Summary
Het hier gepresenteerde protocol geeft informatie over de gelijktijdige elektro-encefalografie (EEG) en gedragsbeoordeling in realtime. We hebben alle stappen in dit protocol besproken als een aantrekkelijke oplossing voor onderzoekers op vele gebieden van de neurowetenschappen, met name op het gebied van leren en geheugen.
Abstract
Hersengolven amplitude verkregen uit elektro-encefalografie (EEG) is goed erkend als een basis voor cognitieve capaciteit, geheugen en leren op dieren en mensen. Het neurogenesemechanisme voor volwassenen is ook gekoppeld aan geheugen- en leerverbetering. Traditioneel gebruikten onderzoekers om leer- en geheugenparameters in knaagdiermodellen te beoordelen op basis van gedragstaken. Daarom is het gelijktijdig monitoren van gedragsveranderingen en EEG bijzonder interessant in het correleren van gegevens tussen hersenactiviteit en taakgerelateerd gedrag. De meeste apparatuur die nodig is om beide onderzoeken uit te voeren, is echter complex, duur of maakt gebruik van een bekabeld installatienetwerk dat de beweging van de natuurlijke dieren belemmert. In deze studie werd EEG opgenomen met een draadloos elektrofysiologisch apparaat samen met de uitvoering van een nieuwe objectherkenningstaak (NORT). Het gedrag van het dier werd gelijktijdig gevolgd door een videovolgsysteem. Beide opnames werden offline geanalyseerd door hun tijdstempels die werden gesynchroniseerd om EEG-signalen te koppelen aan de acties van het dier. De proefpersonen bestaan uit volwassen Wistar-ratten na een behandeling met omgevingsverrijking op middellange termijn. Zes schedelschroefelektroden werden in paren op beide hemisferen over frontale, centrale en pariëtale gebieden bevestigd en werden verwezen naar een elektrode die zich achter het neusbeen bevond. NORT-protocol bestaat uit het blootstellen van het dier aan twee identieke objecten gedurende 10 minuten. Na 2 uur en 24 uur werd een van de objecten vervangen door een nieuw object. De exploratietijd voor elk object werd gemonitord door een gedragsvolgsoftware (BTS) en EEG-gegevensregistratie. De analyse van het EEG gesynchroniseerd met gedragsgegevens bestaat uit schattingen van de relatieve alfa- en bètabandkracht en vergelijkingen tussen nieuwe objectherkenning versus verkenning van bekende objecten, tussen drie experimentele stadia. In dit manuscript hebben we het productieproces van elektroden, implantatiechirurgie van epidurale elektroden, omgevingsverrijkingsprotocol, NORT-protocol, BTS-opstelling, EEG - BTS-koppeling voor gelijktijdige monitoring in realtime en EEG-gegevensanalyse op basis van automatische detectie van gebeurtenissen besproken.
Introduction
Gedragstest is cruciaal in neurowetenschappelijk onderzoek voor een grote hoeveelheid informatie gegenereerd in een in vivo context. In dit opzicht hebben onderzoekers op grote schaal verschillende gedragstests gebruikt om sensorisch-motorische functie, sociale interacties, angstachtig en depressief gedrag, middelenafhankelijkheid en verschillende vormen van cognitieve functies te analyseren1. Handmatige registratie van gedragstests kan moeilijk, vermoeiend en onnauwkeurig zijn, zelfs voor de meeste deskundige waarnemers. Hoewel er enige inspanningen zijn geleverd om gratis en open-source software voor gedragsregistratie te ontwikkelen (bijv. Sexrat male2-app voor seksueel gedrag), maken verschillende alternatieven de automatische en realtime gedragsregistratie van verschillende diersoorten mogelijk, van vis3 tot knaagdieren 4,5,6. Videotracking is een waardevolle methode voor snelle en nauwkeurige gedragsopname die wordt gebruikt in een breed scala aan toepassingen7. Een meer potentiële functie in het gebied van gedragsopname is het verkennen van neurale activiteit tijdens de gedragsmanifestatie. Gelijktijdige registratie van neuronale activiteit (van afzonderlijke cellen tot de belangrijkste hersengebieden) en gedragstaken kan ons laten zien hoe de hersenen specifieke gedragspatronen genereren8. Gedrag is een opeenvolging van kleine componenten die correlaties kunnen onthullen tussen de neurale activiteit en bewegingen of acties. Als neuronale activiteit en gedragspatronen tegelijkertijd kunnen worden vastgelegd via meerdere tijdschalen, zouden ze kunnen verklaren hoe elke hersentoestand correleert met elk bepaald gedrag (voor een diepgaander onderzoek van gedragsregistratie, zie Datta et al., 2019 review8). Daarom wordt gesynchroniseerde registratie van gedrags- en neuronale activiteit op de gewenste schaal (van neuronen tot grote delen van de hersenen) beschouwd als een uiterst nuttig hulpmiddel. Er zijn verschillende systemen bedoeld om gedragsopnames te integreren met andere metingen als neurale activiteit 4,5.
Hoewel elektro-encefalografie wordt beschouwd als een van de meest gebruikte technieken op het gebied van klinische en onderzoeksneurowetenschappen, maakt de relatief hoge mobiliteit, evenals de grootte van het EEG-opnameapparaat, deze techniek uniek en uitdagend voor detectie in het geval van in vivo modellen9. Sommige oplossingen voor dit probleem zijn ontwikkeld, bijvoorbeeld het gebruik van kabels en draaibare apparaten waarmee dieren vrij kunnen bewegen in de arena. Niettemin leveren kabelgebaseerde systemen vaak problemen op om studies uit te voeren, bijvoorbeeld tijdens het overbrengen van een dier van de ene kooi naar de andere, wordt hinder of verstrengeling van het dier met de kabels waargenomen. Telemetrische apparaten zijn ontwikkeld voor draadloze elektrofysiologische opnames om de flexibiliteit van de opnamesituatie te vergroten10,11. Dergelijke systemen hebben echter aanzienlijke beperkingen vertoond vanwege hun lage aantal opnamekanalen en lage bemonsteringsfrequenties11. In deze studie gebruikten we een in de handel verkrijgbaar draadloos systeem dat EEG-signalen van het dier verzendt via een Wi-Fi-verbinding met een vrij bewegend knaagdiersysteem12. Het apparaat weegt 6 gram en staat tot 16 kanalen opgenomen met 1 kSps. Dit systeem maakt EEG- of spike-registratie in de dierlijke omgeving mogelijk, met een verminderde verstoring, en dient als een economische oplossing in vergelijking met de traditionele elektrofysiologische systemen op de markt. Bovendien hebben we deze gegevens gesynchroniseerd met behulp van een videotrackingsoftware om correlatie te bieden tussen EEG en gedragspatronen. Deze synchronisatie gebeurt offline door uitlijning en interpolatie van gegevens en gebeurtenissen op basis van tijdstempels die door beide systemen worden gegenereerd en wordt verwerkt op MATLAB.
