Summary
يوفر البروتوكول المقدم هنا معلومات عن تخطيط كهربية الدماغ المتزامن (EEG) والتقييم السلوكي في الوقت الفعلي. لقد ناقشنا جميع الخطوات المتضمنة في هذا البروتوكول كحل جذاب للباحثين في العديد من مجالات علم الأعصاب ، لا سيما في مجالات التعلم والذاكرة.
Abstract
تم التعرف على سعة الموجات الدماغية التي تم الحصول عليها من تخطيط كهربية الدماغ (EEG) بشكل جيد كأساس للقدرة المعرفية والذاكرة والتعلم على الحيوانات والبشر. ترتبط آلية تكوين الخلايا العصبية للبالغين أيضا بالذاكرة وتحسين التعلم. تقليديا ، اعتاد الباحثون على تقييم معلمات التعلم والذاكرة في نماذج القوارض من خلال المهام السلوكية. لذلك ، فإن المراقبة المتزامنة للتغيرات السلوكية وتخطيط كهربية الدماغ مثيرة للاهتمام بشكل خاص في ربط البيانات بين نشاط الدماغ والسلوكيات المتعلقة بالمهام. ومع ذلك ، فإن معظم المعدات المطلوبة لإجراء كلتا الدراستين إما معقدة أو باهظة الثمن أو تستخدم شبكة إعداد سلكية تعيق حركة الحيوانات الطبيعية. في هذه الدراسة ، تم تسجيل EEG بجهاز الفيزيولوجيا الكهربية اللاسلكية جنبا إلى جنب مع تنفيذ مهمة التعرف على الأشياء الجديدة (NORT). تمت مراقبة سلوك الحيوان في وقت واحد بواسطة نظام تتبع الفيديو. تم تحليل كلا التسجيلين في وضع عدم الاتصال من خلال الطوابع الزمنية التي تمت مزامنتها لربط إشارات EEG بأفعال الحيوان. تتكون الموضوعات من فئران Wistar البالغة بعد معالجة التخصيب البيئي على المدى المتوسط. تم تثبيت ستة أقطاب كهربائية لولبية للجمجمة في أزواج على نصفي الكرة الأرضية فوق المناطق الأمامية والمركزية والجدارية وتم الرجوع إليها إلى قطب كهربائي يقع خلف عظم الأنف. يتكون بروتوكول NORT من تعريض الحيوان لكائنين متطابقين لمدة 10 دقائق. بعد 2 ساعة و 24 ساعة ، تم استبدال أحد الكائنات بآخر جديد. تمت مراقبة وقت الاستكشاف لكل كائن بواسطة برنامج تتبع سلوكي (BTS) وتسجيل بيانات EEG. يتكون تحليل EEG المتزامن مع البيانات السلوكية من تقديرات قوة النطاق النسبية ألفا وبيتا ومقارنات بين التعرف على الأشياء الجديدة مقابل استكشاف الأشياء المألوفة ، بين ثلاث مراحل تجريبية. في هذه المخطوطة ، ناقشنا عملية تصنيع الأقطاب الكهربائية ، وجراحة زرع الأقطاب الكهربائية فوق الجافية ، وبروتوكول الإثراء البيئي ، وبروتوكول NORT ، وإعداد BTS ، واقتران EEG - BTS للمراقبة المتزامنة في الوقت الفعلي ، وتحليل بيانات EEG بناء على الكشف التلقائي عن الأحداث.
Introduction
يعد الاختبار السلوكي أمرا بالغ الأهمية في أبحاث علم الأعصاب لكمية كبيرة من المعلومات التي يتم إنشاؤها في سياق في الجسم الحي. في هذا الصدد ، يستخدم الباحثون على نطاق واسع اختبارات سلوكية مختلفة لتحليل الوظيفة الحسية الحركية ، والتفاعلات الاجتماعية ، والسلوك الشبيه بالقلق والاكتئاب ، والاعتماد على المواد وأشكال مختلفة من الوظائف المعرفية1. قد يكون التسجيل اليدوي للاختبارات السلوكية صعبا ومرهقا وغير دقيق حتى بالنسبة لمعظم المراقبين الخبراء. على الرغم من بذل بعض الجهود لتطوير برامج مجانية ومفتوحة المصدر لتسجيل السلوك (على سبيل المثال ، تطبيق sexrat male2 للسلوك الجنسي) ، تسمح العديد من البدائل بالتسجيل السلوكي التلقائي وفي الوقت الفعلي لأنواع الحيوانات المختلفة من الأسماك3 إلى القوارض4،5،6. يعد تتبع الفيديو طريقة قيمة لتسجيل السلوك بسرعة ودقة المستخدمة في مجموعة متنوعة من التطبيقات7. ميزة أكثر احتمالا في منطقة التسجيل السلوكي هي استكشاف النشاط العصبي أثناء المظهر السلوكي. يمكن أن يوضح لنا التسجيل المتزامن للنشاط العصبي (من الخلايا المفردة إلى مناطق الدماغ الرئيسية) والمهام السلوكية كيف يولد الدماغ أنماطا سلوكية محددة8. السلوكيات هي سلسلة من المكونات الثانوية التي يمكن أن تكشف عن وجود ارتباطات بين النشاط العصبي والحركات أو الإجراءات. إذا كان من الممكن تسجيل النشاط العصبي والأنماط السلوكية في وقت واحد من خلال جداول زمنية متعددة ، فيمكنهم شرح كيفية ارتباط كل حالة دماغية بكل سلوك معين (للحصول على فحص أكثر تعمقا للتسجيل السلوكي ، انظر Datta et al. ، 2019 مراجعة8). لذلك ، يعتبر التسجيل المتزامن للنشاط السلوكي والعصبي على النطاق المطلوب (من الخلايا العصبية إلى مناطق واسعة من الدماغ) أداة مفيدة للغاية. هناك العديد من الأنظمة التي تهدف إلى دمج التسجيلات السلوكية مع القياسات الأخرى كنشاط عصبي 4,5.
على الرغم من أن تخطيط كهربية الدماغ يعتبر أحد أكثر التقنيات استخداما في مجال علم الأعصاب السريري والبحثي ، إلا أن الحركة العالية نسبيا ، بالإضافة إلى حجم جهاز تسجيل EEG ، تجعل هذه التقنية فريدة وصعبة للكشف في حالة النماذج في الجسم الحي9. تم تطوير بعض الحلول لهذه المشكلة ، على سبيل المثال ، استخدام الكابلات والأجهزة الدوارة التي تسمح للحيوانات بالتحرك بحرية في الساحة. ومع ذلك ، غالبا ما تفرض الأنظمة القائمة على الكابلات مشاكل لإجراء الدراسات ، على سبيل المثال ، أثناء نقل من قفص إلى آخر ، لوحظ وجود عائق أو تشابك للحيوان مع الكابلات. تم تطوير أجهزة القياس عن بعد للتسجيلات الكهربية اللاسلكية لزيادة مرونة حالة التسجيل10,11. ومع ذلك ، فقد أظهرت هذه الأنظمة قيودا كبيرة بسبب انخفاض عدد قنوات التسجيل وانخفاض معدلات أخذ العينات11. في هذه الدراسة ، استخدمنا نظاما لاسلكيا متاحا تجاريا يرسل إشارات EEG من الحيوان من خلال اتصال Wi-Fi مع نظام القوارض الذي يتحرك بحرية12. يزن الجهاز 6 جرامات ويقف حتى 16 قناة مسجلة عند 1 كيلو دولار في الثانية. يسمح هذا النظام بتسجيل EEG أو ارتفاع في البيئة الحيوانية ، مع تقليل الاضطراب ، حيث يعمل كحل اقتصادي مقارنة بالأنظمة الفيزيولوجية الكهربية التقليدية في السوق. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بمزامنة هذه البيانات باستخدام برنامج تتبع الفيديو لتوفير الارتباط بين EEG والأنماط السلوكية. تتم هذه المزامنة في وضع عدم الاتصال عن طريق محاذاة واستيفاء البيانات والأحداث بناء على الطوابع الزمنية التي تم إنشاؤها بواسطة كلا النظامين ويتم معالجتها على MATLAB.
