप्रोटेम की गतिशील सीमा और जटिलता अभी भी फॉस्फोप्रोटेमिक्स विश्लेषणों की गहराई तक एक सीमित कारक है। 10,000 फॉस्फोरिलेशन साइटों21, 22की पहचान करने के लिए एकल रन एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण की क्षमता के बावजूद, पूरे संयंत्र फॉस्फोप्रोटेम का कवरेज अभी भी सीमित है। इसलिए, पर्यावरणीय तनाव के जवाब में संयंत्र सिग्नलिंग नेटवर्क के वैश्विक दृष्टिकोण की प्रोफाइलिंग में उच्च संवेदनशीलता और बेहतर पृथक्करण दक्षता प्रदान करने वाला एक फॉस्फोप्रोटेओमिक वर्कफ्लो की आवश्यकता होती है। एमएस विश्लेषण23,24से पहले पेप्टाइड जटिलता को कम करने के लिए वाणिज्यिक उच्च-दाब तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) कॉलम-आधारित क्रोमेटोग्राफी एक आम तरीका है। हालांकि, थकाऊ नमूना संग्रह कदम और बड़े एल्यूशन वॉल्यूम संवेदनशीलता और थ्रूपुट के मामले में एचपीएलसी-आधारित तरीकों की प्रमुख चुनौतियां हैं। उच्च संवेदनशीलता और उच्च-थ्रूपुट कार्यों के लिए पेप्टाइड पूर्व-अंश या संवर्धन को निष्पादित करने के लिए चरण टिप एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है। फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन और अंशीकरण के साथ मिलकर आइसोपनिक लेबलिंग का यह नया फॉस्फोप्रोटेमोमिक वर्कफ्लो25,26के अन्य फॉस्फोप्रोटेमिक वर्कफ्लो पर प्लांट फॉस्फोप्रोटेमिक वर्कफ्लो का बेहतर कवरेज और गहराई प्रदान करता है ।

नमूनों का पीएच मूल्य महत्वपूर्ण कारक है जो फॉस्फोपेप्टाइड्स की समृद्धि विशिष्टता निर्धारित करता है। पीएच मूल्य नमूना तैयार करने के पिछले चरण से प्रभावित हो सकता है, इसलिए नमूना लोड होने से पहले पीएच मूल्य की जांच करना आवश्यक है। यदि पीएच स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो पीएच को 3.0 में समायोजित करने के लिए नमूनों में एसिटिक एसिड या सोडियम हाइड्रोक्साइड जोड़ना। हम सी 18 चरण टिप पर फॉस्फोपेप्टाइड्स के एक साथ एल्यूशन और लोडिंग के लिए इस प्रोटोकॉल को निष्पादित करते हैं। इसलिए, एसीएन की एकाग्रता 5% से नीचे है यह सुनिश्चित करने के लिए फॉस्फोपेप्टाइड एल्यूशन से पहले आईमैक चरण टिप को बराबर करना महत्वपूर्ण है।

अंशों की संख्या जटिलता और नमूना आकार पर निर्भर है। आमतौर पर, पौधों में फॉस्फोपेप्टाइड पहचान का व्यापक कवरेज प्रदान करने के लिए 5 से 8 अंश पर्याप्त हैं। अंश बफ़र्स में एसीएन की एकाग्रता नमूनों की हाइड्रोफोबसिटी के अनुसार समायोजित की जा सकती है। अधिकांश फॉस्फोपेप्टाइड्स को 5% से 25% एसीएन एकाग्रता की सीमा का उपयोग करके C18 मोतियों से एल्यूट किया जाता है। फॉस्फेट समूह के अतिरिक्त नकारात्मक शुल्कों के कारण फॉस्फोपेप्टाइड्स आमतौर पर गैर-फॉस्फोरिलेटेड पेप्टाइड्स की तुलना में अधिक हाइड्रोफिलिक होते हैं। हालांकि, पेप्टाइड के एन-टर्मिनस पर टीएमटी रिएजेंट टैग करने से लेबल वाले पेप्टाइड्स27की हाइड्रोफोबसिटी में वृद्धि होती है, जो यह समझा सकता है कि हमारे मामले में पहले दो अंशों में कम फॉस्फोपेप्टाइड्स की पहचान क्यों की गई(चित्रा 2A)। इस प्रकार, टीएमटी-शून्य अभिवात और नमूनों के एक एलिकोट का उपयोग करके एक परीक्षण का उपयोग प्रत्येक अंश बफ़र्स में अंशों की संख्या और एसीएन एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। अनुकूलित बफ़र्स के परिणामस्वरूप टीएमटी-6प्लेक्स लेबल वाले फॉस्फोपेप्टाइड्स की बेहतर पृथक्करण दक्षता हो सकती है।