Volwassen neurogenese wordt gedefinieerd als de proliferatie, overleving en differentiatie in neuronen van nieuw gegenereerde cellen in de gyrus dentate van dieren13,14. Van dit proces is bekend dat het geassocieerd is met geheugen- en leerverbetering die de volwassen neurogenese bij knaagdieren verhoogt door verrijkte omgeving (EE) -omstandigheden15. EE bestaat uit het huisvesten van knaagdieren in kleine groepen in een grote kooi voorzien van speelgoed en buizen, waar dieren nieuwe en complexe maar geen biologische relevantie hebben15. Hoewel EE hippocampale neurogenese stimuleert, varieert het ook in vele factoren, zoals leeftijd, dierlijke stam, specifieke stimulatieomstandigheden of neurogenesedetectieprocedure. Bij muizen van middelbare leeftijd die gedurende zeven dagen werden blootgesteld aan EE-huisvesting, is de geboorte van nieuwe granulaire cellen (GC) in de gyrus hippocampale dentate (DG) gemeld16. Studies die proberen volwassen neurogenese bij volwassen ratten selectief te aborteren, hebben gesuggereerd dat nieuwe granulaire cellen van ongeveer 1 - 2 weken oud nodig zijn in de aangeleerde respons17. Ongeveer 2 of 3 weken nadat de GC bij volwassenen DG is geboren, beginnen verschillende karakteristieke kenmerken zoals dendritische stekels, die essentieel zijn voor exciterende synaptische transmissie18, te verschijnen. Zhao et al. voerden een kwantitatieve analyse uit om aan te tonen dat de piek van de wervelkolomgroei optreedt tijdens de eerste 3 - 4 weken19. Verschillende elektrofysiologische in vivo studies suggereren dat slechts drie weken EE-huisvestingsomstandigheden veranderingen in de synaptische transmissie van de DG veroorzaken en de prikkelbaarheid van cellen verhogen20. Ook is gemeld dat blootstelling aan een verrijkte omgeving 1-4 weken na BrdU-injecties de dichtheid van BrdU / NeuN-cellen in de DG-korrellaag bij muizen aanzienlijk verhoogde21. Deze auteurs suggereren dat er een kritieke periode bestaat tussen één en drie weken na EE-blootstelling, omdat een aanzienlijke toename van het aantal nieuwe neuronen werd waargenomen21. Studies van volwassen hippocampale neurogenese (AHN) bij mensen zijn controversieel omdat er geen direct bewijs was. Een recent rapport beschreef echter de ontwikkelingsstadia van AHN in het menselijke volwassen brein, identificeerde duizenden onrijpe neuronen in de DG en toonde daarmee het belang van AHN aan tijdens veroudering bij mensen22. Op basis van het eerder genoemde bewijsmateriaal is de studie van AHN in diermodellen belangrijker dan ooit (voor een diepgaander onderzoek van AHN, zie Leal-Galicia et al., 2019 review15).
Zoals eerder vermeld, is de hippocampus gekoppeld aan een fundamentele functie in leer- en geheugencapaciteiten. De vorming van herinneringen doorloopt drie verschillende processen: codering (geheugenverwerving), consolidatie (geheugenopslag) en ophalen (geheugenherkenning)23. Herkenningsgeheugen bij mensen wordt getest met behulp van de visuele gepaarde vergelijkingstaak24. De fundamenten van menselijke en dierlijke modellen van geheugen en geheugenverlies zijn de gedragstests die het vermogen beoordelen om een eerder gepresenteerde stimuli25,26 te herkennen, zoals de visuele gepaarde vergelijkingstaak bij mensen doet. Daarom is een van de meest gebruikte gedragstests voor het beoordelen van het vermogen van een knaagdier om een eerder gepresenteerde stimulus te herkennen, dat wil zeggen de leer- en geheugencapaciteit, de spontane nieuwe objectherkenningstaak (NORT)23,27. NORT-protocol bestaat uit twee identieke nieuwe objecten in een bekende arena gedurende 10 minuten in de acquisitieproef. Na een specifieke tijd tussen 0 28 en48 uur29 (variabele tijd volgens elk protocol), wordt het dier teruggebracht naar dezelfde arena met een van dezelfde bekende objecten en een nieuw object. Het dier verkent spontaan het nieuwe object als het bekende object uit het hoofd is geleerd26. De voorkeursverhouding wordt vaak gebruikt bij het beoordelen van exploratieprestaties. Het wordt bepaald door de totale objectverkenningstijd te delen van de verkenningstijd van het nieuwe of bekende object. De NORT heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere herkenningsgeheugentests. Het belangrijkste is dat het geen externe motivatie, beloning of straf vereist. Het genereert geen stressvolle omstandigheden. Ten slotte is er geen training nodig om het gedrag van het verkennen van de objecten op te roepen (voor een meer diepgaand onderzoek van NORT, zie ref.23).
Daarom is gelijktijdige registratie van meerdere gegevensmodaliteiten en hun integratie in de studie van leren en geheugen, als een effect van volwassen hippocampusneurogenese, zeer aantrekkelijk en biedt het een overtuigende oplossing voor onderzoekers in het veld. Het huidige werk zal alle processen blootleggen die betrokken zijn bij de gelijktijdige gedragsmatige video-tracking beoordeling (nieuwe objectherkenningstaak) en draadloze elektro-encefalografie-opname. Hier hebben we het elektrodeproductieproces, epidurale (schedelschroef) elektrodenimplantatiechirurgie, omgevingsverrijkingsprotocol (voor hippocampale neurogenese-inductie), volgens NORT-protocol, BTS-opstelling, EEG - BTS-koppeling voor gelijktijdige monitoring in realtime en EEG- en gedragsgegevensanalyse uitgevoerd op MATLAB-computeromgeving.
Protocol
Alle procedures volgen de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (NIH Publications N°. 8023, herzien in 1978) geïmplementeerd door nationale gezondheidsinstellingen en lokale Mexicaanse wetten om het aantal dieren dat wordt gebruikt voor dierenwelzijn en het verbod op dierenleed te verminderen. De ethische commissie van de Universidad Iberoamericana keurde de experimentele protocollen voor het gebruik van dieren in deze studie goed.
1. Algemene opzet
- Installeer de Behavioral Tracking Software op een computer volgens de productie-instructies.
- Monteer de camera direct boven het apparaat, zodat deze naar beneden is gericht. De camera moet op de computer zijn aangesloten.
- Installeer de stuurprogrammasoftware die vereist is voor de camera (volgens de fabricage-instructies).
- Als de camera een zoomlens bevat, past u deze aan zodat deze perfect in het scherm van de camera passen.
- Schakel de autofocusmodus (AF) van de camera uit volgens de productiesoftware.
- Zorg ervoor dat de camera in realtime correct werkt en test de video-opnamemodus totdat deze klaar is voor gebruik.
2. Protocol inzake milieuverrijking (zie figuur 1)
OPMERKING: Drie maanden oude mannelijke Wistar-ratten werden gebruikt voor dit experiment en werden onderhouden onder natuurlijke donkere lichtomstandigheden.
- Plaats zaagsel beddengoed in een transparante acryl vierkante arena (500 x 500 x 500 mm).
- Plaats drie verschillende soorten speelgoed op de arena voor knaagdieren om mee te communiceren (bijv. Activiteitenwielen, dubbeldeks, trappen, enz.).
- Voeg vier 2-inch en vier gebogen grijze ondoorzichtige PVC-buizen toe.
- Voorzie voedsel- en waterdispensers van ad libitum toegang tot dieren.
- Plaats drie knaagdieren per kooi in de vivariumkamer onder normale omstandigheden.
- Laat de dieren in deze arena voor de tijd die nodig is volgens het bijbehorende protocol. In dit experiment moeten dieren 20 dagen in de arena blijven.
OPMERKING: Na de elektrode-implantatieoperatie gaan dieren niet terug naar een omgevingsverrijkingsbehandeling. In plaats daarvan werden ze in enkele kooien geplaatst totdat de nieuwe objectherkenningstest is voltooid.
