Summary
Das hier vorgestellte Protokoll liefert Informationen zur simultanen Elektroenzephalografie (EEG) und Verhaltensbeurteilung in Echtzeit. Wir haben alle Schritte, die mit diesem Protokoll verbunden sind, als attraktive Lösung für Forscher in vielen Bereichen der Neurowissenschaften diskutiert, insbesondere in Lern- und Gedächtnisbereichen.
Abstract
Die Amplitude der Gehirnwellen, die aus der Elektroenzephalografie (EEG) gewonnen wird, ist als Grundlage für kognitive Fähigkeiten, Gedächtnis und Lernen bei Tieren und Menschen anerkannt. Der Mechanismus der adulten Neurogenese ist auch mit der Verbesserung des Gedächtnisses und des Lernens verbunden. Traditionell bewerteten Forscher Lern- und Gedächtnisparameter in Nagetiermodellen anhand von Verhaltensaufgaben. Daher ist die gleichzeitige Überwachung von Verhaltensänderungen und EEG besonders interessant, um Daten zwischen Gehirnaktivität und aufgabenbezogenem Verhalten zu korrelieren. Die meisten Geräte, die für die Durchführung beider Studien erforderlich sind, sind jedoch entweder komplex, teuer oder verwenden ein kabelgebundenes Netzwerk, das die Bewegung der natürlichen Tiere behindert. In dieser Studie wurde das EEG mit einem drahtlosen elektrophysiologischen Gerät zusammen mit der Ausführung einer neuartigen Objekterkennungsaufgabe (NORT) aufgezeichnet. Das Verhalten des Tieres wurde gleichzeitig durch ein Video-Tracking-System überwacht. Beide Aufzeichnungen wurden offline anhand ihrer Zeitstempel analysiert, die synchronisiert wurden, um EEG-Signale mit den Aktionen des Tieres zu verknüpfen. Die Probanden bestehen aus erwachsenen Wistar-Ratten nach einer mittelfristigen Umweltanreicherungsbehandlung. Sechs Schädelschraubenelektroden wurden paarweise auf beiden Hemisphären über frontalen, zentralen und parietalen Regionen befestigt und auf eine Elektrode bezogen, die sich hinter dem Nasenbein befand. Das NORT-Protokoll besteht darin, das Tier 10 Minuten lang zwei identischen Objekten auszusetzen. Nach 2 h und 24 h wurde eines der Objekte durch ein neuartiges ersetzt. Die Explorationszeit für jedes Objekt wurde durch eine Behavioral Tracking Software (BTS) und EEG-Datenaufzeichnung überwacht. Die Analyse des EEGs, das mit Verhaltensdaten synchronisiert wird, besteht aus Schätzungen der relativen Alpha- und Beta-Bandleistung und Vergleichen zwischen der Erkennung neuartiger Objekte und der Erkundung vertrauter Objekte zwischen drei experimentellen Phasen. In diesem Manuskript haben wir den Herstellungsprozess von Elektroden, die Implantationschirurgie von epiduralen Elektroden, das Protokoll zur Anreicherung der Umgebung, das NORT-Protokoll, das BTS-Setup, die EEG-BTS-Kopplung für die gleichzeitige Überwachung in Echtzeit und die EEG-Datenanalyse auf der Grundlage der automatischen Ereigniserkennung besprochen.
Introduction
Verhaltenstests sind in der neurowissenschaftlichen Forschung für eine große Menge an Informationen, die in einem In-vivo-Kontext generiert werden, von entscheidender Bedeutung. In diesem Zusammenhang haben Forscher in großem Umfang verschiedene Verhaltenstests verwendet, um sensomotorische Funktionen, soziale Interaktionen, angstähnliches und depressives Verhalten, Substanzabhängigkeit und verschiedene Formen kognitiver Funktionen zu analysieren1. Die manuelle Aufzeichnung von Verhaltenstests kann selbst für die meisten erfahrenen Beobachter schwierig, anstrengend und ungenau sein. Obwohl einige Anstrengungen unternommen wurden, um freie und quelloffene Software für die Verhaltensregistrierung zu entwickeln (z. B. Sexrat Männchen2 App für Sexualverhalten), ermöglichen mehrere Alternativen die automatische und Echtzeit-Verhaltensaufzeichnung verschiedener Tierarten von Fisch3 bis Nagetieren 4,5,6. Video-Tracking ist eine wertvolle Methode zur schnellen und genauen Verhaltensaufzeichnung, die in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt wird7. Eine weitere potenzielle Funktion im Bereich der Verhaltensaufzeichnung ist die Erforschung der neuronalen Aktivität während der Verhaltensmanifestation. Die gleichzeitige Aufzeichnung von neuronaler Aktivität (von einzelnen Zellen bis zu den großen Hirnarealen) und Verhaltensaufgaben könnte uns zeigen, wie das Gehirn bestimmte Verhaltensmuster generiert8. Verhaltensweisen sind eine Abfolge von Nebenkomponenten, die Korrelate zwischen der neuronalen Aktivität und Bewegungen oder Aktionen aufdecken können. Wenn neuronale Aktivität und Verhaltensmuster gleichzeitig über mehrere Zeitskalen aufgezeichnet werden könnten, könnten sie erklären, wie jeder Gehirnzustand mit jedem bestimmten Verhalten korreliert (für eine eingehendere Untersuchung der Verhaltensaufzeichnung siehe Datta et al., 2019 Review8). Daher wird die synchronisierte Aufzeichnung von Verhaltens- und neuronalen Aktivitäten auf der gewünschten Skala (von Neuronen bis hin zu großen Bereichen des Gehirns) als äußerst nützliches Werkzeug angesehen. Es gibt mehrere Systeme, die Verhaltensaufzeichnungen mit anderen Messungen wie neuronaler Aktivität integrierensollen 4,5.
Obwohl die Elektroenzephalografie als eine der am weitesten verbreiteten Techniken im Bereich der klinischen und wissenschaftlichen Neurowissenschaften gilt, macht die relativ hohe Mobilität sowie die Größe des EEG-Aufzeichnungsgeräts diese Technik einzigartig und schwierig für den Nachweis im Falle von In-vivo-Modellen9. Einige Lösungen für dieses Problem wurden entwickelt, z.B. die Verwendung von Kabeln und Schwenkvorrichtungen, die es den Tieren ermöglichen, sich frei in der Arena zu bewegen. Nichtsdestotrotz stellen kabelgebundene Systeme oft Probleme bei der Durchführung von Studien dar, z. B. wird beim Transfer eines Tieres von einem Käfig in einen anderen eine Behinderung oder ein Verfangen des Tieres mit den Kabeln beobachtet. Für drahtlose elektrophysiologische Ableitungen wurden telemetrische Vorrichtungen entwickelt, um die Flexibilität der Aufzeichnungssituation10,11 zu erhöhen. Solche Systeme haben jedoch aufgrund ihrer geringen Anzahl von Aufzeichnungskanälen und niedrigen Abtastraten erhebliche Einschränkungen gezeigt11. In dieser Studie verwendeten wir ein kommerziell erhältliches drahtloses System, das EEG-Signale vom Tier über eine Wi-Fi-Verbindung mit einem sich frei bewegenden Nagetiersystemsendet 12. Das Gerät wiegt 6 Gramm und hält bis zu 16 Kanälen stand, die mit 1 kSps aufgezeichnet werden. Dieses System ermöglicht die EEG- oder Spike-Aufzeichnung in der Tierumgebung mit einer reduzierten Störung und stellt im Vergleich zu den herkömmlichen elektrophysiologischen Systemen auf dem Markt eine wirtschaftliche Lösung dar. Darüber hinaus haben wir diese Daten mithilfe einer Video-Tracking-Software synchronisiert, um eine Korrelation zwischen EEG und Verhaltensmustern herzustellen. Diese Synchronisation erfolgt offline durch Abgleich und Interpolation von Daten und Ereignissen auf der Grundlage von Zeitstempeln, die von beiden Systemen generiert werden, und wird auf MATLAB verarbeitet.