يعرف تكوين الخلايا العصبية للبالغين بأنه الانتشار والبقاء والتمايز في الخلايا العصبية للخلايا المولدة حديثا في التلفيف المسنن للحيوانات13,14. من المعروف أن هذه العملية مرتبطة بتحسين الذاكرة والتعلم مما يزيد من تكوين الخلايا العصبية للبالغين في القوارض من خلال ظروف البيئة المخصبة (EE)15. يتكون EE من إيواء القوارض في مجموعات صغيرة داخل قفص كبير مزود بألعاب وأنابيب ، حيث يكون للحيوانات رواية ومعقدة ولكن ليس لها صلة بيولوجية15. على الرغم من أن EE يحفز تكوين الخلايا العصبية الحصين ، إلا أنه يختلف أيضا في العديد من العوامل مثل العمر أو إجهاد الحيوانات أو ظروف التحفيز المحددة أو إجراء الكشف عن تكوين الخلايا العصبية. في الفئران في منتصف العمر التي تعرضت لإسكان EE لمدة سبعة أيام ، تم الإبلاغ عن ولادة خلايا حبيبية جديدة (GC) في التلفيف المسنن الحصين (DG)16. اقترحت الدراسات التي تحاول استئصال تكوين الخلايا العصبية البالغة في الفئران البالغة بشكل انتقائي أن الخلايا الحبيبية الجديدة التي يبلغ عمرها حوالي 1-2 أسابيع مطلوبة في الاستجابة المكتسبة17. بعد حوالي 2 أو 3 أسابيع من ولادة GC عند البالغين DG ، تبدأ العديد من السمات المميزة مثل العمود الفقري التغصني ، والتي تعتبر ضرورية للانتقال المشبكي المثير18 ، في الظهور. أجرى Zhao et al. تحليلا كميا لإظهار أن ذروة نمو العمود الفقري تحدث خلال الأسابيع 3 - 4 الأولى19. تشير العديد من الدراسات الفيزيولوجية الكهربية في الجسم الحي إلى أن ثلاثة أسابيع فقط من ظروف السكن EE تنتج تغيرات في انتقال DG المشبكي وتزيد من استثارة الخلية20. أيضا ، تم الإبلاغ عن أن التعرض لبيئة غنية في 1-4 أسابيع بعد حقن BrdU زاد بشكل كبير من كثافة خلايا BrdU / NeuN في الطبقة الحبيبية DG في الفئران21. يقترح هؤلاء المؤلفون وجود فترة حرجة بين أسبوع وثلاثة أسابيع بعد التعرض ل EE حيث لوحظت زيادة كبيرة في عدد الخلايا العصبية الجديدة21. كانت دراسات تكوين الخلايا العصبية الحصينية للبالغين (AHN) في البشر مثيرة للجدل حيث لم يكن هناك دليل مباشر. ومع ذلك ، وصف تقرير حديث المراحل التنموية ل AHN في دماغ الإنسان البالغ ، وحدد الآلاف من الخلايا العصبية غير الناضجة في DG ، وبالتالي أظهر أهمية AHN أثناء الشيخوخة لدى البشر22. بناء على الأدلة المذكورة سابقا ، تعد دراسة AHN في النماذج الحيوانية أكثر أهمية من أي وقت مضى (لإجراء فحص أكثر تعمقا ل AHN ، انظر Leal-Galicia et al. ، 2019 review15).
كما ذكرنا سابقا ، تم ربط الحصين بوظيفة أساسية في قدرات التعلم والذاكرة. يمر تكوين الذكريات بثلاث عمليات متميزة: الترميز (اكتساب الذاكرة) ، والتوحيد (تخزين الذاكرة) ، والاسترجاع (التعرف على الذاكرة)23. يتم اختبار ذاكرة التعرف في البشر باستخدام مهمة المقارنات المزدوجة المرئية24. أساسيات النماذج البشرية والحيوانية للذاكرة وفقدان الذاكرة هي الاختبارات السلوكية التي تقيم القدرة على التعرف على المنبهات المقدمة سابقا25,26 ، كما تفعل مهمة المقارنات المزدوجة البصرية في البشر. لذلك ، فإن أحد الاختبارات السلوكية الأكثر استخداما لتقييم قدرة القوارض على التعرف على الحافز المقدم مسبقا ، أي أن قدرة التعلم والذاكرة هي مهمة التعرف على الأشياء الجديدة التلقائية (NORT)23,27. يتكون بروتوكول NORT من كائنين جديدين متطابقين في ساحة مألوفة لمدة 10 دقائق في تجربة الاستحواذ. بعد وقت محدد بين 0 28 و48 ساعة29 (وقت متغير وفقا لكل بروتوكول) ، يتم إرجاع الحيوان إلى نفس الساحة التي تحتوي على واحد من نفس الأشياء المألوفة ، وكائن جديد واحد. يستكشف الحيوان تلقائيا الكائن الجديد إذا تم حفظ الكائن المألوف26. ويشيع استخدام نسبة الأفضلية في تقييم أداء الاستكشاف. يتم تحديده بقسمة إجمالي وقت استكشاف الكائن من وقت استكشاف الرواية أو الكائن المألوف. يتمتع NORT ببعض المزايا مقارنة باختبارات ذاكرة التعرف الأخرى. الأهم من ذلك ، أنه لا يتطلب أي دافع خارجي أو مكافأة أو عقاب. لا يولد ظروفا مرهقة. أخيرا ، ليست هناك حاجة إلى تدريب لاستحضار سلوك استكشاف الأشياء (لمزيد من الفحص المتعمق ل NORT ، انظر المرجع 23).
لذلك ، فإن التسجيل المتزامن لطرائق البيانات المتعددة ودمجها في دراسة التعلم والذاكرة ، كتأثير لتكوين الخلايا العصبية الحصين للبالغين أمر جذاب للغاية ويوفر حلا مقنعا للباحثين في هذا المجال. سيكشف العمل الحالي جميع العمليات التي ينطوي عليها تقييم تتبع الفيديو السلوكي المتزامن (مهمة التعرف على الأشياء الجديدة) وتسجيل تخطيط كهربية الدماغ لاسلكيا. لقد استعرضنا هنا عملية تصنيع القطب الكهربائي ، وجراحة زرع الأقطاب الكهربائية فوق الجافية (برغي الجمجمة) ، وبروتوكول الإثراء البيئي (لتحريض تكوين الخلايا العصبية الحصين) ، بعد بروتوكول NORT ، وإعداد BTS ، واقتران EEG - BTS للمراقبة المتزامنة في الوقت الفعلي ، وتحليل بيانات EEG والسلوك المنفذة على بيئة حوسبة MATLAB.
Protocol
تتبع جميع الإجراءات دليل رعاية واستخدام المختبر (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 8023 ، المنقحة في عام 1978) التي تنفذها المؤسسات الصحية الوطنية والقوانين المكسيكية المحلية لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة لرعاية الحيوانات وحظر معاناة الحيوانات. وافقت لجنة الأخلاقيات في الجامعة الأيبيرية الأمريكية على البروتوكولات التجريبية لاستخدام الحيوانات في هذه الدراسة.
1. الإعداد العام
- قم بتثبيت برنامج التتبع السلوكي على جهاز كمبيوتر وفقا لتعليمات التصنيع.
- قم بتركيب الكاميرا فوق الجهاز مباشرة ، بحيث تكون متجهة لأسفل. يجب توصيل الكاميرا بالكمبيوتر.
- قم بتثبيت برنامج التشغيل المطلوب بواسطة الكاميرا (باتباع تعليمات التصنيع).
- إذا كانت الكاميرا تتضمن عدسة تكبير/تصغير، فاضبطها لتلائم شاشة الكاميرا تماما.
- قم بإيقاف تشغيل وضع التركيز البؤري التلقائي للكاميرا (AF) باتباع برنامج التصنيع.
- تأكد من أن الكاميرا تعمل بشكل صحيح في الوقت الفعلي واختبر وضع التقاط الفيديو حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
2. بروتوكول التخصيب البيئي (انظر الشكل 1)
ملاحظة: تم استخدام ذكور فئران Wistar البالغة من العمر ثلاثة أشهر في هذه التجربة وتم الحفاظ عليها في ظل ظروف الإضاءة المظلمة الطبيعية.
- ضع فراش نشارة الخشب في ساحة مربعة من الأكريليك الشفاف (500 × 500 × 500 مم).
- ضع ثلاثة أنواع مختلفة من الألعاب على الساحة لتتفاعل معها القوارض (على سبيل المثال ، عجلات النشاط ، والطابق المزدوج ، والسلالم ، وما إلى ذلك).
- أضف أربعة أنابيب PVC غير شفافة مقاس 2 بوصة وأربعة أنابيب PVC رمادية منحنية.
- توفير موزعات الطعام والماء مع إمكانية الوصول إلى الحيوانات.
- ضع ثلاثة قوارض لكل قفص داخل غرفة بيت الحيوان في ظل ظروف منتظمة.