3. Elektroden productieproces
- Knip een stuk koperdraad op ongeveer 2 cm en gebruik een schuurpapier om ongeveer 0,5 cm van elk uiteinde te wrijven.
- Rol het ene uiteinde van de koperdraad naar de kop van een kleine schroef (elektroden) en zorg ervoor dat deze stevig is bevestigd, omdat dit een cruciale stap is. Correct contact tussen beide materialen moet worden gegarandeerd om artefacten in de EEG-signalen te voorkomen.
- Plaats het andere uiteinde op de eindpunt van de connector en zorg ervoor dat deze goed is bevestigd door te verstevigen met een fijne tang. Deze tip moet worden aangesloten met een versterkerkabel.
- Meet de geschikte geleidbaarheid van de punt tot de schroef met behulp van een multimeter. Dit proces garandeert dat de elektrodeverbinding correct is geïnstalleerd.
4. Epidurale (schedelschroef) elektroden implantatie chirurgie
OPMERKING: Na 20 dagen milieuverrijkingsbehandeling zullen de dieren een operatie ondergaan volgens de hieronder beschreven procedure:
- Injecteer een cocktail van Ketamine/Xylazine (90/10 mg/kg, i.p.) in het dier.
OPMERKING: Om luchtwegobstructie te voorkomen, wacht u tot de rat stopt met bewegen, haalt u hem vervolgens uit de kooi en plaatst u het dier op een plat oppervlak. Injecteer een niet-steroïde anti-inflammatoire (meloxicam 1 mg/kg, s.c.) en een antibioticum (enrofloxacine 2,5 mg/kg, p.o.) als preventieve analgesie. - Zodra de rat volledig is verdoofd, scheer je het kopgebied van de rat.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd is voordat u doorgaat met de operatie. Knijp voorzichtig in een van de poten of de staart. Als het dier reageert op de stimulus, wacht dan nog een paar minuten en knijp het opnieuw. Als het dier niet reageert op de knijp, ga dan naar de volgende stap. Als de vereiste apparatuur beschikbaar is, wordt het gebruik van gasanesthesie (zoals isofluraan) ten zeerste aanbevolen, omdat het gemakkelijker kan worden getitreerd voor de veiligheid. - Plaats het dier op het stereotaxische apparaat door beide oren eerst met de oorbalken te fixeren (pas op dat u het inwendige oor van het dier niet verwondt). Plaats ten slotte de voortanden over de bijtbalk en zet de neusbalk vast.
OPMERKING: Geef het dier een verwarmingskussen voor alle operaties, omdat de anesthesie die bij deze procedure wordt gebruikt, meestal onderkoeling en ademhalingsproblemen veroorzaakt. - Reinig de bovenkant van het hoofdgebied met behulp van drie afwisselende rondes chloorhexidine of op jodium gebaseerde scrub, gevolgd door zoutoplossing of alcoholspoeling.
- Dien lidocaïne subcutaan (20 mg / ml) toe onder de huid van het hoofdgebied (0,5 ml).
- Breng elke 5-10 minuten een druppel oogheelkundige oplossing of zoutoplossing aan in de ogen van elk dier om ze te helpen niet uit te drogen.
- Maak met behulp van een scalpel een incisie van ongeveer 2 cm van voorste naar achterste richting om het bovenste gebied van de schedel goed bloot te leggen.
- Trek de huid in met behulp van bulldogklemmen en schraap het weefsel boven de schedel.
- Identificeer en noteer de verkregen bregma-coördinaten.
- Vanaf Bregma, met behulp van de stereotaxische Paxinos en Watson Atlas30, lokaliseer en markeer de positie van elk van de zeven punten (coördinaten) waar de elektroden zullen worden bevestigd.
OPMERKING: In dit experiment, F3, F4 schroeven (+2,0 mm van Bregma, 2,25 mm lateraal van de middellijn); C3, C4 schroeven (−3,0 mm vanaf Bregma, 2,75 mm zijdelings vanaf de middellijn); en P3, P4 schroeven (−7,0 mm vanaf Bregma, 2,75 mm zijdelings vanaf de middellijn) werden geïnstalleerd. Een zevende schroef bevond zich achter het neusbeen (NZ), als grondreferentie (zie figuur 2). - Maak met behulp van een boorgereedschap met variabele snelheid een gat met een punt maat 2 (lengte 44,5 mm) op elk van de markeringen, pas op dat u de schedel niet volledig binnendringt.
- Steek de elektrode in het gat en schroef deze voorzichtig in de schedel.
- Herhaal stap 4.10 en 4.11 totdat alle zeven schroeven op de juiste manier zijn bevestigd.
- Bevestig alle 7 de schroeven met een eerste laag tandcement. Steek elke elektrode in een connector. Bedek de draden volledig met een tweede laag tandcement (het voorkomt dat het dier schroeven eraf trekt) en de onderkant van de connector. Dek indien nodig af met een derde laag tandcement en laat de EEG-connector schoon voor een goede verbinding, zodat het EEG-apparaat op de juiste manier kan worden aangesloten (zie figuur 3).
OPMERKING: Na het plaatsen van elk paar bilaterale schroeven, kunnen deze worden bevestigd met tandheelkundig cement (optionele stap). - Laat de rat 's nachts in postoperatieve zorg. Observeer het dier en geef het dier een verwarmingskussen gedurende 1-2 uur na de operatie, omdat de anesthesie die bij deze procedure wordt gebruikt meestal onderkoeling en ademhalingsproblemen veroorzaakt.
- Dien 50 ml / kg / 24 uur (onderhoudsdosis) zoutoplossing subcutaan toe om uitdroging te voorkomen. Injecteer een niet-steroïde anti-inflammatoire (meloxicam 2 mg/kg, s.c.) en een antibioticum (enrofloxacine 5 mg/kg, p.o.) na de operatie en gedurende de volgende 24 uur.
- Houd de ratten na de operatie in enkele kooien voor volledig herstel gedurende zeven dagen voordat u de gedragstests uitvoert.
- Manipuleer het dier voorzichtig op periodieke basis (minstens één keer per dag) om de stress bij toekomstige manipulaties te verminderen. Terwijl je de rat met één hand vasthoudt, wordt vingerdruk zachtjes op de rug van het dier uitgeoefend en glijden de vingers door de vacht. Controleer de hoofdwond, gezondheidstoestand, gedrag in het algemeen en lichaamsgewicht gedurende een periode van één week na de operatie.
OPMERKING: Als er afwijkingen of tekenen van ziekte/stress bij het dier worden gevonden, breng dan de verantwoordelijke dierenarts op de hoogte. Voer na deze periode de Novel objectherkenningstest en EEG-opnametechniek uit.
5. Nieuwe objectherkenningstest (NORT)
OPMERKING: Ga zeven dagen na de operatie verder met gedragstests. Alle gedragsprocedures in het gepresenteerde experiment werden uitgevoerd tussen de 14 h 00 min en 16 h 00 min, wat overeenkomt met de lichtcyclus van de rat.
- Plaats een vest van zachte stof (waarop het EEG-apparaat tijdens de gedragstest zou worden geplaatst) op de rat. Sta gewenning toe gedurende 2-3 dagen voordat u de gedragstest uitvoert.
- Plaats een zwarte acryl vierkante arena (500 x 500 x 500 mm) in een verlichte opnameruimte.