Die adulte Neurogenese ist definiert als die Proliferation, das Überleben und die Differenzierung von neu erzeugten Zellen im Gyrus dentatus von Tieren in Neuronen13,14. Es ist bekannt, dass dieser Prozess mit einer Verbesserung des Gedächtnisses und des Lernens verbunden ist, die die adulte Neurogenese bei Nagetieren durch angereicherte Umgebungsbedingungen (EE) erhöht15. EE besteht aus der Unterbringung von Nagetieren in kleinen Gruppen in einem großen Käfig, der mit Spielzeug und Schläuchen ausgestattet ist, wobei die Tiere neuartige und komplexe, aber keine biologische Relevanz haben15. Obwohl EE die Neurogenese des Hippocampus stimuliert, variiert sie auch in vielen Faktoren wie Alter, Tierstamm, spezifische Stimulationsbedingungen oder Verfahren zum Nachweis der Neurogenese. Bei Mäusen mittleren Alters, die sieben Tage lang EE-Ställen ausgesetzt waren, wurde die Geburt neuer Körnerzellen (GC) im Gyrus dentatus (DG) des Hippocampus berichtet16. Studien, die versuchten, die adulte Neurogenese bei erwachsenen Ratten selektiv abzulieren, deuten darauf hin, dass neue Körnerzellen im Alter von etwa 1 - 2 Wochen für die erlernte Reaktion erforderlich sind17. Etwa 2 bis 3 Wochen nach der Geburt der GC treten bei erwachsenen DG mehrere charakteristische Merkmale wie dendritische Dornen auf, die für die exzitatorische synaptische Übertragung18 unerlässlich sind. Zhao et al. führten eine quantitative Analyse durch, um zu zeigen, dass der Höhepunkt des Wirbelsäulenwachstums in den ersten 3 - 4 Wochen auftritt19. Mehrere elektrophysiologische In-vivo-Studien deuten darauf hin, dass nur drei Wochen EE-Haltungsbedingungen Veränderungen in der synaptischen Übertragung des DG hervorrufen und die Erregbarkeit der Zellen erhöhen20. Es wurde auch berichtet, dass die Exposition gegenüber einer angereicherten Umgebung 1–4 Wochen nach BrdU-Injektionen die Dichte von BrdU/NeuN-Zellen in der DG-Körnerschicht bei Mäusen signifikant erhöhte21. Diese Autoren vermuten, dass zwischen einer und drei Wochen nach der EE-Exposition eine kritische Phase besteht, da ein erheblicher Anstieg der Anzahl neuer Neuronen beobachtet wurde21. Studien zur adulten Hippocampus-Neurogenese (AHN) beim Menschen sind umstritten, da es keine direkten Beweise gab. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschrieb jedoch die Entwicklungsstadien von AHN im erwachsenen menschlichen Gehirn, identifizierte Tausende von unreifen Neuronen in der DG und demonstrierte damit die Bedeutung von AHN während des Alterns beim Menschen22. Basierend auf der zuvor erwähnten Evidenz ist die Untersuchung von AHN in Tiermodellen wichtiger denn je (für eine eingehendere Untersuchung von AHN siehe Leal-Galicia et al., 2019 Review15).
Wie bereits erwähnt, wurde der Hippocampus mit einer grundlegenden Funktion für Lern- und Gedächtniskapazitäten in Verbindung gebracht. Die Bildung von Erinnerungen durchläuft drei verschiedene Prozesse: Kodierung (Gedächtniserwerb), Konsolidierung (Speicherung) und Abruf (Gedächtniserkennung)23. Das Wiedererkennungsgedächtnis beim Menschen wird mit Hilfe der visuellen Paarvergleichsaufgabe24 getestet. Die Grundlagen menschlicher und tierischer Modelle des Gedächtnisses und der Amnesie sind die Verhaltenstests, die die Fähigkeit bewerten, einen zuvor präsentierten Reizzu erkennen 25,26, wie es die visuelle Paarvergleichsaufgabe beim Menschen tut. Daher ist einer der am häufigsten verwendeten Verhaltenstests zur Beurteilung der Fähigkeit eines Nagetiers, einen zuvor präsentierten Reiz, d. h. die Lern- und Gedächtnisfähigkeit, zu erkennen, die spontane neuartige Objekterkennungsaufgabe (NORT)23,27. Das NIRT-Protokoll besteht aus zwei identischen neuartigen Objekten in einer vertrauten Arena für 10 Minuten in der Akquisitionsstudie. Nach einer bestimmten Zeit zwischen 0 28 und48 Stunden29 (variable Zeit je nach Protokoll) wird das Tier in dieselbe Arena zurückgebracht, die eines der gleichen bekannten Objekte und ein neues Objekt enthält. Das Tier erkundet spontan das neuartige Objekt, wenn das vertraute Objekt auswendig gelernt wurde26. Das Präferenzverhältnis wird häufig bei der Bewertung der Explorationsleistung verwendet. Sie wird bestimmt, indem die gesamte Erkundungszeit des Objekts von der Erkundungszeit des neuen oder vertrauten Objekts geteilt wird. Der NORT hat einige Vorteile gegenüber anderen Erkennungsgedächtnistests. Am wichtigsten ist, dass es keine äußere Motivation, Belohnung oder Bestrafung erfordert. Es erzeugt keine stressigen Bedingungen. Schließlich ist kein Training erforderlich, um das Verhalten beim Erkunden der Objekte hervorzurufen (für eine eingehendere Untersuchung von NORT siehe Ref.23).
Daher ist die gleichzeitige Aufzeichnung mehrerer Datenmodalitäten und deren Integration in die Untersuchung von Lernen und Gedächtnis als Effekt der adulten Hippocampus-Neurogenese sehr attraktiv und bietet eine überzeugende Lösung für Forscher auf diesem Gebiet. In der vorliegenden Arbeit werden alle Prozesse aufgedeckt, die an der simultanen verhaltensbezogenen Video-Tracking-Bewertung (neuartige Objekterkennungsaufgabe) und der drahtlosen Elektroenzephalographie-Aufzeichnung beteiligt sind. Hier haben wir den Herstellungsprozess der Elektroden, die Implantation von Epiduralelektroden (Schädelschrauben), das Protokoll zur Anreicherung der Umgebung (für die Induktion der Neurogenese im Hippocampus), das NORT-Protokoll, das BTS-Setup, die EEG-BTS-Kopplung für die gleichzeitige Überwachung in Echtzeit sowie die EEG- und Verhaltensdatenanalyse in der MATLAB-Computerumgebung besprochen.
Protocol
Alle Verfahren folgen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publications N°8023, überarbeitet 1978), der von nationalen Gesundheitseinrichtungen und lokalen mexikanischen Gesetzen eingeführt wurde, um die Anzahl der Tiere zu reduzieren, die für den Tierschutz und das Verbot von Tierleid verwendet werden. Die Ethikkommission der Universidad Iberoamericana genehmigte die Versuchsprotokolle für die Verwendung von Tieren in dieser Studie.
1. Allgemeines Setup
- Installieren Sie die Behavioral Tracking Software gemäß den Herstellungsanweisungen auf einem Computer.
- Montieren Sie die Kamera direkt über dem Gerät, so dass sie nach unten zeigt. Die Kamera sollte an den Computer angeschlossen sein.
- Installieren Sie die für die Kamera erforderliche Treibersoftware (gemäß den Herstelleranweisungen).