- اترك الحيوانات في هذه الساحة للوقت المطلوب وفقا للبروتوكول المقابل. في هذه التجربة ، يجب أن تبقى الحيوانات داخل الساحة لمدة 20 يوما.
ملاحظة: بعد جراحة زرع القطب ، لا تعود الحيوانات إلى علاج التخصيب البيئي. بدلا من ذلك ، تم وضعهم في أقفاص واحدة حتى يتم الانتهاء من اختبار التعرف على الأشياء الجديدة.
3. عملية تصنيع الأقطاب الكهربائية
- قطع قطعة من الأسلاك النحاسية على حوالي 2 سم واستخدام ورق الصنفرة لفرك حوالي 0.5 سم من كل طرف.
- لف أحد طرفي السلك النحاسي برأس برغي صغير الحجم (أقطاب كهربائية) وتأكد من تثبيته بإحكام لأن هذه خطوة حاسمة. يجب ضمان الاتصال الصحيح بين كلتا المادتين لتجنب القطع الأثرية في إشارات EEG.
- أدخل الطرف الآخر على الطرف الطرفي للموصل وتأكد من تثبيته بشكل صحيح عن طريق التعزيز باستخدام ملقط رفيع. يجب أن يتصل هذا الطرف بكابل مكبر للصوت.
- قم بقياس الموصلية المناسبة من الطرف إلى المسمار باستخدام مقياس متعدد. تضمن هذه العملية تثبيت اتصال القطب بشكل صحيح.
4. جراحة زرع الأقطاب الكهربائية فوق الجافية (برغي الجمجمة)
ملاحظة: بعد 20 يوما من علاج التخصيب البيئي ، ستخضع الحيوانات لعملية جراحية باتباع الإجراء الموضح أدناه:
- حقن كوكتيل من الكيتامين / زيلازين (90/10 ملغ / كغ ، أي بي) للحيوان.
ملاحظة: لتجنب انسداد مجرى الهواء ، انتظر حتى يتوقف الجرذ عن الحركة ، ثم أخرجه من قفص السكن وضع الحيوان على سطح مستو. يتم حقن مضاد للالتهابات غير الستيرويدية (ميلوكسيكام 1 ملغ/كغ، s.c) ومضاد حيوي (إينروفلوكساسين 2.5 ملغ/كغ، p.o.) كمسكن وقائي. - بمجرد تخدير الجرذ بالكامل ، احلق منطقة رأس الفأر.
ملاحظة: تأكد من تخدير الحيوان تماما قبل متابعة الجراحة. قرصة بعناية واحدة من الساقين أو الذيل. إذا كان الحيوان يتفاعل مع التحفيز ، فانتظر بضع دقائق أخرى واضغط عليه مرة أخرى. إذا لم يتفاعل الحيوان مع القرص ، فانتقل إلى الخطوة التالية. في حالة توفر المعدات المطلوبة ، يوصى بشدة باستخدام التخدير الغازي (مثل الأيزوفلوران) ، حيث يتم معايرته بسهولة أكبر من أجل السلامة. - ضع الحيوان على الجهاز التجسيمي عن طريق تثبيت كلتا الأذنين أولا بقضبان الأذن (احرص على عدم إيذاء الأذن الداخلية للحيوان). أخيرا ، ضع الأسنان الأمامية فوق شريط العضة وقم بتأمين شريط الأنف.
ملاحظة: زود الحيوان بوسادة تدفئة لجميع العمليات الجراحية لأن التخدير المستخدم في هذا الإجراء عادة ما يسبب انخفاض حرارة الجسم ومشاكل في التنفس. - نظف الجزء العلوي من منطقة الرأس باستخدام ثلاث جولات متناوبة من الكلورهيكسيدين أو المقشر القائم على اليود متبوعا بمحلول ملحي أو شطف كحولي.
- تطبيق الليدوكائين تحت الجلد (20 ملغ/ مل) تحت جلد منطقة الرأس (0.5 مل).
- غرس قطرة من محلول العيون أو محلول ملحي في عيون كل كل 5-10 دقائق لمساعدتهم على عدم الجفاف.
- باستخدام مشرط ، قم بعمل شق يبلغ حوالي 2 سم من الاتجاه الأمامي إلى الاتجاه الخلفي لكشف المنطقة العليا من الجمجمة بشكل صحيح.
- سحب الجلد باستخدام المشابك البلدغ وكشط الأنسجة التي تغطي الجمجمة.
- تحديد وتسجيل إحداثيات bregma التي تم الحصول عليها.
- بدءا من Bregma ، باستخدام Paxinos المجسمة و Watson Atlas30 ، حدد موقع ووضع علامة على موضع كل نقطة من النقاط السبع (الإحداثيات) حيث سيتم تثبيت الأقطاب الكهربائية.
ملاحظة: في هذه التجربة ، مسامير F3 ، F4 (+2.0 مم من Bregma ، 2.25 مم جانبية من خط الوسط) ؛ مسامير C3 ، C4 (−3.0 مم من Bregma ، 2.75 مم جانبي من خط الوسط) ؛ وتم تركيب مسامير P3 ، P4 (−7.0 مم من Bregma ، 2.75 مم جانبية من خط الوسط). تم وضع المسمار السابع خلف عظم الأنف (NZ) ، كمرجع أرضي (انظر الشكل 2). - باستخدام أداة حفر متغيرة السرعة ، قم بعمل ثقب بحجم طرف 2 (طول 44.5 مم) على كل علامة من العلامات ، احرص على عدم اختراق الجمجمة بالكامل.
- أدخل القطب في الفتحة وقم بتثبيته في الجمجمة بعناية.
- كرر الخطوتين 4.10 و4.11 حتى يتم تثبيت جميع البراغي السبعة بشكل مناسب.
- إصلاح جميع مسامير 7 مع الطبقة الأولى من الاسمنت الأسنان. أدخل كل قطب كهربائي في الموصل. قم بتغطية الأسلاك بالكامل بطبقة ثانية من الأسمنت السني (سيمنع الحيوان من سحب البراغي) ، وأسفل الموصل. إذا لزم الأمر ، قم بتغطيتها بطبقة ثالثة من الأسمنت السني ، مع ترك موصل EEG نظيفا للحصول على اتصال مناسب ، بحيث يمكن توصيل جهاز EEG بشكل مناسب (انظر الشكل 3).
ملاحظة: بعد وضع كل زوج من البراغي الثنائية ، يمكن تثبيتها باستخدام الأسمنت السني (خطوة اختيارية). - اترك الفئران في رعاية ما بعد الجراحة بين عشية وضحاها. راقب الحيوان وزود الحيوان بوسادة تدفئة لمدة 1-2 ساعة بعد الجراحة لأن التخدير المستخدم في هذا الإجراء عادة ما يسبب انخفاض حرارة الجسم ومشاكل في التنفس.
- يتم تطبيق 50 مل/كغ/24 ساعة (جرعة صيانة) من المحلول الملحي تحت الجلد لمنع الجفاف. حقن مضادات الالتهاب غير الستيرويدية (ميلوكسيكام 2 ملغ/كغ، s.c) ومضاد حيوي (إينروفلوكساسين 5 ملغ/كغ، p.o.) بعد الجراحة ولمدة 24 ساعة القادمة.
- بعد الجراحة ، احتفظ بالفئران في أقفاص مفردة للشفاء التام خلال سبعة أيام قبل إجراء الاختبارات السلوكية.
- التلاعب بلطف الحيوان على أساس دوري (مرة واحدة على الأقل في اليوم) للمساعدة في الحد من التوتر في التلاعب في المستقبل. أثناء إمساك الفئران بيد واحدة ، يتم تطبيق ضغط الإصبع بلطف على الجزء الخلفي من الحيوان ، وتحريك الأصابع عبر الفراء. فحص جرح الرأس والحالة الصحية والسلوك بشكل عام ووزن الجسم لمدة أسبوع بعد الجراحة.
ملاحظة: إذا تم العثور على أي خلل أو علامات المرض / الإجهاد في الحيوان ، قم بإخطار الطبيب البيطري المسؤول. بعد هذه الفترة ، قم بإجراء اختبار التعرف على الأشياء الجديدة وتقنية تسجيل EEG.
5. اختبار التعرف على الأشياء الجديدة (NORT)
ملاحظة: بعد سبعة أيام من الجراحة ، انتقل إلى الاختبارات السلوكية. تم تنفيذ جميع الإجراءات السلوكية ، في التجربة المقدمة بين 14 ساعة و 00 دقيقة و 16 ساعة 00 دقيقة ، وهو ما يتوافق مع دورة ضوء الفئران.