- Bevestig twee identieke nieuwe objecten aan het midden van de vloer van de arena met behulp van dubbelzijdige tape (om te voorkomen dat de dieren worden verplaatst). Objecten moeten op gelijke afstand van elkaar en de muren van de arena staan.
- Reinig elk object van tevoren grondig met 50% ethanol, evenals de vloer van de arena na elke proef (om olfactorische signalen te voorkomen).
OPMERKING: Breng de dieren altijd ten minste een half uur voor aanvang van elke sessie over naar de huisvestingskamers (van de vivariumkamer naar de experimentele ruimte). Na het voltooien van de opnamesessie, laat de dieren nog een uur in de experimentele ruimte. Dit is om de stress te vermijden die de prestaties van deze test zou kunnen beïnvloeden. - Sluit het EEG-apparaat aan voordat u met elke test begint. Houd het dier voorzichtig vast en steek de kabel stevig in de connector op het hoofd van het dier met de EEG-kit op de rug van het dier bevestigd (zie figuur 4). Er is slechts één positie toegestaan.
OPMERKING: Voorzichtige eerdere manipulatie van het dier kan helpen om de stress bij dieren tijdens de verbindingsprocedure te verminderen. Anders neemt het risico op schade aan het apparaat of de dieren toe. Laad de batterij van het apparaat volledig vooraf op via een USB-poort. - Nieuwe testfasen voor objectherkenning
- Gewenning: Behandel het dier met tussenpozen van 5 minuten gedurende twee opeenvolgende dagen en plaats het dier onmiddellijk daarna op de arena (zonder voorwerpen) en laat ze 10 minuten vrij verkennen.
OPMERKING: Voordat er acquisitie- en geheugentestsessies werden uitgevoerd, werden ratten zorgvuldig behandeld en verbonden met het bijbehorende EEG-apparaat, dat correct was gefixeerd voordat de test werd gestart. - Acquisitiesessie: Plaats het dier op de arena met uitzicht op een van de muren tegenover de objecten. Laat dieren gedurende 10 minuten vrij verkennen. Ga naar stap 6.13 voor testopname met behulp van Behavioral Tracking Software.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het EEG-apparaat het vest goed vasthoudt aan de rug van de rat (om ervoor te zorgen dat het dier goed wordt gevolgd). Gebruik voor extra versteviging afplaktape. - Short-term memory test (SMT): Vervang een van de objecten door een andere volledig andere in vorm, kleur en textuur. Plaats het dier, 2 uur na de acquisitiesessie, in de arena met uitzicht op een van de muren tegenover de objecten. Laat het dier gedurende 10 minuten vrij verkennen. Ga naar stap 6.13 voor testopname met behulp van de Behavioral Tracking Software.
- Long-term memory test (LMT): Vervang het gebruikte object door een ander object dat qua vorm, kleur en textuur compleet verschilt van de kortetermijngeheugentest. Plaats het dier 24 uur na de acquisitiesessie in de arena met uitzicht op een van de muren tegenover de objecten. Laat het dier gedurende 10 minuten vrij verkennen Ga naar stap 6.13 voor testopname met behulp van de Behavioral Tracking Software.
- Gewenning: Behandel het dier met tussenpozen van 5 minuten gedurende twee opeenvolgende dagen en plaats het dier onmiddellijk daarna op de arena (zonder voorwerpen) en laat ze 10 minuten vrij verkennen.
6. Software voor het volgen van gedrag instellen
- Open de software voor het bijhouden van gedragsregels.
- Log in op het account met de gebruiker en het wachtwoord van de instelling.
- Open de tik op "Nieuw leeg experiment" en kies een naam voor het protocol (bijvoorbeeld "NORT").
- Selecteer 'Videotrackingmodus'.
OPMERKING: In dit experiment is de camera ingesteld om de videotracking live te streamen. Er is echter een extra optie om vooraf opgenomen video's te selecteren. - Ga naar 'Apparaat'. Definieer het arenagebied door de oranje rechthoek aan te passen aan de grenzen van de geprojecteerde arena. Bepaal het gebied van het object en pas de oranje cirkels aan de rand van het object in de arena die door de camera op het scherm worden geprojecteerd.
- Stel de bewegende liniaallijn van de schaal in op een positie langs de bekende lengte van de afbeelding (de arena). Voer de lengte van het object in millimeters in bij de optie "De lengte van de liniaallijn is" in het deelvenster Instellingen. In dit geval meet de arena 500 x 500 mm.
- Ga naar 'Tracking en gedrag'. Ga verder naar 'Zones'. Klik op het menu "Item toevoegen" en selecteer "Nieuwe zone". Selecteer het arenagebied en geef de nieuwe zone een naam (bijvoorbeeld 'Veld').
- Herhaal de vorige stap met het gebied van de objecten en geef de nieuwe zone een naam (bijvoorbeeld 'Objecten').
- Ga naar "Dierenkleur" en selecteer de optie "De dieren zijn lichter dan de achtergrond van het apparaat".
OPMERKING: Witte (Wistar) ratten werden gebruikt voor dit experiment. De software heeft echter extra opties voor onderzoekers die zwarte en gevlekte ratten gebruiken. Beide rassen van dieren kunnen in hetzelfde experiment worden gebruikt. - Ga naar "Het hoofd en de staart van het dier volgen" en selecteer "Ja, ik wil dat de kop en staart van het dier worden gevolgd."
- Ga naar "Testen" | 'Stadia' en selecteer in het menu 'Item toevoegen' de optie 'Nieuwe fase'. Geef de nieuwe fase de naam 'Acquisitie'. Definieer de duur van de fase (bijvoorbeeld 600 s).
- Herhaal de vorige stap van de fasen "Kortetermijngeheugentest" en "Langetermijngeheugentest".
OPMERKING: In dit protocol hebben alle fasen dezelfde duur (10 min). - Ga naar 'Procedures'. Definieer de gebeurtenissen die voor elke fase moeten worden bijgehouden (acquisitie, kortetermijngeheugentest en langetermijngeheugentest).
- Start de test (met elk dier). Ga naar "Tests" (in de bovenste menubalk) en selecteer "Een test toevoegen (+)." Wijs een nummer toe aan het te testen dier (bijvoorbeeld "1").
- Selecteer "Record" en geef de dieren en sessie een naam (bijv. "M1 Acq").
- Voordat u het dier in de arena plaatst, klikt u één keer op de knop "Afspelen". Er wordt een bericht "wachten om te starten" weergegeven.
- Nadat u het dier in de arena hebt geplaatst, klikt u een tweede keer op de knop "Afspelen". De test begint en eindigt automatisch.
- Herhaal stap 6.13-6.16 voor de kortetermijngeheugentest (2 uur na de acquisitiesessie) en de langetermijngeheugentest (24 uur na de acquisitiesessie).
7. Draadloze elektrofysiologie apparaat instellen
- Sluit de modem aan op een pc-host en schakel deze in. Schakel elk ander netwerkapparaat op de pc uit. Schakel bij voorkeur alle andere draadloze communicatie in de registratieruimte uit, zoals Bluetooth, mobiele telefoons, andere modems of zelfs draadloze handsets.
- Bevestig de versterker aan de achterkant van de rat, zoals vermeld in stap 5.5.
- Schakel het EEG-apparaat in door de batterij aan te sluiten.