- Wenn die Kamera über ein Zoomobjektiv verfügt, stellen Sie diese so ein, dass sie perfekt in das Display der Kamera passen.
- Schalten Sie den Autofokus-Modus (AF) der Kamera gemäß der Fertigungssoftware aus.
- Stellen Sie sicher, dass die Kamera in Echtzeit ordnungsgemäß funktioniert, und testen Sie den Videoaufnahmemodus, bis sie einsatzbereit ist.
2. Protokoll zur Umweltanreicherung (siehe Abbildung 1)
HINWEIS: Für dieses Experiment wurden drei Monate alte männliche Wistar-Ratten verwendet, die unter natürlichen Dunkel-Licht-Bedingungen gehalten wurden.
- Legen Sie die Sägemehleinstreu in eine transparente quadratische Acrylarena (500 x 500 x 500 mm).
- Stellen Sie drei verschiedene Arten von Spielzeug auf die Arena, mit denen Nagetiere interagieren können (z. B. Aktivitätsräder, Doppeldeck, Treppen usw.).
- Fügen Sie vier 2-Zoll- und vier gebogene graue, undurchsichtige PVC-Rohre hinzu.
- Stellen Sie Futter- und Wasserspender zur Verfügung , die den Tieren freien Zugang ermöglichen.
- Stellen Sie drei Nagetiere pro Käfig unter normalen Bedingungen in den Vivariumsraum.
- Lassen Sie die Tiere in dieser Arena für die Zeit, die gemäß dem entsprechenden Protokoll erforderlich ist. Bei diesem Experiment sollten die Tiere 20 Tage in der Arena bleiben.
HINWEIS: Nach der Elektrodenimplantation kehren die Tiere nicht zur Behandlung mit Umweltanreicherung zurück. Stattdessen wurden sie in einzelne Käfige gesteckt, bis der neuartige Objekterkennungstest abgeschlossen ist.
3. Herstellungsprozess der Elektroden
- Schneiden Sie ein Stück Kupferdraht ca. 2 cm ab und reiben Sie mit einem Schleifpapier ca. 0,5 cm von jedem Ende ab.
- Rollen Sie ein Ende des Kupferdrahtes an den Kopf einer kleinen Schraube (Elektroden) und stellen Sie sicher, dass er fest sitzt, da dies ein entscheidender Schritt ist. Der korrekte Kontakt zwischen beiden Materialien muss gewährleistet sein, um Artefakte in den EEG-Signalen zu vermeiden.
- Stecken Sie das andere Ende in die Anschlussspitze des Steckverbinders und stellen Sie sicher, dass es richtig befestigt ist, indem Sie es mit einer feinen Pinzette verstärken. Diese Spitze sollte mit einem Verstärkerkabel verbunden werden.
- Messen Sie die geeignete Leitfähigkeit von der Spitze bis zur Schraube mit einem Multimeter. Dieser Prozess garantiert, dass der Elektrodenanschluss ordnungsgemäß installiert ist.
4. Epidurale (Schädelschraube) Elektroden-Implantationschirurgie
HINWEIS: Nach 20-tägiger Behandlung zur Anreicherung der Umwelt werden die Tiere nach dem unten beschriebenen Verfahren operiert:
- Injizieren Sie dem Tier einen Cocktail aus Ketamin/Xylazin (90/10 mg/kg, i.p.).
Anmerkungen: Um eine Obstruktion der Atemwege zu vermeiden, warten Sie, bis sich die Ratte nicht mehr bewegt, nehmen Sie sie dann aus dem Käfig und legen Sie das Tier auf eine ebene Fläche. Injizieren Sie ein nichtsteroidales Antirheumatikum (Meloxicam 1 mg/kg, s.c.) und ein Antibiotikum (Enrofloxacin 2,5 mg/kg, p.o.) als präventive Analgesie. - Sobald die Ratte vollständig betäubt ist, rasieren Sie den Kopfbereich der Ratte.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt ist, bevor Sie mit der Operation fortfahren. Kneifen Sie vorsichtig eines der Beine oder den Schwanz zusammen. Wenn das Tier auf den Reiz reagiert, warten Sie noch ein paar Minuten und kneifen Sie es erneut. Wenn das Tier nicht auf das Kneifen reagiert, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn die erforderliche Ausrüstung vorhanden ist, wird die Verwendung von Gasanästhetika (z. B. Isofluran) dringend empfohlen, da es aus Sicherheitsgründen leichter titriert werden kann. - Setzen Sie das Tier auf den stereotaktischen Apparat, indem Sie beide Ohren zuerst mit den Ohrbügeln fixieren (achten Sie darauf, das Innenohr des Tieres nicht zu verletzen). Zum Schluss werden die Vorderzähne über die Bissleiste gelegt und die Nasenleiste gesichert.
Anmerkungen: Stellen Sie dem Tier während der gesamten Operation ein Heizkissen zur Verfügung, da die bei diesem Verfahren verwendete Anästhesie normalerweise zu Unterkühlung und Atemproblemen führt. - Reinigen Sie die Oberseite des Kopfbereichs mit drei abwechselnden Runden Chlorhexidin- oder Jod-basiertem Peeling, gefolgt von einer Spülung mit Kochsalzlösung oder Alkohol.
- Lidocain subkutan (20 mg/ml) unter die Haut des Kopfbereichs (0,5 ml) verabreichen.
- Geben Sie jedem Tier alle 5-10 Minuten einen Tropfen Augenlösung oder Kochsalzlösung in die Augen, damit es nicht austrocknet.
- Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt von ca. 2 cm von vorne nach posterior, um die obere Region des Schädels richtig freizulegen.
- Ziehen Sie die Haut mit Bulldoggenklammern zurück und kratzen Sie das Gewebe über dem Schädel ab.
- Identifizieren und notieren Sie die erhaltenen Bregma-Koordinaten.
- Ausgehend von Bremma lokalisieren und markieren Sie mit den stereotaktischen Paxinos und Watson Atlas30 die Position jedes der sieben Punkte (Koordinaten), an denen die Elektroden befestigt werden sollen.
HINWEIS: In diesem Experiment F3, F4 Schrauben (+2,0 mm von Bregma, 2,25 mm seitlich von der Mittellinie); Schrauben C3, C4 (−3,0 mm von Bregma, 2,75 mm seitlich von der Mittellinie); und P3, P4 Schrauben (−7,0 mm von Bregma, 2,75 mm seitlich von der Mittellinie) wurden installiert. Eine siebte Schraube befand sich posterior des Nasenbeins (NZ), als Bodenreferenz (siehe Abbildung 2). - Bohren Sie mit einem Bohrwerkzeug mit variabler Geschwindigkeit ein Loch mit einer Spitze der Größe 2 (Länge 44,5 mm) auf jede der Markierungen, achten Sie darauf, den Schädel nicht vollständig zu durchdringen.
- Führen Sie die Elektrode in das Loch ein und schrauben Sie sie vorsichtig in den Schädel.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.10 und 4.11, bis alle sieben Schrauben richtig befestigt sind.
- Befestigen Sie alle 7 Schrauben mit einer ersten Schicht Zahnzement. Stecken Sie jede Elektrode in einen Stecker. Bedecken Sie die Drähte vollständig mit einer zweiten Schicht Zahnzement (sie verhindert, dass das Tier Schrauben abzieht) und der Unterseite des Steckers. Falls erforderlich, mit einer dritten Schicht Zahnzement abdecken und den EEG-Anschluss sauber lassen, damit das EEG-Gerät ordnungsgemäß angeschlossen werden kann (siehe Abbildung 3).
HINWEIS: Nach dem Einsetzen jedes Paares beidseitiger Schrauben können diese mit Zahnzement fixiert werden (optionaler Schritt). - Lassen Sie die Ratte über Nacht in der postoperativen Pflege. Beobachten Sie das Tier und versorgen Sie das Tier 1-2 Stunden nach der Operation mit einem Heizkissen, da die bei diesem Verfahren verwendete Anästhesie in der Regel zu Unterkühlung und Atemproblemen führt.