- ضع سترة مصنوعة من قماش ناعم (يتم وضع جهاز EEG عليه أثناء الاختبار السلوكي) على الفئران. السماح بالتعود لمدة 2-3 أيام قبل إجراء الاختبار السلوكي.
- ضع ساحة مربعة من الأكريليك الأسود (500 × 500 × 500 مم) في غرفة تسجيل مضاءة بإضاءة خافتة.
- ثبت كائنين جديدين متطابقين في وسط أرضية الساحة باستخدام شريط على الوجهين (لمنع إزاحته من قبل الحيوانات). يجب أن تكون الأشياء على مسافة متساوية من بعضها البعض وجدران الساحة.
- نظف كل شيء جيدا مسبقا باستخدام 50٪ من الإيثانول ، وكذلك أرضية الساحة بعد كل تجربة (لتجنب الإشارات الشمية).
ملاحظة: قم دائما بنقل الحيوانات إلى غرف السكن (من غرفة بيت الحيوان إلى غرفة التجارب) قبل نصف ساعة على الأقل من بدء كل جلسة. بعد الانتهاء من جلسة التسجيل ، اترك الحيوانات في غرفة التجارب لمدة ساعة إضافية. هذا لتجنب الإجهاد الذي قد يؤثر على أداء هذا الاختبار. - قم بتوصيل جهاز EEG ، قبل بدء كل اختبار. قم بتقييد الحيوان برفق وأدخل الكبل بإحكام في الموصل الموجود على رأس الحيوان باستخدام مجموعة EEG المرفقة بظهر الحيوان (انظر الشكل 4). يسمح بوظيفة واحدة فقط.
ملاحظة: قد يساعد التلاعب اللطيف السابق بالحيوان في تقليل الإجهاد لدى الحيوانات أثناء إجراء الاتصال. خلاف ذلك ، يزيد خطر تلف الجهاز أو الحيوانات. قم بشحن بطارية الجهاز مسبقا بالكامل باستخدام منفذ USB. - مراحل اختبارات التعرف على الأشياء الجديدة
- التعود: تعامل مع الحيوان على فترات 5 دقائق لمدة يومين متتاليين ، وبعد ذلك مباشرة ، ضع الحيوان في الساحة (بدون أي أشياء) واسمح له بالاستكشاف لمدة 10 دقائق بحرية.
ملاحظة: قبل تنفيذ أي جلسات اختبار اكتساب وذاكرة ، تم التعامل مع الفئران بعناية وتوصيلها بجهاز EEG المقابل ، والذي تم إصلاحه بشكل صحيح قبل بدء الاختبار. - جلسة الاستحواذ: ضع الحيوان على الساحة التي تواجه أحد الجدران المقابلة للأشياء. اسمح للحيوانات بالاستكشاف بحرية لمدة 10 دقائق. انتقل إلى الخطوة 6.13 لتسجيل الاختبار باستخدام برنامج التتبع السلوكي.
ملاحظة: تأكد من أن جهاز EEG يحمل بشكل صحيح السترة المرفقة بالجزء الخلفي من الجرذ (لضمان التتبع الصحيح للحيوان). لمزيد من التعزيز ، استخدم الشريط اللاصق. - اختبار الذاكرة قصيرة المدى (SMT): استبدل أحد الكائنات بأي كائن آخر مختلف تماما في الشكل واللون والملمس. ضع الحيوان ، بعد 2 ساعة من جلسة الاستحواذ ، في الساحة التي تواجه أحد الجدران المقابلة للأشياء. اسمح للحيوان بالاستكشاف بحرية لمدة 10 دقائق. انتقل إلى الخطوة 6.13 لتسجيل الاختبار باستخدام برنامج التتبع السلوكي.
- اختبار الذاكرة طويلة المدى (LMT): استبدل الكائن المستخدم بأي كائن آخر مختلف تماما في الشكل واللون والملمس عن اختبار الذاكرة قصيرة المدى. ضع الحيوان بعد 24 ساعة من جلسة الاستحواذ ، في الساحة التي تواجه أحد الجدران المقابلة للأشياء. اسمح للحيوان بالاستكشاف بحرية لمدة 10 دقائق انتقل إلى الخطوة 6.13 لتسجيل الاختبار باستخدام برنامج التتبع السلوكي.
- التعود: تعامل مع الحيوان على فترات 5 دقائق لمدة يومين متتاليين ، وبعد ذلك مباشرة ، ضع الحيوان في الساحة (بدون أي أشياء) واسمح له بالاستكشاف لمدة 10 دقائق بحرية.
6. إعداد برنامج تتبع السلوك
- افتح برنامج تتبع السلوك.
- قم بتسجيل الدخول إلى الحساب باستخدام مستخدم المؤسسة وكلمة المرور.
- افتح الصنبور "تجربة فارغة جديدة" واختر اسما للبروتوكول (على سبيل المثال ، "NORT").
- حدد "وضع تتبع الفيديو".
ملاحظة: في هذه التجربة، يتم إعداد الكاميرا لبث الفيديو مباشرة لتتبعه. ومع ذلك ، هناك خيار إضافي لتحديد مقاطع الفيديو المسجلة مسبقا. - انتقل إلى "الجهاز". حدد مساحة الساحة ، عن طريق ضبط المستطيل البرتقالي على حدود الساحة المعروضة. حدد منطقة الكائن ، وقم بتركيب الدوائر البرتقالية عند حدود الكائنات داخل الساحة المسقطة من الكاميرا على الشاشة.
- قم بإعداد خط المسطرة المتحرك على المقياس إلى موضع على طول الصورة المعروف (الساحة). أدخل طول الكائن بالمليمترات في الخيار "طول خط المسطرة" في لوحة الإعدادات. في هذه الحالة ، تبلغ مساحة الساحة 500 × 500 مم.
- انتقل إلى "التتبع والسلوك". تابع إلى "المناطق". انقر فوق قائمة "إضافة عنصر" وحدد "منطقة جديدة". حدد منطقة الساحة وقم بتسمية المنطقة الجديدة (على سبيل المثال ، "الحقل").
- كرر الخطوة السابقة مع منطقة الكائنات وقم بتسمية المنطقة الجديدة (على سبيل المثال ، "الكائنات").
- انتقل إلى خيار "لون الحيوان" وحدد خيار "الحيوانات أخف من خلفية الجهاز".
ملاحظة: تم استخدام الفئران البيضاء (Wistar) لهذه التجربة. ومع ذلك ، يحتوي البرنامج على خيارات إضافية للباحثين الذين يستخدمون الفئران السوداء والمرقطة. يمكن استخدام كلا السلالتين من الحيوانات في نفس التجربة. - انتقل إلى "تتبع رأس الحيوان وذيله" وحدد "نعم ، أريد تتبع رأس الحيوان وذيله".
- انتقل إلى "الاختبار" | "المراحل" ، ومن القائمة "إضافة عنصر" ، حدد "مرحلة جديدة". قم بتسمية المرحلة الجديدة ، "الاستحواذ". حدد مدة المرحلة (على سبيل المثال ، 600 ثانية).
- كرر الخطوة السابقة من مرحلتي "اختبار الذاكرة قصيرة المدى" و "اختبار الذاكرة طويلة المدى".
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، جميع المراحل لها نفس المدة (10 دقائق). - انتقل إلى "الإجراءات". حدد الأحداث التي سيتم تتبعها لكل مرحلة (اكتساب ، اختبار الذاكرة قصيرة المدى ، واختبار الذاكرة طويلة المدى).
- ابدأ الاختبار (مع كل). انتقل إلى "الاختبارات" (في شريط القائمة العلوي) وحدد "إضافة اختبار (+)". قم بتعيين رقم للحيوان المراد اختباره (على سبيل المثال ، "1").
- حدد "تسجيل" وقم بتسمية الحيوانات والجلسة (على سبيل المثال ، "M1 Acq").
- قبل وضع الحيوان في الساحة ، انقر مرة واحدة على زر "تشغيل". سيتم عرض رسالة "في انتظار البدء".
- بعد وضع الحيوان في الساحة ، انقر مرة ثانية على زر "تشغيل". سيبدأ الاختبار وينتهي تلقائيا.
- كرر الخطوات 6.13-6.16 لاختبار الذاكرة قصيرة المدى (2 ساعة بعد جلسة الاكتساب) واختبار الذاكرة طويلة المدى (24 ساعة بعد جلسة الاكتساب).