OPMERKING: 2 s na het aansluiten van het apparaat knippert een rode led op de EEG-versterker, wat aangeeft dat de communicatie met de modem actief is, en vervolgens wordt de groene led ingeschakeld. Als de communicatie succesvol is, beginnen de LED's op de modem continu te knipperen. De versterker is nu klaar om informatie naar de modem te sturen. - Start de EEG-software en stel deze in volgens de instructies van de fabrikant om te integreren in het draadloze EEG-acquisitieapparaat
- Druk op de knop "Start Display". De EEG-software geeft de werkelijke signaalacquisitie weer.
OPMERKING: Gebruik "Windows Taakbeheer" om de prioriteitsmodus "Real-time" toe te wijzen om te voorkomen dat informatie ontbreekt tijdens het experimenteren.
8. Elektro-encefalografie (EEG) signaalregistratie
- Nadat u hebt gecontroleerd of de EEG-software gegevens verzamelt, start u de Behavioral Tracking-software en stelt u een experimenteel protocol in om te controleren of het dier zich in de observatiezone bevindt en de opstelling correct werkt.
- Start op dit punt de EEG-software-opname door op de knop "Record starten" te drukken. Nadat u hebt gecontroleerd of het acquisitiesignaal actief is, begint u te experimenteren in het BTS.
- Nadat het experiment is beëindigd, keert u terug naar de EEG-software en stopt u het opnameproces. De opname wordt opgeslagen met behulp van een standaardnaam die bestaat uit de opnamedatum met behulp van het volgende formaat: "jjjj-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". Standaard worden alle opnames opgeslagen in de map EEG-software (NeurophysData).
- Controleer of beide gegevensbestanden zijn gemaakt. Noteer het experimentlogboek of wijzig de naam om verwarring te voorkomen.
9. Gedragstaak en EEG-signaalsynchronisatie
- Open MATLAB en voer de opdracht uit: convert_plx2mat. Een dergelijke functie opent een browserbox. De conversiefuncties worden geleverd door de fabrikant en moeten worden toegevoegd aan het pad van MATLAB.
- Selecteer de *.plx om te converteren en druk op "Enter" op de opdrachtregel van MATLAB om deze naar standaardparameters te converteren.
- Open het BTS-experimenteerbestand en ga naar 'Protocol'. Klik op de optie "Resultaten, rapporten en gegevens" selecteer alle gebeurtenissen van beide objecten en klik op "Kies de tijdnotatie voor het rapport", selecteer de derde optie: "Toon gebeurtenistijden als realtime in HH: MM: SS.sss - bijvoorbeeld 13:20:14.791."
- Ga nu naar "Bestand" en klik op "Exporteren" en "Experiment exporteren als XML", vink "Datum en tijd van de test" aan en klik ten slotte op "XML maken".
- Ga naar "Testgegevens exporteren" en klik op "Gegevens opslaan". Er wordt een .csv bestand met gebeurtenistijden gemaakt.
- Herhaal stap 9.1 tot en met 9.5 voor elk bestand. In ons geval waren de drie experimenten: ACQ, STM en LTM.
- Zodra de EEG- en gedragsbestanden zijn geconverteerd, verzamelt u ze in één map. De map moet zes bestanden bevatten, respectievelijk de drie MAT-bestanden en drie .csv. In ons geval werden bestanden genoemd: PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv en PID_03_LTM_M.csv. ID verwijst naar het identificatienummer van een dier.
- Open de functie "procesa_sujeto.m" met MATLAB en pas de tweede regel aan de ID van het dier aan.
- Verplaats nu MATLAB naar een dergelijke map en voer uit: "procesa_sujeto" om figuren te maken van alfa- en bèta-relatieve band tot macht geassocieerd met objectherkenning op ACQ-, STM- en LTM-stadia.
OPMERKING: "procesa_sujeto" is een functie die verschillende signaalverwerkingsanalyses uitvoert / uitvoert. Deze analyses worden als volgt samengevat in de stappen 9.10 tot en met 9.15. - Filter elk EEG-signaal met een 4e orde Butterworth bandpass-filter op [5-40] Hz, met behulp van fasecorrectie.
- Visueel inspecteren Signalen vóór de volgende analyse, en die kanalen met artefacten afgeleid van defecte elektroden plaatsing of verkeerde aanpassing door dierbewegingen werden uitgesloten van verdere analyse.
- Verwijs naar het gemeenschappelijke gemiddelde om bewegingsartefacten te verlichten.
- Segmenteer EEG-signalen om tijdperken van 4 s lengte te vormen, gesynchroniseerd door tijdstempels afgeleid van BTS. De doelgebeurtenissen waren de verkenning van het object gemarkeerd door de afstand van het dier tot de grens van objecten. Deze gebeurtenissen zijn gemarkeerd op de BTS-tijdstempels en werden gebruikt als id's die de posities van de vensters bepalen. EEG-tijdperken worden dus begrensd door 1 s voordat de exploratie begint tot 3 s erna. Op dit moment is er geen validatie over de lengte van de exploratie gebruikt, maar het zal worden overwogen voor toekomstige onderzoeken.
- Schat de spectrale vermogensdichtheid op die tijdperken met behulp van de periodogrammethode van Welch met behulp van 1 s vensterlengte, een overlap van 90%, Hanning-venster voorafgaand aan fouriertransformatieschatting, met deze parameters werd een resolutie van 1 Hz bereikt.
- Beoordeel de vermogensspectraal op elke band door het gebied onder periodogram te evalueren en de gepresenteerde waarden komen overeen met relatieve energie, dit betekent dat de energie van elke EEG-band werd gedeeld door de totale energie van het tijdperk. Deze procedure vermindert ook foutieve schattingen als gevolg van artefacten op EEG-signalen.
Representative Results
De hierboven beschreven methoden werden toegepast om EEG en rattenactiviteit gelijktijdig te registreren na de milieuverrijkingsbehandeling. Drie maanden oude mannelijke Wistar-ratten waren gedurende 20 dagen onder een behandelingsprotocol voor omgevingsverrijking op middellange termijn en ze werden geopereerd om zes schedelschroefelektroden te fixeren die gepaard gingen met frontale, centrale en pariëtale gebieden die verwijzen naar een zevende elektrode in NZ. Dieren werden gehouden onder natuurlijke donkere lichtomstandigheden, met ad libitum toegang tot voedsel en water. Dit werk toont de integratie tussen het EEG-systeem en de gedragsvolgsoftware voor een gelijktijdige live-opname. We hebben alleen dieren gebruikt die zijn behandeld volgens het EE-protocol, omdat we niet pretenderen de effectiviteit van de behandeling te vergelijken, maar alleen de voordelen van de apparatuur illustreren. Als bewijs dat het gebruikte 20 dagen milieuverrijkingshuisvestingsprotocol de volwassen neurogenese stimuleert, presenteren we BrdU-positieve celtellinggegevens van dieren onder EE en dieren gehuisvest onder standaardomstandigheden uit niet-gepubliceerde gegevens uit ons laboratorium. Drie maanden oude mannelijke Wistar-ratten werden gebruikt. Ze werden drie keer geïnjecteerd met BrdU met 12 uur tussen elkaar. De dieren werden verdoofd (pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) en geëuthanaseerd door transcardiale perfusie (zie figuur 5). Om ervoor te zorgen dat het vest dat aan het EEG-apparaat is bevestigd de bewegingen van dieren niet beperkt, hebben we de open veldtest (OFT) in twee groepen uitgevoerd, één groep onderging een operatie terwijl ze de apparatuur droegen (vest en EEG-versterker) en de andere groep dieren bleef intact zonder de hardware te dragen. We vonden geen significante verschillen in de afstand die de dieren aflegden in 10 minuten testen (zie figuur 5). Het typische NORT-protocol bestaat uit de presentatie van twee objecten en de vervanging van een van hen door een nieuw object. De gedragstrackingsoftware bewaakte de verkenningstijd.