- Verabreichen Sie 50 ml/kg/24 Stunden (Erhaltungsdosis) Kochsalzlösung subkutan, um eine Dehydrierung zu verhindern. Injizieren Sie nach der Operation und für die nächsten 24 Stunden ein nichtsteroidales Antirheumatikum (Meloxicam 2 mg/kg, s.c.) und ein Antibiotikum (Enrofloxacin 5 mg/kg, p.o.).
- Halten Sie die Ratten nach der Operation sieben Tage lang in Einzelkäfigen, um sich vollständig zu erholen, bevor Sie die Verhaltenstests durchführen.
- Manipulieren Sie das Tier in regelmäßigen Abständen (mindestens einmal täglich) sanft, um den Stress bei zukünftigen Manipulationen zu reduzieren. Während die Ratte mit einer Hand gehalten wird, wird sanft Druck auf den Rücken des Tieres ausgeübt, wobei die Finger durch das Fell gleiten. Überprüfen Sie die Kopfwunde, den Gesundheitszustand, das Verhalten im Allgemeinen und das Körpergewicht für einen Zeitraum von einer Woche nach der Operation.
Anmerkungen: Wenn beim Tier Anomalien oder Anzeichen von Krankheit/Stress festgestellt werden, benachrichtigen Sie den zuständigen Tierarzt. Führen Sie nach diesem Zeitraum den neuartigen Objekterkennungstest und die EEG-Aufzeichnungstechnik durch.
5. Neuartiger Objekterkennungstest (NORT)
HINWEIS: Sieben Tage nach der Operation werden Verhaltenstests durchgeführt. Alle Verhaltensprozeduren im vorgestellten Experiment wurden zwischen 14 h 00 min und 16 h 00 min durchgeführt, was dem Lichtzyklus der Ratte entspricht.
- Legen Sie eine Weste aus weichem Stoff (auf die das EEG-Gerät während des Verhaltenstests gelegt wird) auf die Ratte. Warten Sie 2-3 Tage auf Gewöhnung, bevor Sie den Verhaltenstest durchführen.
- Stellen Sie eine quadratische Arena aus schwarzem Acryl (500 x 500 x 500 mm) in einen schwach beleuchteten Aufnahmeraum.
- Befestigen Sie zwei identische neuartige Objekte mit doppelseitigem Klebeband in der Bodenmitte der Arena (um zu verhindern, dass sie von den Tieren verschoben werden). Objekte müssen in gleichem Abstand zueinander und zu den Wänden der Arena stehen.
- Reinigen Sie jedes Objekt vorher gründlich mit 50% Ethanol sowie den Boden der Arena nach jedem Versuch (um Geruchsreize zu vermeiden).
HINWEIS: Bringen Sie die Tiere immer mindestens eine halbe Stunde vor Beginn jeder Sitzung in Haltungsräume (vom Vivariumsraum in den Versuchsraum). Lassen Sie die Tiere nach Abschluss der Aufnahmesitzung für eine weitere Stunde im Versuchsraum. Dies dient dazu, Stress zu vermeiden, der die Leistung dieses Tests beeinträchtigen könnte. - Schließen Sie das EEG-Gerät an, bevor Sie mit jedem Test beginnen. Halten Sie das Tier vorsichtig fest und führen Sie das Kabel fest in den Stecker am Kopf des Tieres ein, wobei das EEG-Kit am Rücken des Tieres befestigt ist (siehe Abbildung 4). Es ist nur eine Position erlaubt.
Anmerkungen: Eine sanfte vorherige Manipulation des Tieres kann dazu beitragen, den Stress bei den Tieren während des Verbindungsvorgangs zu reduzieren. Andernfalls steigt das Risiko einer Beschädigung des Gerätes oder der Tiere. Laden Sie den Akku des Geräts über einen USB-Anschluss vollständig auf. - Testphasen für neuartige Objekterkennung
- Gewöhnung: Fassen Sie das Tier an zwei aufeinanderfolgenden Tagen in 5-Minuten-Intervallen an und stellen Sie das Tier unmittelbar danach auf die Arena (ohne Gegenstände) und lassen Sie es 10 Minuten lang frei erkunden.
HINWEIS: Vor der Durchführung von Erfassungs- und Gedächtnistestsitzungen wurden die Ratten sorgfältig behandelt und an das entsprechende EEG-Gerät angeschlossen, das vor Beginn des Tests ordnungsgemäß repariert wurde. - Erfassungssitzung: Platzieren Sie das Tier auf der Arena mit Blick auf eine der Wände gegenüber den Objekten. Lassen Sie die Tiere 10 Minuten lang frei erkunden. Fahren Sie mit Schritt 6.13 fort, um die Testaufzeichnung mit der Behavioral Tracking Software durchzuführen.
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass das EEG-Gerät die Weste, die am Rücken der Ratte befestigt ist, richtig hält (um eine ordnungsgemäße Verfolgung des Tieres zu gewährleisten). Verwenden Sie zur zusätzlichen Verstärkung Kreppband. - Kurzzeitgedächtnistest (SMT): Ersetzen Sie eines der Objekte durch ein anderes, das sich in Form, Farbe und Textur völlig unterscheidet. Platzieren Sie das Tier 2 Stunden nach der Erfassungssitzung in der Arena mit Blick auf eine der Wände gegenüber den Objekten. Lassen Sie das Tier 10 Minuten lang frei erkunden. Fahren Sie mit Schritt 6.13 fort, um die Testaufzeichnung mit der Behavioral Tracking Software durchzuführen.
- Langzeitgedächtnistest (LMT): Ersetzen Sie das verwendete Objekt durch ein anderes, das sich in Form, Farbe und Textur völlig von dem des Kurzzeitgedächtnistests unterscheidet. Platzieren Sie das Tier 24 Stunden nach der Erfassungssitzung in der Arena mit Blick auf eine der Wände gegenüber den Objekten. Lassen Sie das Tier 10 Minuten lang frei erkunden Fahren Sie mit Schritt 6.13 fort, um die Testaufzeichnung mit der Behavioral Tracking Software durchzuführen.
- Gewöhnung: Fassen Sie das Tier an zwei aufeinanderfolgenden Tagen in 5-Minuten-Intervallen an und stellen Sie das Tier unmittelbar danach auf die Arena (ohne Gegenstände) und lassen Sie es 10 Minuten lang frei erkunden.
6. Einrichtung der Verhaltens-Tracking-Software
- Öffnen Sie die Behavioral Tracking Software.
- Melden Sie sich mit dem Benutzer und dem Passwort der Institution beim Konto an.
- Öffnen Sie den Tap "Neues leeres Experiment" und wählen Sie einen Namen für das Protokoll (z. B. "NORT").
- Wählen Sie "Video-Tracking-Modus".
HINWEIS: In diesem Experiment ist die Kamera so eingerichtet, dass das Video-Tracking live gestreamt wird. Es gibt jedoch eine zusätzliche Option zur Auswahl vorab aufgezeichneter Videos. - Gehe zu "Apparat". Definieren Sie den Arenabereich, indem Sie das orangefarbene Rechteck an die Grenzen der projizierten Arena anpassen. Bestimmen Sie den Bereich des Objekts, indem Sie die orangefarbenen Kreise am Rand des Objekts innerhalb der Arena anpassen, die von der Kamera auf den Bildschirm projiziert wird.
- Richten Sie die Lineallinie für die Skalierung auf eine Position entlang der bekannten Länge des Bildes (der Arena) ein. Geben Sie die Länge des Objekts in Millimetern in der Option "Die Länge der Lineallinie ist" in der Einstellungsleiste ein. In diesem Fall misst die Arena 500 x 500 mm.