7. إعداد جهاز الفيزيولوجيا الكهربية اللاسلكي
- قم بتوصيل المودم بمضيف كمبيوتر وقم بتشغيله. قم بإيقاف تشغيل أي جهاز شبكة آخر على جهاز الكمبيوتر. يفضل إسكات أي اتصال لاسلكي آخر في غرفة التسجيل مثل Bluetooth أو الهواتف المحمولة أو أجهزة المودم الأخرى أو حتى الهواتف اللاسلكية.
- قم بتوصيل مكبر الصوت بظهر الجرذ ، كما هو مذكور في الخطوة 5.5.
- قم بتشغيل جهاز EEG عن طريق توصيل البطارية.
ملاحظة: بعد 2 ثانية من توصيل الجهاز ، سيومض مؤشر LED أحمر على مضخم EEG ، مما يشير إلى أن الاتصال بالمودم نشط ، ثم سيتم تشغيل مؤشر LED الأخضر. في حالة نجاح الاتصال ، ستبدأ مؤشرات LED الموجودة على المودم في الوميض باستمرار. مكبر الصوت جاهز الآن لإرسال المعلومات إلى المودم. - قم بتشغيل برنامج EEG وقم بإعداده وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للاندماج في جهاز الحصول على EEG اللاسلكي
- اضغط على زر "بدء العرض". سيعرض برنامج EEG اكتساب الإشارة الفعلي.
ملاحظة: استخدم "إدارة مهام Windows" لتعيين وضع الأولوية "في الوقت الفعلي" لتجنب فقدان المعلومات أثناء التجربة.
8. تسجيل إشارة تخطيط كهربية الدماغ (EEG)
- بعد التحقق من أن برنامج EEG يحصل على البيانات ، قم بتشغيل برنامج التتبع السلوكي ، وقم بتعيين بروتوكول تجريبي للتحقق من أن الحيوان في منطقة المراقبة وأن الإعداد يعمل بشكل صحيح.
- في هذه المرحلة ، ابدأ تسجيل برنامج EEG بالضغط على زر "بدء التسجيل". بعد التحقق من تشغيل إشارة الاستحواذ ، ابدأ التجريب في BTS.
- بعد انتهاء التجربة ، ارجع إلى برنامج EEG وأوقف عملية التسجيل. سيتم حفظ التسجيل باستخدام اسم افتراضي يتكون من تاريخ التسجيل باستخدام التنسيق التالي: "yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". بشكل افتراضي ، يتم حفظ جميع التسجيلات في مجلد برنامج EEG (NeurophysData).
- تحقق من إنشاء كلا ملفي البيانات. سجل سجل التجربة أو غير الاسم لتجنب الالتباس.
9. المهمة السلوكية وتزامن إشارة EEG
- افتح MATLAB وقم بتنفيذ الأمر: convert_plx2mat. هذه الوظيفة ستفتح مربع المتصفح. يتم توفير وظائف التحويل من قبل الشركة المصنعة ويجب إضافتها إلى مسار MATLAB.
- حدد * .plx للتحويل واضغط على "Enter" في سطر أوامر MATLAB لتحويله إلى معلمات افتراضية.
- افتح ملف تجربة BTS وانتقل إلى "البروتوكول". انقر فوق الخيار "النتائج والتقارير والبيانات" وحدد جميع أحداث كلا الكائنين وانقر فوق "اختيار تنسيق الوقت للتقرير" ، وحدد الخيار الثالث: "إظهار أوقات الأحداث في الوقت الفعلي في HH: MM: SS.sss - على سبيل المثال 13: 20: 14.791."
- انتقل الآن إلى "ملف" وانقر على "تصدير" و "تصدير التجربة بتنسيق XML" ، وحدد "تاريخ ووقت الاختبار" ، وأخيرا انقر فوق "إنشاء XML".
- انتقل إلى "تصدير بيانات الاختبار" وانقر على "حفظ البيانات". سيتم إنشاء ملف .csv بأوقات الأحداث.
- كرر الخطوات من 9.1 إلى 9.5 لكل ملف. في حالتنا ، كانت التجارب الثلاث: ACQ و STM و LTM.
- بمجرد تحويل ملفات EEG والسلوك ، قم بتجميعها في مجلد واحد. يجب أن يحتوي المجلد على ستة ملفات وملفات .mat الثلاثة وثلاثة .csv على التوالي. في حالتنا ، تم استدعاء الملفات: PID_01_ACQ_N.mat و PID_02_STM_N.mat و PID_03_LTM_N.mat و PID_01_ACQ_M.csv و PID_02_STM_M.csv و PID_03_LTM_M.csv. يشير معرف إلى رقم تعريف الحيوان.
- افتح وظيفة "procesa_sujeto.m" باستخدام MATLAB ، واضبط السطر الثاني على معرف الحيوان.
- الآن انقل MATLAB إلى هذا المجلد وقم بتنفيذ: "procesa_sujeto" لإنشاء أشكال من النطاق النسبي ألفا وبيتا إلى الطاقة المرتبطة بالتعرف على الكائنات في مراحل ACQ و STM و LTM.
ملاحظة: "procesa_sujeto" هي دالة تقوم بتنفيذ/تشغيل العديد من تحليلات معالجة الإشارات. ويرد موجز لهذه التحليلات على النحو التالي في الخطوات من 9-10 إلى 9-15. - قم بتصفية كل إشارة EEG باستخدام مرشح تمرير النطاق الترددي Butterworth من الدرجة الرابعة عند [5-40] هرتز ، باستخدام تصحيح الطور.
- فحص بصريا الإشارات قبل التحليل التالي ، وتم استبعاد تلك القنوات ذات القطع الأثرية المشتقة من وضع الأقطاب الكهربائية المعيبة أو سوء الضبط بواسطة حركات الحيوانات من مزيد من التحليل.
- إشارات مرجعية إلى المتوسط المشترك للتخفيف من آثار الحركة.
- قم بتقسيم إشارات EEG لتشكيل عصور بطول 4 ثوان متزامنة مع طوابع زمنية مشتقة من BTS. كانت الأحداث المستهدفة هي استكشاف الكائن الذي تم تمييزه بمسافة الحيوان إلى حدود الأشياء. يتم وضع علامة على هذه الأحداث على الطوابع الزمنية BTS وتم استخدامها كمعرفات لإصلاح مواضع النوافذ. لذلك ، يتم تحديد عصور EEG بمقدار 1 ثانية قبل أن يبدأ الاستكشاف إلى 3 ثوان بعدها. في هذه المرحلة ، لم يتم استخدام أي تحقق من طول الاستكشاف ، ولكن سيتم النظر فيه في الأبحاث المستقبلية.
- تقدير كثافة القدرة الطيفية على تلك الحقبة باستخدام طريقة مخطط ويلش باستخدام طول النافذة 1 ثانية ، وهو تداخل بنسبة 90٪ ، نافذة هانينغ قبل تقدير تحويل فورييه ، مع هذه المعلمات تم تحقيق دقة 1 هرتز.
- قم بتقييم طيف القدرة على كل نطاق من خلال تقييم المساحة تحت مخطط الدورية ، والقيم المعروضة تتوافق مع الطاقة النسبية ، فهذا يعني أن طاقة كل نطاق EEG قد تم تقسيمها على إجمالي طاقة العصر. يقلل هذا الإجراء أيضا من التقديرات الخاطئة بسبب القطع الأثرية على إشارات EEG.
Representative Results
تم تطبيق الطرق الموضحة أعلاه لتسجيل EEG ونشاط الفئران في وقت واحد بعد معالجة الإثراء البيئي. كانت ذكور فئران ويستار البالغة من العمر ثلاثة أشهر تخضع لبروتوكول علاج التخصيب البيئي على المدى المتوسط لمدة 20 يوما ، وتم تشغيلها لإصلاح ستة أقطاب كهربائية لولبية للجمجمة مقترنة في المناطق الأمامية والمركزية والجدارية المشار إليها بقطب سابع يقع في نيوزيلندا. تم الحفاظ على الحيوانات في ظل ظروف الإضاءة المظلمة الطبيعية ، مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء. يوضح هذا العمل التكامل بين نظام EEG وبرنامج التتبع السلوكي للتسجيل المباشر المتزامن. استخدمنا فقط الحيوانات المعالجة بموجب بروتوكول EE لأننا لا نتظاهر بمقارنة فعالية العلاج ، ولكننا نمثل فقط مزايا المعدات. كدليل على أن بروتوكول الإسكان للتخصيب البيئي لمدة 20 يوما المستخدم يحفز تكوين الخلايا العصبية للبالغين ، نقدم بيانات عدد الخلايا الإيجابية BrdU من الحيوانات تحت EE والحيوانات الموجودة في ظل ظروف قياسية من البيانات غير المنشورة من مختبرنا. تم استخدام ذكور فئران Wistar البالغة من العمر ثلاثة أشهر. تم حقنهم ثلاث مرات مع BrdU مع 12 ساعة بين بعضها البعض. تم تخدير الحيوانات (بنتوباربيتال (50 مغ / كغ ، i.p.) والقتل الرحيم عن طريق التروية عبر القلب (انظر الشكل 5). للتأكد من أن السترة المرفقة بجهاز EEG لا تحد من حركات الحيوانات ، أجرينا اختبار المجال المفتوح (OFT) إلى مجموعتين ، خضعت مجموعة واحدة لعملية جراحية أثناء ارتداء الجهاز (سترة ومضخم EEG) ، وظلت المجموعة الأخرى من الحيوانات سليمة دون ارتداء الأجهزة. لم نجد اختلافات كبيرة في المسافة التي قطعتها الحيوانات في 10 دقائق من الاختبار (انظر الشكل 5). يتكون بروتوكول NORT النموذجي من عرض كائنين ، واستبدال أحدهما بكائن جديد. راقب برنامج التتبع السلوكي وقت الاستكشاف.