De Behavioral Tracking Software registreerde een groep dieren om hun belangrijkste prestatieparameters te evalueren. Daarom hebben we drie parameters gebruikt om de exploratieprestaties te evalueren. De voorkeursverhouding werd berekend met behulp van de koptijd van de dieren die in de objectzone werden doorgebracht, wat de totale hoeveelheid tijd aangeeft die het hoofd van de dieren in elk object heeft doorgebracht. We hebben ook een voorkeursverhouding berekend voor de tijd die wordt besteed aan het bewegen naar de objecten, die de totale hoeveelheid tijd weergeeft die is besteed aan elk dier dat naar elke objectzone bewoog. Daarnaast werd de bestede tijd per bezoek aan elk object berekend. Figuur 6 toont de hierboven genoemde resultaten met drie parameters. In de acquisitiestudie waren er geen verschillen tussen objecten in de drie beoordeelde parameters: hoofdtijd in de objectzone voor de drie proeven, tijd die naar de objecten toe beweegt voor de drie proeven en tijd per bezoek in elk object. Er waren geen verschillen in de STM-studie. Ondertussen werd in de LTM-studie een exploratievoorkeur gezien die aanzienlijk hoger was voor het nieuwe object. Bovendien was in de LTM-studie ook een voorkeur voor het nieuwe object in de tijd per bezoek (paneel C) te zien. Video 1 toont een representatief voorbeeld van een rat opgenomen in het experiment, terwijl Video 2 een representatief voorbeeld toont van gelijktijdige EEG- en gedragsopname.
Het was mogelijk om tijdgebeurtenissen die werden bijgehouden te matchen met de Behavioral Tracking en de EEG-softwareregistratie met behulp van de klok van de computer. Figuur 7 en figuur 8 tonen de veranderingen in het relatieve vermogen van het EEG ten opzichte van de alfa- en bètabanden. Deze zijn gerelateerd aan motorische controle, concentratie en geheugen, wat suggereert dat exploratie alleen gerelateerd is aan deze functies. De resultaten van dier 3 laten zien dat alfavermogen de neiging heeft om te verminderen op STM met betrekking tot ACQ en LTM, wat een desynchronisatie suggereert met betrekking tot exploratie of het ophalen van geheugen. Het aantal objectherkenning (bewerkte tijdperken) was laag. Op dit punt is het niet mogelijk om te bepalen of een statistische test zou valideren of een dergelijk verschil echt is, of dat een artefact in staat was om dergelijke experimentele omstandigheden te produceren. Niettemin zijn segmentatie, etikettering en analyse mogelijk geworden door een tijdlijn van gelijktijdige markeringsgebeurtenissen bij dieren en EEG-resultaten die voor toekomstige onderzoeksprojecten worden geproduceerd. Het combineren van deze systemen voorkomt een onrechtmatige identificatie van gebeurtenissen door een handmatig markeringsproces, wat een belangrijk probleem is geworden bij dierproeven. De combinatie van de BTS- en elektrofysiologische (EP) activiteit kan nauwkeurig worden geassocieerd met dierlijk gedrag; Niettemin vereisen experimentele omstandigheden het gebruik van geavanceerde signaalverwerkingstechnieken om bewegingsartefacten te elimineren en verbeteringen in de experimentele opstelling effectief aan te brengen.
Figuur 1: Voorbeelden van enriched environment (EE) condities kooi. De huisvesting werd voorzien van speelgoed en buizen, waarin dieren nieuw en complex vinden, maar geen biologische relevantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Posities van epidurale elektroden in de schedel van de rat. De schroeven werden tegelijkertijd gebruikt als anker voor de headset en als elektroden. F = frontaal; C = frontoparietaal; P = pariëtaal; 3 = links; 4 = juist; NZ = als grondreferentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van een epidurale (schedelschroef) elektroden implantatie operatie. Afbeelding van geïmplanteerde intracraniale elektroden schroeven in ratten in verschillende stadia van de operatie. Zorg ervoor dat aseptische technieken worden gevolgd tijdens het uitvoeren van deze procedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van een rat samen met de experimentele opstelling. De rat werd gemaakt om het vest te dragen dat aan het EEG-apparaat was bevestigd met een ingebouwde batterij, in de arena die werd gebruikt voor het NORT-protocol. De afbeelding toont de headset en de kabelconnector die op de rat van het hoofd is geïnstalleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Bewijs van bewegingsvermogen en volwassen neurogenesestimulatie door EE-protocol. (A) Representatieve beelden van de dierlijke activiteit gedurende 10 minuten in de openveldtest (OFT) en de gemiddelde afstand die dieren die de apparatuur/operatie droegen, en dieren zonder de apparatuur/geen operatie. (B-E) Representatieve DG-sectie met BrdU-gelabelde cellen (intens donker) voor EE en standaard woongroepen. De panelen B en D tonen een lage vergroting van de DG en de panelen C en E tonen het vakoppervlak bij een hogere vergroting. Panelen B en C zijn weefsel uit de EE-woongroep, panelen D en E zijn van de standaard woongroep. De inzet illustreert het gemiddelde aantal gelabelde cellen in beide groepen. ML - moleculaire laag; GCL – korrelige cellaag; SGZ – subgranulaire zone; pijlen - BrdU+ cellen. De grafieken tonen het gemiddelde ± SEM. De T-student test werd gebruikt om groepen te vergelijken. * p≤0,05. Er werden geen significante verschillen gevonden tussen groepen in de Open Field Test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Exploratieprestaties bij NORT-beoordeling. (A) Hoofdtijd in de objectzone voor de drie proeven. (B) Tijd die naar de objecten voor de drie proeven beweegt. (C) Tijd per bezoek in elk object. De grafieken tonen het gemiddelde ± SEM. In alle parameters werd tweeweg herhaalde metingen ANOVA met Sidak's meervoudige vergelijkingstest gebruikt. * p≤0,05, ** p≤0,01 tussen de objecten in het betreffende onderzoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Veranderingen ten opzichte van alfa-EEG-bandvermogen geassocieerd met exploratie. Deze figuur toont veranderingen in relatieve alfakracht, van halve seconde tot 2,5 nadat het dier begint met de verkenning van de objecten. De zes grafieken kwamen overeen met frontale, centrale en pariëtale elektroden (van boven naar beneden) en links en rechts. Boxplots tonen de verdeling van dergelijke tijdreeksen voor elke conditiecombinatie van een object: "Bekend" en "Nieuw", en stadium: "ACQ", "STM" en "LTM". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Veranderingen ten opzichte van bèta EEG-bandvermogen geassocieerd met exploratie. Deze figuur toont veranderingen in het relatieve bètavermogen, van een halve seconde tot 2,5 nadat het dier de verkenning van de objecten is begonnen. De zes grafieken kwamen overeen met frontale, centrale en pariëtale elektroden (van boven naar beneden) en links en rechts. Boxplots tonen de verdeling van dergelijke tijdreeksen voor elke conditiecombinatie van een object: "Bekend" en "Nieuw", en stadium: "ACQ", "STM" en "LTM". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Representatieve video van een rat die in het experiment is opgenomen. De rat bevond zich in de arena die werd gebruikt voor het NORT-protocol. De rat droeg het vest dat aan het EEG-apparaat was bevestigd met een ingebouwde batterij. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Representatieve video met gelijktijdige EEG- en gedragsopname. EEG-signaal werd aan de linkerkant weergegeven, terwijl de gedragstest (NORT) aan de rechterkant van de video werd weergegeven. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Gedrags- en elektro-encefalografieonderzoek is van nature moeilijk en uitdagend. Daarom biedt de combinatie van beide technieken belangrijke kritische stappen. Beide gelijktijdige technieken worden dus niet veel gebruikt. In de praktijk voert elke groep over de hele wereld gedragstests uit met speciale omstandigheden, zoals dieren, geanalyseerde parameters of behandelingen. Het bovenstaande creëert aanzienlijke controverses in het veld en de noodzaak om standaardprocedures te ontwikkelen die voor iedereen beschikbaar zijn. Hier hebben we deze gedetailleerde procedure voorbereid met alle kritieke stappen en methodologische overwegingen die meestal niet worden beschreven of genoemd in de meeste gepubliceerde artikelen. Deze worden hieronder besproken.