चरण टिप-आधारित अंशों की सीमाएं अंशों की संख्या और सुझावों की क्षमता हैं। चरण टिप पृथक्करण में अंशों की संख्या का विस्तार करना मुश्किल है क्योंकि मंच टिप अंश के लिए असतत ढाल बफ़र्स का उपयोग किया जाता है। दूसरी ओर, एक उच्च अंश संख्या प्राप्त करने के लिए एचपीएलसी कॉलम पर एक निरंतर ढाल लागू किया जा सकता है। सुझावों की क्षमता एक और कारक है जो चरण सुझावों के आवेदन को सीमित करता है। बड़े पैमाने पर फॉस्फोप्रोटेओमिक्स विश्लेषण (> 10 मिलीग्राम प्रोटीन) के लिए अधिक C18 मोतियों और अंशों के साथ पैक लंबी कॉलम लंबाई के साथ एचपीएलसी आधारित संवर्धन का उपयोग करना बेहतर है, जो मंच सुझावों के विश्लेषणात्मक पैमाने से परे है। एक साथ लिया गया, चरण टिप-आधारित फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन और अंश फॉस्फोप्रोटेमिक्स विश्लेषण के छोटे से मध्यम पैमाने के लिए एक उपयोगी तरीका है। मल्टीप्लेक्स क्वांटिफिकेशन हासिल करने के लिए इस अप्रोच को आइसोकरिक लेबलिंग के साथ इंटीग्रेट किया जा सकता है। परिणामों ने यह भी दर्शाया कि इसका उपयोग गहराई से पौधे फॉस्फोप्रोटेमिक्स प्रोफाइलिंग और क्वांटिफिकेशन के लिए किया जा सकता है । यह कार्यप्रवाह विशेष सिग्नलिंग नेटवर्क के चित्रण के लिए अन्य प्रजातियों और विभिन्न ऊतक प्रकारों पर लागू होता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज, ग्रांट XDB27040106 के स्ट्रैटेजिक प्रायोरिटी रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube eppendorf 22431081 Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes
200 µL pipet tip Gilson F1739311
2-chloroacetamide Sigma-Aldrich C0267
acetic acid Sigma-Aldrich 5438080100
acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
ammonium hydroxide Sigma-Aldrich 338818
ammonium phosphate monbasic Sigma-Aldrich 216003
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
blunt-ended needle Hamilton 90516 Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16
C18-AQ beads Dr. Maisch ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm
C8 Empore disk 3 M 2214 47 mm
Centrifuge eppendorf 22620444
chloroform Sigma-Aldrich CX1058
data analysis software Perseus 1.6.2.1 https://maxquant.net/perseus/
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich
formic acid Sigma-Aldrich 5330020050
Frits Agilent 12131024 Frits for SPE Cartridges
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich 50933
H2O Sigma-Aldrich 1153334000
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Iron (III) chloride Sigma-Aldrich 157740
LTQ-orbitrap Thermo Fisher Scientific Velos Pro
mass spectrometer Thermo Fisher Scientific LTQ-Orbitrap Velos Pro
methanol Sigma-Aldrich 34860
nano LC Thermo Fisher Scientific Easy-nLC 1000
Ni-NTA spin column Qiagen 31014
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L9150
plunger Hamilton 1122-01 Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl)
search engine software MaxQuant 1.5.4.1 https://www.maxquant.org
SEP-PAK Cartridge 50 mg Waters WAT054960
sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
SpeedVac Thermo Fisher Scientific SPD121P
TMT 6-plex Thermo Fisher Scientific 90061
Triethylammonium bicarbonate buffer Sigma-Aldrich T7408
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 91707
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma-Aldrich C4706
Trizma hydrochloride Sigma-Aldrich T3253

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References

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Hsu, C. C., Tsai, C. F., Tao, W. A., Wang, P. Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (160), e61489, doi:10.3791/61489 (2020).

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