- Gehen Sie zu "Tracking und Verhalten". Fahren Sie mit "Zonen" fort. Klicken Sie auf das Menü "Element hinzufügen" und wählen Sie "Neue Zone". Wählen Sie den Arenabereich aus und benennen Sie die neue Zone (z. B. "Feld").
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit dem Bereich der Objekte und benennen Sie die neue Zone (z.B. "Objekte").
- Gehen Sie zu "Tierfarbe" und wählen Sie die Option "Die Tiere sind heller als der Gerätehintergrund".
HINWEIS: Für dieses Experiment wurden weiße (Wistar) Ratten verwendet. Die Software bietet jedoch zusätzliche Optionen für Forscher, die schwarze und gefleckte Ratten verwenden. Beide Tierrassen können im selben Experiment verwendet werden. - Gehen Sie zu "Kopf und Schwanz des Tieres verfolgen" und wählen Sie "Ja, ich möchte, dass Kopf und Schwanz des Tieres verfolgt werden".
- Gehe zu "Testen" | "Phasen" und wählen Sie im Menü "Element hinzufügen" die Option "Neue Phase". Nennen Sie die neue Phase "Akquise". Legen Sie die Dauer der Phase fest (z. B. 600 s).
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt der Phasen "Test des Kurzzeitgedächtnisses" und "Test des Langzeitgedächtnisses".
HINWEIS: In diesem Protokoll haben alle Phasen die gleiche Dauer (10 Minuten). - Gehen Sie zu "Verfahren". Definieren Sie die Ereignisse, die für jede Phase (Erfassung, Kurzzeitgedächtnistest und Langzeitgedächtnistest) verfolgt werden sollen.
- Starten Sie den Test (mit jedem Tier). Gehen Sie zu "Tests" (in der oberen Menüleiste) und wählen Sie "Test hinzufügen (+)". Vergeben Sie eine Nummer für das zu testende Tier (z.B. "1").
- Wählen Sie "Aufzeichnen" und benennen Sie die Tiere und die Sitzung (z. B. "M1 Acq").
- Bevor Sie das Tier in die Arena setzen, klicken Sie einmal auf die Schaltfläche "Spielen". Die Meldung "Warten auf Start" wird angezeigt.
- Nachdem Sie das Tier in der Arena platziert haben, klicken Sie ein zweites Mal auf die Schaltfläche "Spielen". Der Test wird automatisch gestartet und beendet.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.13-6.16 für den Kurzzeitgedächtnistest (2 h nach der Erfassungssitzung) und den Langzeitgedächtnistest (24 h nach der Erfassungssitzung).
7. Drahtlose Einrichtung des Elektrophysiologiegeräts
- Schließen Sie das Modem an einen PC-Host an und schalten Sie es ein. Schalten Sie alle anderen Netzwerkgeräte auf dem PC aus. Schalten Sie vorzugsweise alle anderen drahtlosen Kommunikationen im Registrierungsraum wie Bluetooth, Mobiltelefone, andere Modems oder sogar drahtlose Mobilteile stumm.
- Befestigen Sie den Verstärker auf dem Rücken der Ratte, wie in Schritt 5.5 beschrieben.
- Schalten Sie das EEG-Gerät ein, indem Sie die Batterie einstecken.
Anmerkungen: 2 s nach dem Anschließen des Geräts blinkt eine rote LED am EEG-Verstärker, die anzeigt, dass die Kommunikation mit dem Modem aktiv ist, und dann leuchtet die grüne LED auf. Wenn die Kommunikation erfolgreich ist, beginnen die LEDs am Modem kontinuierlich zu blinken. Der Verstärker ist nun bereit, Informationen an das Modem zu senden. - Starten Sie die EEG-Software und richten Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers ein, um sie in das drahtlose EEG-Erfassungsgerät zu integrieren
- Drücken Sie die Taste "Display starten". Die EEG-Software zeigt die tatsächliche Signalerfassung an.
HINWEIS: Verwenden Sie den "Windows Task-Manager", um den Prioritätsmodus "Echtzeit" zuzuweisen, um zu vermeiden, dass beim Experimentieren Informationen fehlen.
8. Signalaufzeichnung der Elektroenzephalografie (EEG)
- Nachdem Sie überprüft haben, ob die EEG-Software Daten erfasst, starten Sie die Behavioral Tracking-Software und legen Sie das Versuchsprotokoll fest, um zu überprüfen, ob sich das Tier in der Beobachtungszone befindet und die Einrichtung korrekt funktioniert.
- Starten Sie an dieser Stelle die Aufzeichnung der EEG-Software, indem Sie auf die Schaltfläche "Aufzeichnung starten" klicken. Nachdem Sie überprüft haben, ob das Erfassungssignal läuft, beginnen Sie mit dem Experimentieren im BTS.
- Kehren Sie nach Beendigung des Experiments zur EEG-Software zurück und stoppen Sie den Aufzeichnungsvorgang. Die Aufnahme wird mit einem Standardnamen gespeichert, der aus dem Datum der Aufnahme im folgenden Format besteht: "yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". Standardmäßig werden alle Aufzeichnungen im Ordner der EEG-Software (NeurophysData) gespeichert.
- Überprüfen Sie, ob beide Datendateien erstellt wurden. Notieren Sie das Experimentprotokoll oder ändern Sie den Namen, um Verwechslungen zu vermeiden.
9. Synchronisierung von Verhaltensaufgaben und EEG-Signalen
- Öffnen Sie MATLAB und führen Sie den folgenden Befehl aus: convert_plx2mat. Eine solche Funktion öffnet eine Browserbox. Die Konvertierungsfunktionen werden vom Hersteller bereitgestellt und müssen dem Pfad von MATLAB hinzugefügt werden.
- Wählen Sie die zu konvertierende *.plx aus und drücken Sie "Enter" in der Befehlszeile von MATLAB, um sie in Standardparameter zu konvertieren.
- Öffnen Sie die BTS-Experimentierdatei und gehen Sie zu "Protokoll". Klicken Sie auf die Option "Ergebnisse, Berichte und Daten", wählen Sie alle Ereignisse beider Objekte aus und klicken Sie auf "Wählen Sie das Zeitformat für den Bericht", wählen Sie die dritte Option: "Ereigniszeiten als Echtzeit in HH:MM:SS.sss anzeigen - z.B. 13:20:14.791."
- Gehen Sie nun zu "Datei" und klicken Sie auf "Exportieren" und "Experiment als XML exportieren", aktivieren Sie "Datum und Uhrzeit des Tests" und klicken Sie schließlich auf "XML erstellen".
- Gehen Sie zu "Testdaten exportieren" und klicken Sie auf "Daten speichern". Es wird eine .csv Datei mit den Uhrzeiten der Ereignisse erstellt.
- Wiederholen Sie die Schritte 9.1 bis 9.5 für jede Datei. In unserem Fall waren die drei Experimente: ACQ, STM und LTM.
- Sobald die EEG- und Verhaltensdateien konvertiert sind, sammeln Sie sie in einem einzigen Ordner. Der Ordner muss sechs Dateien enthalten, die drei .mat-Dateien bzw. drei .csv. In unserem Fall hießen die Dateien: PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv und PID_03_LTM_M.csv. ID bezieht sich auf die Identifikationsnummer eines Tieres.
- Öffnen Sie die Funktion "procesa_sujeto.m" mit MATLAB und passen Sie die zweite Zeile an die ID des Tieres an.
- Verschieben Sie nun MATLAB in einen solchen Ordner und führen Sie Folgendes aus: "procesa_sujeto", um Abbildungen des relativen Alpha- und Beta-Bandes zur Leistung zu erstellen, die mit der Objekterkennung auf ACQ-, STM- und LTM-Bühnen verbunden sind.