De productie van de benodigde materialen is een fundamentele stap in het succes van deze techniek. In dit opzicht moet de elektrode helemaal opnieuw worden opgebouwd met behulp van roestvrijstalen schroeven, koperen kabels en een zilveren lasser. Deze materialen zijn moeilijk permanent aan elkaar te lassen, op zo'n manier dat de geleidbaarheid en sterkte van elke elektrode vóór gebruik moet worden gecontroleerd. Het is mogelijk om een ander type draad te gebruiken voor de elektrode-assemblage; Het koper is echter flexibel genoeg om de elektrode te manipuleren om deze in de versterkerconnector te plaatsen. In dit opzicht is het gebruik van commerciële elektroden wenselijk, maar de aanschaf ervan kan ingewikkeld en duur zijn. De operatie is een van de meest kritieke stappen in dit protocol. Het wordt ten zeerste aanbevolen en zelfs noodzakelijk om een ervaren chirurg te hebben, met name voor implantatie van elektroden. Omdat de operatie vaak een langere anesthesietijd en soms een lastoepassing tijdens de operatie vereist, moet elk laboratorium de nodige tests uitvoeren met de juiste anesthesie (verschillende cocktails kunnen worden gebruikt) voor elke stam knaagdieren, vooral onder vivariumomstandigheden, verschillen tussen nesten en zelfs individuele verschillen tussen dieren. Een goede planning en overweging kan voorkomen dat dieren verloren gaan tijdens operaties. De implantatie van de elektroden is een andere cruciale stap. Het vereist grote zorg om te voorkomen dat de schedel wordt geslagen en hersenvliezen of hersenweefsel worden beschadigd. Schroeven moeten correct worden geplaatst, dat wil zeggen volledig in de schedel worden bevestigd, anders worden ruis en artefacten gepresenteerd op signalen, zoals die met betrekking tot een belabberde colocatie of beweging die de EEG-opname niet gebruikt. Pre- en postoperatieve behandeling en aandoeningen moeten altijd worden uitgevoerd en geobserveerd om het lijden van het knaagdier te voorkomen. Subcutaan lidocaïne kan op de hoofdhuid worden gebruikt voordat de incisie met het scalpel wordt gemaakt. Een druppel zoutoplossing in de ogen van het dier helpt uitdroging te voorkomen. Ook moet een zoutoplossing in de mond worden toegediend en na de operatie moet 1 ml subcutaan of intraperitoneaal worden toegediend om de vochtbalans van het dier te compenseren en uitdroging te voorkomen. Onmiddellijk na de operatie moet een ontstekingsremmend medicijn (om pijn te verminderen), evenals antibiotica via subcutane of actuele antibiotica, direct aan de rand van de hoofdhuid worden toegediend waar de tandcementkap zich bevindt (om de kans op infectie te verminderen). Herhaal de bovenstaande procedure 24 uur na de operatie. De positionering van de EEG-versterker op de rug van het dier is de grootste moeilijkheid voor de gelijktijdige opname. Het ontwerp en de fabricage van een vest zijn specifiek gebaseerd op de grootte van de dieren. Het vest moet de natuurlijke beweging van het knaagdier mogelijk maken (zie figuur 5). Dit laatste garandeert het belangrijkste voordeel van de techniek, namelijk het registreren van vrije bewegingen. Omdat de dieren na de operatie en tijdens de daaropvolgende dagen niet probeerden het vest, de hoofdconnector of kabels te verwijderen, werd aangenomen dat de opstelling geen significante bewegingsbeperking veroorzaakte of pijn of ongemak veroorzaakte. Voor een correcte EEG-segmentatie in tijdperken op basis van gebeurtenissen gemarkeerd door de BTS is het verplicht om een goed gedefinieerd protocol op te schrijven. De tijdelijke markeringen kunnen worden samengevoegd door tijdreeksmanipulatie omdat beide systemen dezelfde klok gebruiken om hun tijdstempels in te stellen. Het bovenstaande breidt de mogelijkheden voor dierproeven uit met elektrofysiologische gegevens voor analyse.
De hier gepresenteerde techniek kan worden gebruikt in elk neurowetenschappelijk onderzoeksgebied en met de meest voorkomende muizensoorten en zelfs andere soorten. De veelzijdigheid van de Behavioral Tracking Software is een van de belangrijkste voordelen, omdat het kan worden gebruikt in een grote veelzijdigheid van doolhoven zoals Morris waterdoolhof, open-veld, nieuwe objectherkenning, geconditioneerde plaatsvoorkeur, gatenbord, verhoogd plus doolhof, Y-doolhof, radiaal armdoolhof, Barnes-doolhof en anderen. Het kan tot 16 camera's tegelijkertijd worden gebruikt. Daarnaast kunnen honderden verschillende maatregelen (voor meer gedetailleerde informatie zie de handleidingen31,32) worden gerapporteerd. Bedenk dat dit werk experimenten beschrijft voor EEG-opnames, sommige andere technieken zoals Local Fields Potentials of single-unit recording zijn mogelijk. Gebruikers moeten er echter rekening mee houden dat de algemene installatie en verschillende voorbereidende stappen voor andere doeleinden moeten worden gewijzigd. Dus wanneer deze techniek wordt gebruikt in combinatie met EEG Wi-Fi-opname, worden de mogelijkheden uitgebreid, omdat het nieuwe perspectieven toevoegt aan dierstudies zoals die op mensen om verschillende kenmerken van de EEG-integratie en -dynamiek te evalueren, zoals connectiviteit, EEG-bandvermogen of opgeroepen reacties. In tegenstelling tot mensen zijn dierproeven mogelijk om de toediening van geneesmiddelen, genmodificaties of expressie te evalueren, naast vele andere experimentele paradigma's. Houd er voor EEG-analyse rekening mee dat sommige protocollen een zeer laag aantal herhalingen van het gewenste gedrag hebben, wat de mogelijkheid beperkt om reacties te gemiddelden en betrouwbare resultaten te verkrijgen. Zorg er daarom voor dat u de opname- en analyseprotocollen ontwerpt die worden geacht uit te voeren voordat u met het experiment begint. Niettemin moet worden overwogen dat het werken in dierproeven niet mogelijk is om beweging te voorkomen, waardoor de complexiteit van het experimentele protocol en overwegingen voor signaalanalyse en gedragstaken toenemen. Momenteel is apparatuur voor volledige volgsystemen en EEG-opnames niet gestandaardiseerd of modulair, wat betekent dat hun opstelling is bedoeld voor een enkel protocol en aanpassingen om andere gedragstaken te verkennen, wat hogere kosten voor een groot aantal laboratoria impliceert / suggereert. Deze situatie kan worden opgelost door de opties te volgen die in deze studie worden uitgelegd. Toch konden er verschillende verbeteringen worden gerealiseerd voor betrouwbaardere experimenten. Het werk kan in verschillende stappen worden verbeterd, te beginnen met de fabricage van elektroden tot gedrags- en signaalverwerking. Niettemin is aangetoond dat het volgen van dieren en EEG-acquisitie mogelijk zijn met behulp van een betaalbare hightech maar goedkope opstelling.