سجل برنامج التتبع السلوكي مجموعة من الحيوانات لتقييم معايير الأداء الرئيسية الخاصة بهم. لذلك ، استخدمنا ثلاثة معايير لتقييم أداء الاستكشاف. تم حساب نسبة التفضيل باستخدام الوقت الذي يقضيه رأس الحيوانات في منطقة الكائن ، والذي يبلغ عن إجمالي الوقت الذي يقضيه رأس الحيوانات في كل كائن. كما حسبنا نسبة تفضيل للوقت المستغرق في التحرك نحو العناصر، وهو ما يوضح إجمالي الوقت المستغرق في كل يتحرك نحو كل منطقة من مناطق الجسم. بالإضافة إلى ذلك ، تم حساب الوقت المستغرق لكل زيارة لكل كائن. يوضح الشكل 6 نتائج المعلمات الثلاثة المذكورة أعلاه. في تجربة الاستحواذ ، لم تكن هناك فروق بين الأشياء في المعلمات الثلاثة التي تم تقييمها: وقت الرأس في منطقة الكائن للتجارب الثلاث ، والوقت الذي يتحرك نحو الأشياء للتجارب الثلاث ، والوقت لكل زيارة في كل كائن. لم تكن هناك اختلافات في تجربة STM. وفي الوقت نفسه ، في تجربة LTM ، شوهدت نسبة استكشاف تفضيلية أعلى بكثير للكائن الجديد. بالإضافة إلى ذلك ، في تجربة LTM ، يمكن أيضا رؤية تفضيل الكائن الجديد في الوقت الذي يقضيه في كل زيارة (اللوحة C). يعرض الفيديو 1 مثالا تمثيليا لفأر مسجل في التجربة بينما يعرض الفيديو 2 مثالا تمثيليا لتخطيط كهربية الدماغ والتسجيل السلوكي المتزامن.
كان من الممكن مطابقة الأحداث الزمنية التي تم تتبعها مع التتبع السلوكي وتسجيل برنامج EEG باستخدام ساعة الكمبيوتر. يوضح الشكل 7 والشكل 8 التغيرات في القوة النسبية لتخطيط كهربية الدماغ على نطاقات ألفا وبيتا. ترتبط هذه بالتحكم في المحركات والتركيز والذاكرة ، مما يشير إلى أن الاستكشاف مرتبط فقط بهذه الوظائف. تظهر نتائج الحيوان 3 أن قوة ألفا تميل إلى الانخفاض على STM فيما يتعلق ب ACQ و LTM ، مما يشير إلى عدم التزامن المتعلق بالاستكشاف أو استرجاع الذاكرة. كان عدد التعرف على الكائنات (العصور المعالجة) منخفضا. عند هذه النقطة ، لا يمكن تحديد ما إذا كان الاختبار الإحصائي سيتحقق مما إذا كان هذا الاختلاف حقيقيا ، أو أن قطعة أثرية كانت قادرة على إنتاج مثل هذه الظروف التجريبية. ومع ذلك ، أصبح تجزئة العصور ووضع العلامات والتحليل ممكنا من خلال جدول زمني لأحداث الوسم المتزامنة في الحيوانات ونتائج EEG المنتجة لمشاريع البحث المستقبلية. إن الجمع بين هذه الأنظمة يمنع التحديد الخاطئ للأحداث من خلال عملية وضع العلامات اليدوية ، والتي أصبحت قضية مهمة في أغراض التجارب على الحيوانات. يمكن أن يرتبط الجمع بين BTS ونشاط الفيزيولوجيا الكهربية (EP) بدقة بسلوك الحيوان. ومع ذلك ، تتطلب الظروف التجريبية استخدام تقنيات معالجة الإشارات المتقدمة للقضاء على القطع الأثرية المتحركة وإجراء تحسينات في الإعداد التجريبي بشكل فعال.
الشكل 1: أمثلة على قفص ظروف البيئة المخصبة (EE). تم تزويد السكن بالألعاب والأنابيب ، حيث تجد الحيوانات رواية ومعقدة ولكن ليس لها أهمية بيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مواضع الأقطاب الكهربائية فوق الجافية في جمجمة الفئران. تم استخدام البراغي في وقت واحد كمرساة لسماعة الرأس وكأقطاب كهربائية. F = أمامي ؛ C = الجبهي ؛ P = جداري ؛ 3 = اليسار ؛ 4 = صحيح ؛ NZ = كمرجع أرضي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور تمثيلية لجراحة زرع أقطاب كهربائية فوق الجافية (برغي الجمجمة). صورة تظهر مسامير الأقطاب الكهربائية المزروعة داخل الجمجمة في الفئران في مراحل مختلفة من الجراحة. تأكد من اتباع تقنيات التعقيم أثناء تنفيذ هذا الإجراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية لفأر مع الإعداد التجريبي. تم صنع الجرذ لارتداء سترة متصلة بجهاز EEG مع بطارية مدمجة ، داخل الساحة المستخدمة لبروتوكول NORT. تظهر الصورة سماعة الرأس وموصل الكابل المثبت على فأر الرأس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: دليل على القدرة على الحركة ، وتحفيز تكوين الخلايا العصبية للبالغين بواسطة بروتوكول EE. (أ) صور تمثيلية للنشاط الحيواني لمدة 10 دقائق في اختبار المجال المفتوح (OFT) ومتوسط المسافة التي قطعتها الحيوانات التي ترتدي المعدات / الجراحة ، والحيوانات بدون المعدات / بدون جراحة. (ب - ه) قسم DG التمثيلي مع خلايا BrdU المسماة (مظلمة شديدة) ل EE ومجموعات الإسكان القياسية. تظهر اللوحات B و D تكبيرا منخفضا ل DG ، وتظهر اللوحات C و E منطقة الصندوق عند تكبير أعلى. اللوحات B و C هي أنسجة من مجموعة الإسكان EE ، واللوحات D و E من مجموعة الإسكان القياسية. يوضح الجزء الداخلي متوسط عدد الخلايا المسماة في كلتا المجموعتين. ML - الطبقة الجزيئية ؛ GCL – طبقة الخلايا الحبيبية; SGZ – منطقة تحت الحبيبية; الأسهم - خلايا BrdU +. توضح التمثيلات البيانية متوسط ± SEM. تم استخدام اختبار T-Student لمقارنة المجموعات. * ص≤0.05. لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في اختبار المجال المفتوح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: أداء الاستكشاف في تقييم NORT. (أ) وقت الانطلاق في منطقة الجسم للمحاكمات الثلاث. (ب) الزمن الذي يتحرك نحو أهداف المحاكمات الثلاث. (ج) الوقت لكل زيارة في كل كائن. توضح الرسوم البيانية متوسط ± SEM. تم استخدام مقاييس ANOVA المتكررة ثنائية الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة ل Sidak في جميع المعلمات. * p≤0.05 ، ** p≤0.01 بين الكائنات في التجربة المعنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: التغيرات في قدرة نطاق ألفا EEG المرتبطة بالاستكشاف. يوضح هذا الشكل التغيرات في قوة ألفا النسبية ، من نصف ثانية إلى 2.5 بعد أن يبدأ الحيوان في استكشاف الأجسام. تتوافق الرسوم البيانية الستة مع الأقطاب الأمامية والمركزية والجدارية (من الأعلى إلى الأسفل) والجانبين الأيسر والأيمن. تظهر مخططات الصندوق توزيع هذه السلسلة الزمنية لكل مجموعة شروط لكائن: "مألوف" و "رواية" ، والمرحلة: "ACQ" و "STM" و "LTM". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التغيرات في قدرة نطاق EEG بيتا المرتبطة بالاستكشاف. يوضح هذا الشكل التغيرات في قوة بيتا النسبية ، من نصف ثانية إلى 2.5 بعد أن يبدأ الحيوان في استكشاف الكائنات. تتوافق الرسوم البيانية الستة مع الأقطاب الأمامية والمركزية والجدارية (من الأعلى إلى الأسفل) والجانبين الأيسر والأيمن. تظهر مخططات الصندوق توزيع هذه السلسلة الزمنية لكل مجموعة شروط لكائن: "مألوف" و "رواية" ، والمرحلة: "ACQ" و "STM" و "LTM". يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: فيديو تمثيلي يظهر فأرا مسجلا في التجربة. كان الجرذ داخل الساحة المستخدمة لبروتوكول NORT. كان الجرذ يرتدي سترة متصلة بجهاز EEG مع بطارية مدمجة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الفيديو 2: فيديو تمثيلي يعرض تخطيط كهربية الدماغ والتسجيل السلوكي في وقت واحد. تم عرض إشارة EEG على الجانب الأيسر بينما تم عرض الاختبار السلوكي (NORT) على الجانب الأيمن من الفيديو. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Discussion
البحوث السلوكية وتخطيط كهربية الدماغ صعبة وصعبة بطبيعتها. لذلك ، فإن الجمع بين كلتا التقنيتين يمثل خطوات حاسمة مهمة. وبالتالي ، لا يتم استخدام كلتا التقنيتين المتزامنتين على نطاق واسع. في الممارسة الحقيقية ، تقوم كل مجموعة حول العالم بإجراء اختبارات سلوكية بظروف خاصة ، مثل الحيوانات أو المعلمات التي تم تحليلها أو العلاجات. ما سبق يخلق خلافات كبيرة في هذا المجال والحاجة إلى تطوير إجراءات موحدة متاحة للجميع. هنا ، قمنا بإعداد هذا الإجراء التفصيلي مع جميع الخطوات الحاسمة والاعتبارات المنهجية التي لا يتم وصفها أو ذكرها عادة في معظم المقالات المنشورة. وتناقش هذه المسائل أدناه.