HINWEIS: "procesa_sujeto" ist eine Funktion, die mehrere Signalverarbeitungsanalysen ausführt/ausführt. Diese Analysen werden in den Schritten 9.10 bis 9.15 wie folgt zusammengefasst. - Filtern Sie jedes EEG-Signal mit einem Butterworth-Bandpassfilter 4. Ordnung bei [5-40] Hz unter Verwendung der Phasenkorrektur.
- Visuelle Inspektion der Signale vor der folgenden Analyse, und diejenigen Kanäle mit Artefakten, die von einer fehlerhaften Platzierung der Elektroden oder einer Fehleinstellung durch Tierbewegungen herrührten, wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
- Referenzsignale auf den gemeinsamen Mittelwert, um Bewegungsartefakte zu verringern.
- Segmentieren Sie EEG-Signale, um Epochen von 4 s Länge zu bilden, die durch von BTS abgeleitete Zeitstempel synchronisiert werden. Die Zielereignisse waren die Erkundung des Objekts, das durch den Abstand des Tieres zur Objektgrenze markiert war. Diese Ereignisse sind auf den BTS-Zeitstempeln markiert und wurden als Bezeichner verwendet, um die Positionen der Fenster festzulegen. EEG-Epochen werden also um 1 s vor Beginn der Exploration bis 3 s danach abgegrenzt. Zum jetzigen Zeitpunkt wurde noch keine Validierung der Explorationslänge verwendet, aber sie wird für zukünftige Forschungen in Betracht gezogen.
- Abschätzung der spektralen Leistungsdichte für diese Epochen unter Verwendung der Welch'schen Periodogrammmethode unter Verwendung einer Fensterlänge von 1 s, einer Überlappung von 90%, Hanning-Fenster vor der Fourier-Transformationsschätzung, mit diesen Parametern wurde eine Auflösung von 1 Hz erreicht.
- Bewerten Sie das Leistungsspektral auf jedem Band, indem Sie die Fläche unter dem Periodogramm auswerten, und die dargestellten Werte entsprechen der relativen Energie, was bedeutet, dass die Energie jedes EEG-Bandes durch die Gesamtenergie der Epoche geteilt wurde. Dieses Verfahren reduziert auch fehlerhafte Schätzungen aufgrund von Artefakten auf EEG-Signalen.
Representative Results
Die oben beschriebenen Methoden wurden angewendet, um EEG und Rattenaktivität gleichzeitig nach der Umweltanreicherungsbehandlung aufzuzeichnen. Drei Monate alte männliche Wistar-Ratten wurden 20 Tage lang einem mittelfristigen Umweltanreicherungsbehandlungsprotokoll unterzogen, und sie wurden operiert, um sechs Schädelschraubenelektroden zu fixieren, die an frontalen, zentralen und parietalen Regionen gepaart waren und sich auf eine siebte Elektrode in Neuseeland bezogen. Die Tiere wurden unter natürlichen Dark-Light-Bedingungen gehalten, mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Diese Arbeit zeigt die Integration zwischen dem EEG-System und der Behavioral Tracking Software für eine simultane Live-Aufzeichnung. Wir haben nur Tiere verwendet, die nach dem EE-Protokoll behandelt wurden, da wir nicht vorgeben, die Wirksamkeit der Behandlung zu vergleichen, sondern nur die Vorteile der Ausrüstung zu veranschaulichen. Als Beweis dafür, dass das verwendete 20-Tage-Protokoll zur Anreicherung der Unterbringung die adulte Neurogenese stimuliert, präsentieren wir BrdU-positive Zellzahldaten von Tieren unter EE und Tieren, die unter Standardbedingungen gehalten wurden, aus unveröffentlichten Daten aus unserem Labor. Es wurden drei Monate alte männliche Wistar-Ratten verwendet. Sie wurden dreimal mit BrdU injiziert, im Abstand von 12 h zueinander. Die Tiere wurden betäubt (Pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) und durch transkardiale Perfusion euthanasiert (siehe Abbildung 5). Um sicherzustellen, dass die am EEG-Gerät befestigte Weste die Bewegungen der Tiere nicht einschränkt, führten wir den Freilandtest (OFT) in zwei Gruppen durch, eine Gruppe wurde während des Tragens des Geräts (Weste und EEG-Verstärker) operiert, und die andere Gruppe von Tieren blieb intakt, ohne die Hardware zu tragen. Wir fanden keine signifikanten Unterschiede in der Entfernung, die die Tiere in 10 Minuten Test zurücklegten (siehe Abbildung 5). Das typische NIRT-Protokoll besteht aus der Darstellung von zwei Objekten und dem Ersetzen eines von ihnen durch ein neues Objekt. Die Behavioral-Tracking-Software überwachte die Erkundungszeit.
Die Behavioral Tracking Software zeichnete eine Gruppe von Tieren auf, um ihre wichtigsten Leistungsparameter zu bewerten. Daher haben wir drei Parameter verwendet, um die Explorationsleistung zu bewerten. Das Präferenzverhältnis wurde anhand der Kopfzeit der Tiere in der Objektzone berechnet, die die Gesamtzeit angibt, die der Kopf der Tiere in jedem Objekt verbracht hat. Außerdem haben wir ein Präferenzverhältnis für die Zeit berechnet, die wir damit verbracht haben, sich auf die Objekte zuzubewegen, das die Gesamtzeit anzeigt, die für jedes Tier aufgewendet wurde, das sich auf jede Objektzone zubewegte. Zusätzlich wurde die aufgewendete Zeit pro Besuch jedes Objekts berechnet. Abbildung 6 zeigt die oben erwähnten Ergebnisse mit drei Parametern. In der Akquisitionsstudie gab es keine Unterschiede zwischen den Objekten in den drei untersuchten Parametern: Kopfzeit in der Objektzone für die drei Versuche, Zeit, die sich zu den Objekten bewegt für die drei Versuche und Zeit pro Besuch in jedem Objekt. In der STM-Studie gab es keine Unterschiede. Währenddessen wurde im LTM-Versuch ein signifikant höheres Explorationspräferenzverhältnis für das neuartige Objekt beobachtet. Darüber hinaus konnte in der LTM-Studie auch eine Präferenz für das neuartige Objekt in der pro Besuch verbrachten Zeit (Panel C) festgestellt werden. Video 1 zeigt ein repräsentatives Beispiel einer Ratte, das im Experiment aufgezeichnet wurde, während Video 2 ein repräsentatives Beispiel für eine gleichzeitige EEG- und Verhaltensaufzeichnung zeigt.
Es war möglich, die mit dem Behavioral Tracking verfolgten Zeitereignisse und die EEG-Softwareaufzeichnung unter Verwendung der Computeruhr abzugleichen. Abbildung 7 und Abbildung 8 zeigen die Änderungen der relativen EEG-Leistung über Alpha- und Beta-Banden. Diese beziehen sich auf motorische Kontrolle, Konzentration und Gedächtnis, was darauf hindeutet, dass die Erkundung nur mit diesen Funktionen zusammenhängt. Die Ergebnisse von Tier 3 zeigen, dass die Alpha-Leistung bei STM in Bezug auf ACQ und LTM tendenziell abnimmt, was auf eine Desynchronisation im Zusammenhang mit der Exploration oder dem Gedächtnisabruf hindeutet. Die Anzahl der Objekterkennungen (bearbeitete Epochen) war gering. Zu diesem Zeitpunkt ist es nicht möglich festzustellen, ob ein statistischer Test bestätigen würde, ob ein solcher Unterschied real ist, oder ob ein Artefakt in der Lage war, solche experimentellen Bedingungen zu erzeugen. Nichtsdestotrotz ist die Segmentierung, Markierung und Analyse von Epochen durch eine Zeitleiste gleichzeitiger Markierungsereignisse bei Tieren und EEG-Ergebnissen, die für zukünftige Forschungsprojekte erstellt wurden, möglich geworden. Die Kombination dieser Systeme verhindert eine fehlerhafte Identifizierung von Ereignissen durch einen manuellen Markierungsprozess, der zu einem wichtigen Problem bei Tierversuchen geworden ist. Die Kombination aus BTS und elektrophysiologischer (EP) Aktivität konnte genau mit dem Verhalten der Tiere in Verbindung gebracht werden. Nichtsdestotrotz erfordern die Versuchsbedingungen den Einsatz fortschrittlicher Signalverarbeitungstechniken, um Bewegungsartefakte zu eliminieren und den Versuchsaufbau effektiv zu verbessern.