Samenvattend is het huidige werk een poging om wetenschappers, met name op het gebied van neurowetenschappen, te helpen deze twee technieken te gebruiken die niet vaak in combinatie worden gebruikt. De gelijktijdige opnametechniek van EEG en gedragstesten met behulp van Behavioral Tracking Software heeft veel voordelen en kan bijzonder nuttig zijn op veel gebieden van de neurowetenschappen, met name op het gebied van leren en geheugen. Gezien deze apparatuur andere mogelijkheden heeft als een diepe opname van subcorticale structuren zoals de hippocampus, maar zoals vermeld, zullen verschillende voorbereidende stappen veranderen. Draadloze apparatuur lost bijna alle beperkingen van een conventionele draadbenadering op, zoals de mobiliteitsproblemen van dieren van de ene kooi naar de andere, gehinderde of verstrengelde dieren met de kabels. Deze installatietechniek is gebruiksvriendelijk, zoals hierboven beschreven, en een bijna ongetrainde of niet-gespecialiseerde groep experts of individuen kan deze software gebruiken. De prijs voor de EEG-apparatuur is lager dan een gewone EEG-versterker. Behavioral Tracking Software is ook een van de meest betaalbare software voor videotracking op de markt. Deze software vereist jaarlijkse licenties. De apparatuur kan worden gebruikt in meer dan één experimentele opstelling, verschillende dieren en het type veelzijdigheid. We hopen dat deze inspanning de wetenschappelijke gemeenschap zal helpen en een gemakkelijke toegang zal bieden om tegelijkertijd het gedrag en de elektro-encefalografie te bestuderen.
Disclosures
Dr. Sylvia Ortega-Martinez werkt als werknemer van Stoelting Co., een bedrijf dat de productie en open toegang tot dit artikel verzorgde en sponsorde.
Acknowledgments
We willen de heer Miguel Burgos en de heer Gustavo Lago bedanken voor het verlenen van technische assistentie. We zijn de Stoelting Co. dankbaar voor het dekken van de videoproductiekosten, Jinga-hi, Inc. voor het verlenen van technische assistentie en División de Investigación y Posgrado van de Universidad Iberoamericana Ciudad de México voor het toekennen van fondsen aan dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
| #4 Scalpel and blade | |||
| 50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
| 8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
| 8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
| Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
| ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
| benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
| Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
| Camera | Logitech | c920 | |
| Copper wire | |||
| Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
| DELL PC | DELL | ||
| Electrode | |||
| JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
| Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
| MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
| Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
| Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
| Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
| Screws | |||
| Screws equiped with electrode | |||
| Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
| Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
| Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
| Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |
References
- Hånell, A., Marklund, N. Structured evaluation of rodent behavioral tests used in drug discovery research. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 1-13 (2014).
- Buenrostro-Jáuregui, M., et al. SEXRAT MALE: A smartphone and tablet application to annotate and process live sexual behavior in male rodents. Journal of Neuroscience Methods. 320, 9-15 (2019).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term behavioral tracking of freely swimming weakly electric fish. Journal of Visualized Experiments. (85), e50962 (2014).
- Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
- Zheng, W., Ycu, E. A. A fully automated and highly versatile system for testing multi-cognitive functions and recording neuronal activities in rodents. Journal of Visualized Experiments. (63), e3685 (2012).
- Melo-Thomas, L., et al. A wireless, bidirectional interface for in Vivo recording and stimulation of neural activity in freely behaving rats. Journal of Visualized Experiments. (129), e56299 (2017).
- Noldus, L. P. J. J., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. J. Ethovision Video Tracking System. Behavior Research Methods, Instruments, and Computers. 33 (3), 398-414 (2001).
- Datta, S. R., Anderson, D. J., Branson, K., Perona, P., Leifer, A. Computational Neuroethology: A Call to Action. Neuron. 104 (1), 11-24 (2019).
- Medlej, Y., et al. Enhanced setup for wired continuous long-term EEG monitoring in juvenile and adult rats: application for epilepsy and other disorders. BMC Neuroscience. 20, 8 (2019).
- Weiergräber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
- Etholm, L., Arabadzisz, D., Lipp, H. P., Heggelund, P. Seizure logging: A new approach to synchronized cable-free EEG and video recordings of seizure activity in mice. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 254-260 (2010).
- Jinga-hi. JAGA16 Wireless Electrophysiology Recording Device. , Available from: https://www.jinga-hi.com/hardware-jaga16 1 (2020).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Bruel-Jungerman, E., Laroche, S., Rampon, C. New neurons in the dentate gyrus are involved in the expression of enhanced long-term memory following environmental enrichment. European Journal of Neuroscience. 21 (2), 513-521 (2005).
- Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).
- Trinchero, M. F., Herrero, M., Monzón-Salinas, M. C., Schinder, A. F. Experience-Dependent Structural Plasticity of Adult-Born Neurons in the Aging Hippocampus. Frontiers in Neuroscience. 13, 739 (2019).
- Shors, T. J., et al. Erratum: Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories (Nature (2001) 410 (372-376)). Nature. 414 (6866), 938 (2001).
- Song, H., et al. New neurons in the adult mammalian brain: Synaptogenesis and functional integration. Journal of Neuroscience. 25 (45), 10366-10368 (2005).
- Zhao, C., Teng, E. M., Summers, R. G., Ming, G. L., Gage, F. H. Distinct morphological stages of dentate granule neuron maturation in the adult mouse hippocampus. Journal of Neuroscience. 26 (1), 3-11 (2006).
- Irvine, G. I., Logan, B., Ecket, M., Abraham, W. C. Enriched environment exposure regulates excitability, synaptic transmission, and LTP in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 16 (2), 149-160 (2006).
- Tashiro, A., Makino, H., Gage, F. H. Experience-specific functional modification of the dentate gyrus through adult neurogenesis: A critical period during an immature stage. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3252-3259 (2007).
- Moreno-Jiménez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavioural Brain Research. 285, 105-117 (2015).
- Fagan, J. Memory in the infant. Journal of Experimental Child Psychology. 9 (2), 217-226 (1970).
- Baxter, M. G., et al. I've seen it all before" Explaining age-related impairments in object recognition. Theoretical comment on Burke et al. Behavioral Neuroscience. 124 (5), 706-709 (2010).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: Neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 31 (1), 47-59 (1988).
- Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
- Forwood, S. E., Winters, B. D., Bussey, T. J. Hippocampal lesions that abolish spatial maze performance spare object recognition memory at delays of up 48 hours. Hippocampus. 15 (3), 347-355 (2005).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
- Stoelting Co. Getting started with ANY-maze Setting up and starting work with ANY-maze. , Available from: https://www.braintreesci.com/images/ANYMaze.pdf (2006).
- Stoelting Co. A detailed description of the ANY-maze measures. , Available from: https://www.anymaze.co.uk/a-detailed-description-of-the-any-maze-measures.pdf (2010).