يعد إنتاج المواد اللازمة خطوة أساسية في نجاح هذه التقنية. في هذا الصدد ، يجب بناء القطب من الصفر باستخدام مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ والكابلات النحاسية ولحام الفضة. يصعب لحام هذه المواد معا بشكل دائم ، بحيث يجب التحقق من موصلية وقوة كل قطب كهربائي قبل الاستخدام. من الممكن استخدام نوع آخر من الأسلاك لتجميع القطب ؛ ومع ذلك ، فإن النحاس مرن بما يكفي لمعالجة القطب لإدخاله في موصل مكبر الصوت. في هذا الصدد ، فإن استخدام الأقطاب الكهربائية التجارية أمر مرغوب فيه ، ولكن الحصول عليها قد يكون معقدا ومكلفا. الجراحة هي واحدة من أهم الخطوات في هذا البروتوكول. يوصى بشدة بل ومن الضروري أن يكون لديك جراح متمرس ، خاصة لزرع الأقطاب الكهربائية. نظرا لأن الجراحة تتطلب في كثير من الأحيان إطالة وقت التخدير وأحيانا تطبيق اللحام أثناء الجراحة ، يجب على كل مختبر إجراء الاختبارات اللازمة بالتخدير المناسب (يمكن استخدام كوكتيلات مختلفة) لكل سلالة من القوارض ، خاصة في ظل ظروف بيت الحيوان ، والاختلافات بين الفضلات ، وحتى الاختلافات الفردية بين الحيوانات. التخطيط السليم والنظر يمكن أن يمنع فقدان الحيوانات أثناء العمليات الجراحية. زرع الأقطاب الكهربائية هو خطوة حاسمة أخرى. يتطلب عناية كبيرة لتجنب لكم الجمجمة وتلف السحايا أو أنسجة المخ. يجب وضع البراغي بشكل صحيح ، أي تثبيتها تماما في الجمجمة وإلا سيتم تقديم الضوضاء والتحف على الإشارات ، مثل تلك المتعلقة بالموقع الترددي أو الحركة التي لا تستخدم تسجيل EEG. يجب دائما إجراء العلاج والظروف قبل وبعد الجراحة ومراعاتها لتجنب معاناة القوارض. يمكن استخدام يدوكائين تحت الجلد على جلد الرأس قبل إجراء شق بالمشرط. قطرة من المياه المالحة لعيون الحيوان ستساعد على منع الجفاف. أيضا ، يجب إعطاء محلول ملحي في الفم ، وبعد الجراحة ، يجب إعطاء 1 مل إما تحت الجلد أو داخل الصفاق لتعويض توازن السوائل في الحيوان ومنع الجفاف. بعد الجراحة مباشرة ، يجب إعطاء دواء مضاد للالتهابات (لتقليل الألم) ، وكذلك المضادات الحيوية عن طريق المضادات الحيوية تحت الجلد أو الموضعية ، مباشرة على محيط فروة الرأس حيث يوجد غطاء الأسمنت السني (لتقليل احتمالية الإصابة). كرر الإجراء أعلاه بعد 24 ساعة من الجراحة. يعد وضع مكبر صوت EEG على ظهر الحيوان هو الصعوبة الرئيسية للتسجيل المتزامن. يعتمد تصميم وتصنيع السترة على وجه التحديد على حجم الحيوانات. يجب أن تسمح السترة بالحركة الطبيعية للقوارض (انظر الشكل 5). سيضمن هذا الأخير الميزة الرئيسية لهذه التقنية ، وهي تسجيل الحركات الحرة. نظرا لأن الحيوانات لم تحاول إزالة السترة أو موصل الرأس أو الكابلات بعد الجراحة وخلال الأيام اللاحقة ، فقد افترض أن الإعداد لم يولد قيودا على الحركة بشكل كبير أو تسبب في ألم أو إزعاج. للحصول على تجزئة EEG الصحيحة في العصور بناء على الأحداث التي تم تمييزها بواسطة BTS ، من الضروري كتابة بروتوكول محدد جيدا. يمكن دمج العلامات المؤقتة عن طريق معالجة السلاسل الزمنية لأن كلا النظامين يستخدمان نفس الساعة لإعداد الطوابع الزمنية الخاصة بهما. ما سبق يوسع إمكانيات التجارب على الحيوانات التي تتضمن بيانات الفيزيولوجيا الكهربية للتحليل.
يمكن استخدام التقنية المعروضة هنا في أي مجال من مجالات أبحاث علم الأعصاب ومع أنواع الفئران الأكثر شيوعا وحتى الأنواع الأخرى. يعد تعدد استخدامات برنامج التتبع السلوكي أحد أهم المزايا حيث يمكن استخدامه في تنوع كبير في المتاهات مثل متاهة موريس المائية ، والمجال المفتوح ، والتعرف على الأشياء الجديدة ، وتفضيل المكان المشروط ، ولوحة الثقب ، والمتاهة المرتفعة بالإضافة إلى المتاهة ، ومتاهة Y ، ومتاهة الذراع الشعاعية ، ومتاهة بارنز ، وغيرها. يمكن استخدامه حتى 16 كاميرا في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الإبلاغ عن مئات التدابير المختلفة (لمزيد من المعلومات التفصيلية ، انظر الأدلة31,32). ضع في اعتبارك أن هذا العمل يصف التجريب لتسجيلات EEG ، وبعض التقنيات الأخرى مثل إمكانات الحقول المحلية أو التسجيل أحادي الوحدة ممكنة. ومع ذلك ، يجب على المستخدمين مراعاة أن الإعداد العام والعديد من الخطوات التحضيرية تحتاج إلى تغيير لأغراض أخرى. لذلك ، عند استخدام هذه التقنية مع تسجيل EEG Wi-Fi ، يتم توسيع الاحتمالات ، لأنها تضيف وجهات نظر جديدة للدراسات على الحيوانات مثل تلك التي أجريت على البشر لتقييم العديد من خصائص تكامل وديناميكيات EEG ، مثل الاتصال ، أو قوة نطاق EEG ، أو الاستجابات المثارة. على عكس البشر ، من الممكن إجراء التجارب على الحيوانات لتقييم إدارة الدواء أو تعديلات الجينات أو التعبير ، من بين العديد من النماذج التجريبية الأخرى. لتحليل EEG ، ضع في اعتبارك أن بعض البروتوكولات تحتوي على عدد قليل جدا من تكرار السلوكيات المرغوبة ، مما يقيد إمكانية متوسط الاستجابات والحصول على نتائج موثوقة. لذلك ، كن حريصا على تصميم بروتوكولات التسجيل والتحليل التي يعتبر تنفيذها قبل بدء التجربة. ومع ذلك ، يجب التفكير في أن العمل في التجارب على الحيوانات غير ممكن لمنع الحركة ، مما يزيد من تعقيد البروتوكول التجريبي واعتبارات تحليل الإشارات والمهام السلوكية. في الوقت الحالي ، معدات أنظمة التتبع الكاملة وتسجيلات EEG ليست موحدة أو معيارية ، مما يعني أن إعدادها يهدف إلى بروتوكول واحد وتعديلات لاستكشاف المهام السلوكية الأخرى ، مما يعني / يقترح تكاليف أعلى لعدد كبير من المختبرات. يمكن حل هذا الوضع باتباع الخيارات الموضحة في هذه الدراسة. ومع ذلك ، يمكن تحقيق العديد من التحسينات لإجراء تجارب أكثر موثوقية. يمكن تحسين العمل في عدة خطوات بدءا من تصنيع الأقطاب الكهربائية من خلال المعالجة السلوكية والإشارات. ومع ذلك ، فقد ثبت أن تتبع الحيوانات واكتساب EEG ممكنان باستخدام إعداد عالي التقنية بأسعار معقولة ولكنه غير مكلف.