Abbildung 1: Beispiele für einen Käfig unter Bedingungen der angereicherten Umgebung (EE). Die Behausung wurde mit Spielzeug und Röhren versehen, in denen die Tiere neuartige und komplexe, aber keine biologische Relevanz finden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Positionen der Epiduralelektroden im Rattenschädel. Die Schrauben dienten gleichzeitig als Anker für das Headset und als Elektroden. F = frontal; C = frontoparietal; P = parietal; 3 = links; 4 = rechts; NZ = als Massereferenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder einer Implantationsoperation mit epiduralen Elektroden (Schädelschraube). Das Bild zeigt implantierte intrakranielle Elektrodenschrauben bei Ratten in verschiedenen Stadien der Operation. Stellen Sie sicher, dass bei der Durchführung dieses Verfahrens aseptische Techniken befolgt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder einer Ratte zusammen mit dem Versuchsaufbau. Die Ratte musste die Weste, die mit einer eingebetteten Batterie am EEG-Gerät befestigt war, in der Arena tragen, die für das NORT-Protokoll verwendet wird. Das Bild zeigt das Headset und den Kabelstecker, der an der Ratte des Kopfes installiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Nachweis der Bewegungsfähigkeit und der Stimulation der adulten Neurogenese durch das EE-Protokoll. (A) Repräsentative Bilder der Tieraktivität für 10 Minuten im Open Field Test (OFT) und die durchschnittliche Entfernung, die Tiere, die die Ausrüstung/Operation tragen, und Tiere ohne die Ausrüstung/Keine Operation zurückgelegt haben. (B-E) Repräsentativer DG-Schnitt mit BrdU-markierten Zellen (intensiv dunkel) für EE- und Standard-Haltungsgruppen. Die Tafeln B und D zeigen eine geringe Vergrößerung der DG, und die Tafeln C und E zeigen den Kastenbereich bei höherer Vergrößerung. Die Paneele B und C sind Gewebe aus der EE-Gehäusegruppe, die Paneele D und E stammen aus der Standard-Gehäusegruppe. Der Einschub veranschaulicht die durchschnittliche Anzahl der beschrifteten Zellen in beiden Gruppen. ML - molekulare Schicht; GCL – granulare Zellschicht; SGZ – subgranulare Zone; arrows - BrdU+-Zellen. Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± SEM. Der T-Student-Test wurde verwendet, um Gruppen zu vergleichen. * S≤0,05. Im Open Field Test wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen gefunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Explorationsleistung bei der NORT-Bewertung. (A) Kopfzeit in der Objektzone für die drei Versuche. (B) Die Zeit, die sich auf die Objekte für die drei Prüfungen zubewegt. (C) Zeit pro Besuch in jedem Objekt. Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± SEM. Bei allen Parametern wurde eine zweifache ANOVA mit wiederholten Messungen und dem Mehrfachvergleichstest nach Sidak verwendet. * p≤0,05, ** p≤0,01 zwischen den Objekten in der jeweiligen Studie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Änderungen der Alpha-EEG-Bandleistung im Zusammenhang mit der Exploration. Diese Abbildung zeigt Änderungen der relativen Alpha-Leistung von einer halben Sekunde auf 2,5 Jahre, nachdem das Tier mit der Erkundung der Objekte begonnen hat. Die sechs Diagramme entsprachen den frontalen, zentralen und parietalen Elektroden (von oben nach unten) sowie der linken und rechten Seite. Boxplots zeigen die Verteilung solcher Zeitreihen für jede Bedingungskombination eines Objekts: "Vertraut" und "Neu" und Phase: "ACQ", "STM" und "LTM". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Änderungen der Beta-EEG-Bandleistung im Zusammenhang mit der Exploration. Diese Abbildung zeigt Veränderungen der relativen Beta-Leistung, von einer halben Sekunde auf 2,5 nachdem das Tier mit der Erkundung der Objekte begonnen hat. Die sechs Diagramme entsprachen den frontalen, zentralen und parietalen Elektroden (von oben nach unten) sowie der linken und rechten Seite. Boxplots zeigen die Verteilung solcher Zeitreihen für jede Bedingungskombination eines Objekts: "Vertraut" und "Neu" und Phase: "ACQ", "STM" und "LTM". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Repräsentatives Video, das eine Ratte zeigt, die im Experiment aufgenommen wurde. Die Ratte befand sich in der Arena, die für das NORT-Protokoll verwendet wurde. Die Ratte trug die Weste, die mit einer eingebetteten Batterie am EEG-Gerät befestigt war. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Repräsentatives Video mit gleichzeitiger EEG- und Verhaltensaufzeichnung. Das EEG-Signal wurde auf der linken Seite angezeigt, während der Verhaltenstest (NORT) auf der rechten Seite des Videos angezeigt wurde. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Discussion
Verhaltens- und Elektroenzephalographie-Forschung ist von Natur aus schwierig und herausfordernd. Daher stellt die Kombination beider Techniken wichtige kritische Schritte dar. Daher sind beide gleichzeitigen Techniken nicht weit verbreitet. In der Praxis führt jede Gruppe auf der ganzen Welt Verhaltenstests mit speziellen Bedingungen durch, wie z. B. Tieren, analysierten Parametern oder Behandlungen. Dies führt zu erheblichen Kontroversen in diesem Bereich und zur Notwendigkeit, Standardverfahren zu entwickeln, die für alle verfügbar sind. Hier haben wir dieses detaillierte Vorgehen mit allen kritischen Schritten und methodischen Überlegungen vorbereitet, die in den meisten veröffentlichten Artikeln normalerweise nicht beschrieben oder erwähnt werden. Diese werden im Folgenden erörtert.