باختصار ، العمل الحالي هو محاولة لمساعدة العلماء ، لا سيما في مجال علوم الأعصاب ، ليكونوا قادرين على استخدام هاتين التقنيتين اللتين لا يشيع استخدامهما معا. تتميز تقنية التسجيل المتزامن لتخطيط كهربية الدماغ والاختبار السلوكي باستخدام برنامج التتبع السلوكي بالعديد من المزايا ، ويمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص في العديد من مجالات علم الأعصاب ، لا سيما في مجالات التعلم والذاكرة. بالنظر إلى أن هذه المعدات لديها قدرات أخرى كتسجيل عميق للهياكل تحت القشرية مثل الحصين ، ولكن كما ذكرنا ، ستتغير العديد من الخطوات التحضيرية. تحل المعدات اللاسلكية تقريبا جميع قيود نهج الأسلاك التقليدية ، مثل مشاكل تنقل الحيوانات من قفص إلى آخر ، أو إعاقة الحيوانات أو تشابكها مع الكابلات. تقنية الإعداد هذه سهلة الاستخدام ، كما هو موضح أعلاه ، ويمكن لمجموعة غير مدربة أو غير متخصصة تقريبا من الخبراء أو الأفراد استخدام هذا البرنامج. سعر معدات EEG أقل من مضخم EEG العادي. يعد برنامج التتبع السلوكي أيضا أحد أكثر البرامج بأسعار معقولة لتتبع الفيديو في السوق. يتطلب هذا البرنامج تراخيص سنوية. يمكن استخدام المعدات في أكثر من إعداد تجريبي واحد ، مختلفة ، ونوع التنوع. نأمل أن يساعد هذا الجهد المجتمع العلمي ويوفر وصولا سهلا لدراسة السلوك وتخطيط كهربية الدماغ في وقت واحد.
Disclosures
تعمل الدكتورة سيلفيا أورتيغا مارتينيز كموظفة في شركة Stoelting Co. ، وهي شركة قدمت ورعت الإنتاج والوصول المفتوح إلى هذه المقالة.
Acknowledgments
ونود أن نشكر السيد ميغيل بورغوس والسيد غوستافو لاغو على تقديم المساعدة التقنية. ونحن ممتنون لشركة Stoelting لتغطيتها تكاليف إنتاج الفيديو، ولشركة Jinga-hi, Inc. لتقديمها المساعدة التقنية، وشعبة البحوث والأعمال التابعة للجامعة الأيبيرية الأمريكية في مدينة المكسيك لمنحها الأموال لهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
| #4 Scalpel and blade | |||
| 50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
| 8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
| 8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
| Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
| ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
| benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
| Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
| Camera | Logitech | c920 | |
| Copper wire | |||
| Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
| DELL PC | DELL | ||
| Electrode | |||
| JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
| Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
| MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
| Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
| Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
| Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
| Screws | |||
| Screws equiped with electrode | |||
| Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
| Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
| Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
| Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |
References
- Hånell, A., Marklund, N. Structured evaluation of rodent behavioral tests used in drug discovery research. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 1-13 (2014).
- Buenrostro-Jáuregui, M., et al. SEXRAT MALE: A smartphone and tablet application to annotate and process live sexual behavior in male rodents. Journal of Neuroscience Methods. 320, 9-15 (2019).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term behavioral tracking of freely swimming weakly electric fish. Journal of Visualized Experiments. (85), e50962 (2014).
- Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
- Zheng, W., Ycu, E. A. A fully automated and highly versatile system for testing multi-cognitive functions and recording neuronal activities in rodents. Journal of Visualized Experiments. (63), e3685 (2012).
- Melo-Thomas, L., et al. A wireless, bidirectional interface for in Vivo recording and stimulation of neural activity in freely behaving rats. Journal of Visualized Experiments. (129), e56299 (2017).
- Noldus, L. P. J. J., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. J. Ethovision Video Tracking System. Behavior Research Methods, Instruments, and Computers. 33 (3), 398-414 (2001).
- Datta, S. R., Anderson, D. J., Branson, K., Perona, P., Leifer, A. Computational Neuroethology: A Call to Action. Neuron. 104 (1), 11-24 (2019).
- Medlej, Y., et al. Enhanced setup for wired continuous long-term EEG monitoring in juvenile and adult rats: application for epilepsy and other disorders. BMC Neuroscience. 20, 8 (2019).
- Weiergräber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
- Etholm, L., Arabadzisz, D., Lipp, H. P., Heggelund, P. Seizure logging: A new approach to synchronized cable-free EEG and video recordings of seizure activity in mice. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 254-260 (2010).
- Jinga-hi. JAGA16 Wireless Electrophysiology Recording Device. , Available from: https://www.jinga-hi.com/hardware-jaga16 1 (2020).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Bruel-Jungerman, E., Laroche, S., Rampon, C. New neurons in the dentate gyrus are involved in the expression of enhanced long-term memory following environmental enrichment. European Journal of Neuroscience. 21 (2), 513-521 (2005).
- Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).
- Trinchero, M. F., Herrero, M., Monzón-Salinas, M. C., Schinder, A. F. Experience-Dependent Structural Plasticity of Adult-Born Neurons in the Aging Hippocampus. Frontiers in Neuroscience. 13, 739 (2019).
- Shors, T. J., et al. Erratum: Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories (Nature (2001) 410 (372-376)). Nature. 414 (6866), 938 (2001).
- Song, H., et al. New neurons in the adult mammalian brain: Synaptogenesis and functional integration. Journal of Neuroscience. 25 (45), 10366-10368 (2005).
- Zhao, C., Teng, E. M., Summers, R. G., Ming, G. L., Gage, F. H. Distinct morphological stages of dentate granule neuron maturation in the adult mouse hippocampus. Journal of Neuroscience. 26 (1), 3-11 (2006).
- Irvine, G. I., Logan, B., Ecket, M., Abraham, W. C. Enriched environment exposure regulates excitability, synaptic transmission, and LTP in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 16 (2), 149-160 (2006).
- Tashiro, A., Makino, H., Gage, F. H. Experience-specific functional modification of the dentate gyrus through adult neurogenesis: A critical period during an immature stage. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3252-3259 (2007).
- Moreno-Jiménez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavioural Brain Research. 285, 105-117 (2015).
- Fagan, J. Memory in the infant. Journal of Experimental Child Psychology. 9 (2), 217-226 (1970).
- Baxter, M. G., et al. I've seen it all before" Explaining age-related impairments in object recognition. Theoretical comment on Burke et al. Behavioral Neuroscience. 124 (5), 706-709 (2010).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: Neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 31 (1), 47-59 (1988).
- Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
- Forwood, S. E., Winters, B. D., Bussey, T. J. Hippocampal lesions that abolish spatial maze performance spare object recognition memory at delays of up 48 hours. Hippocampus. 15 (3), 347-355 (2005).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
- Stoelting Co. Getting started with ANY-maze Setting up and starting work with ANY-maze. , Available from: https://www.braintreesci.com/images/ANYMaze.pdf (2006).
- Stoelting Co. A detailed description of the ANY-maze measures. , Available from: https://www.anymaze.co.uk/a-detailed-description-of-the-any-maze-measures.pdf (2010).