Die Herstellung der benötigten Materialien ist ein grundlegender Schritt für den Erfolg dieser Technik. In diesem Zusammenhang muss die Elektrode mit Edelstahlschrauben, Kupferkabeln und Silberschweißgerät von Grund auf neu gebaut werden. Diese Materialien lassen sich nur schwer dauerhaft miteinander verschweißen, so dass die Leitfähigkeit und Festigkeit jeder Elektrode vor der Verwendung überprüft werden muss. Es ist möglich, eine andere Art von Draht für die Elektrodenanordnung zu verwenden. Das Kupfer ist jedoch flexibel genug, um die Elektrode zu manipulieren, um sie in den Verstärkeranschluss einzuführen. In dieser Hinsicht ist die Verwendung kommerzieller Elektroden wünschenswert, aber ihre Anschaffung könnte kompliziert und teuer sein. Die Operation ist einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll. Es ist sehr empfehlenswert und sogar notwendig, einen erfahrenen Chirurgen zu haben, insbesondere für die Implantation von Elektroden. Da die Operation häufig eine Verlängerung der Anästhesiezeit und manchmal eine Schweißapplikation während der Operation erfordert, muss jedes Labor die erforderlichen Tests mit der entsprechenden Anästhesie (es können verschiedene Cocktails verwendet werden) für jeden Nagetierstamm durchführen, insbesondere unter Vivariumsbedingungen, Unterschieden zwischen Würfen und sogar individuellen Unterschieden zwischen Tieren. Die richtige Planung und Überlegung könnte verhindern, dass Tiere während Operationen verloren gehen. Die Implantation der Elektroden ist ein weiterer entscheidender Schritt. Es erfordert große Sorgfalt, um zu vermeiden, dass der Schädel geschlagen wird und Hirnhäute oder Hirngewebe beschädigt werden. Schrauben sollten richtig platziert werden, d. h. vollständig im Schädel befestigt sein, da sonst Geräusche und Artefakte auf Signalen angezeigt werden, z. B. im Zusammenhang mit einer lausigen Colocation oder Bewegung, die die EEG-Aufzeichnung nicht verwendet. Prä- und postoperative Behandlungen und Bedingungen müssen immer durchgeführt und beachtet werden, um das Leiden des Nagetiers zu vermeiden. Subkutanes Lidocain kann auf die Kopfhaut aufgetragen werden, bevor der Schnitt mit dem Skalpell gemacht wird. Ein Tropfen Kochsalzlösung in die Augen des Tieres hilft, Trockenheit zu verhindern. Außerdem muss eine Kochsalzlösung in den Mund verabreicht werden, und nach der Operation muss 1 ml entweder subkutan oder intraperitoneal verabreicht werden, um den Flüssigkeitshaushalt des Tieres auszugleichen und eine Dehydrierung zu verhindern. Unmittelbar nach der Operation muss ein entzündungshemmendes Medikament (zur Schmerzlinderung) sowie Antibiotika über subkutane oder topische Antibiotika direkt an der Peripherie der Kopfhaut verabreicht werden, wo sich die Zahnzementkappe befindet (um die Wahrscheinlichkeit einer Infektion zu verringern). Wiederholen Sie den obigen Vorgang 24 Stunden nach der Operation. Die Positionierung des EEG-Verstärkers auf dem Rücken des Tieres ist die Hauptschwierigkeit für die simultane Aufzeichnung. Das Design und die Herstellung einer Weste richten sich speziell nach der Größe der Tiere. Die Weste muss die natürliche Bewegung des Nagetiers ermöglichen (siehe Abbildung 5). Letzteres garantiert den Hauptvorteil der Technik, nämlich die Aufzeichnung freier Bewegungen. Da die Tiere nach der Operation und in den folgenden Tagen nicht versuchten, die Weste, den Kopfstecker oder die Kabel zu entfernen, wurde vermutet, dass die Einrichtung keine signifikante Bewegungseinschränkung erzeugte oder Schmerzen oder Beschwerden verursachte. Für eine korrekte EEG-Segmentierung in Epochen auf der Grundlage von Ereignissen, die durch das BTS markiert sind, ist es zwingend erforderlich, ein genau definiertes Protokoll aufzuschreiben. Die temporären Markierungen könnten durch Zeitreihenmanipulation zusammengeführt werden, da beide Systeme dieselbe Uhr verwenden, um ihre Zeitstempel einzurichten. Dies erweitert die Möglichkeiten für Tierversuche, bei denen elektrophysiologische Daten in die Analyse einbezogen werden.
Die hier vorgestellte Technik kann in jedem neurowissenschaftlichen Forschungsgebiet und mit den häufigsten Mausarten und sogar anderen Arten angewendet werden. Die Vielseitigkeit der Behavioral Tracking Software ist einer der wichtigsten Vorteile, da sie in einer großen Vielseitigkeit von Labyrinthen wie Morris-Wasserlabyrinth, offenem Feld, neuartiger Objekterkennung, konditionierter Ortspräferenz, Lochbrett, erhöhtem Plus-Labyrinth, Y-Labyrinth, Radialarm-Labyrinth, Barnes-Labyrinth und anderen verwendet werden kann. Es können bis zu 16 Kameras gleichzeitig verwendet werden. Zusätzlich können hunderte von verschiedenen Maßnahmen (nähere Informationen siehe Handbücher31,32) gemeldet werden. Wenn man bedenkt, dass diese Arbeit Experimente für EEG-Ableitungen beschreibt, sind einige andere Techniken wie Local Fields Potentials oder Single-Unit-Recording möglich. Benutzer müssen jedoch berücksichtigen, dass die allgemeine Einrichtung und einige vorbereitende Schritte für andere Zwecke geändert werden müssen. Wenn diese Technik also zusammen mit der EEG-Wi-Fi-Aufzeichnung verwendet wird, werden die Möglichkeiten erweitert, da sie Tierstudien wie denen am Menschen neue Perspektiven hinzufügt, um verschiedene Merkmale der EEG-Integration und -Dynamik zu bewerten, wie z. B. Konnektivität, EEG-Bandleistung oder evozierte Reaktionen. Im Gegensatz zum Menschen ist es bei Tierversuchen möglich, neben vielen anderen experimentellen Paradigmen die Verabreichung von Medikamenten, Genmodifikationen oder Expression zu bewerten. Bei der EEG-Analyse ist zu berücksichtigen, dass einige Protokolle eine sehr geringe Anzahl von Wiederholungen der gewünschten Verhaltensweisen aufweisen, was die Möglichkeit einschränkt, die Antworten zu mitteln und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Achten Sie daher darauf, die Aufzeichnungs- und Analyseprotokolle zu entwerfen, die vor Beginn des Experiments durchgeführt werden sollen. Dennoch muss bedacht werden, dass die Arbeit im Tierversuch nicht möglich ist, um Bewegung zu verhindern, was die Komplexität des Versuchsprotokolls und Überlegungen zur Signalanalyse und Verhaltensaufgaben erhöht. Derzeit sind Geräte für vollständige Tracking-Systeme und EEG-Aufzeichnungen nicht standardisiert oder modular, was bedeutet, dass ihr Aufbau auf ein einziges Protokoll und Anpassungen zur Erforschung anderer Verhaltensaufgaben ausgerichtet ist, was für eine große Anzahl von Laboren höhere Kosten bedeutet/suggeriert. Diese Situation könnte gelöst werden, indem die in dieser Studie erläuterten Optionen befolgt werden. Nichtsdestotrotz konnten einige Verbesserungen für zuverlässigere Experimente realisiert werden. Die Arbeit kann in mehreren Schritten verbessert werden, angefangen bei der Herstellung der Elektroden über die Verhaltens- und Signalverarbeitung. Nichtsdestotrotz wird gezeigt, dass Tierverfolgung und EEG-Erfassung mit einem erschwinglichen, aber kostengünstigen High-Tech-Setup möglich sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit ein Versuch ist, Wissenschaftlern, insbesondere im Bereich der Neurowissenschaften, zu helfen, diese beiden Techniken, die üblicherweise nicht in Kombination verwendet werden, anwenden zu können. Die simultane Aufzeichnungstechnik von EEG- und Verhaltenstests mit Behavioral Tracking Software hat viele Vorteile und kann in vielen Bereichen der Neurowissenschaften besonders nützlich sein, insbesondere in Lern- und Gedächtnisbereichen. Wenn man bedenkt, dass dieses Gerät andere Fähigkeiten hat, wie z.B. eine tiefe Aufzeichnung subkortikaler Strukturen wie der Hippocampus, aber wie bereits erwähnt, werden sich einige vorbereitende Schritte ändern. Drahtlose Geräte lösen fast alle Einschränkungen eines herkömmlichen Kabelansatzes, wie z. B. Probleme bei der Mobilität von Tieren von einem Käfig zum anderen, behinderte oder verwickelte Tiere mit den Kabeln. Diese Setup-Technik ist, wie oben beschrieben, benutzerfreundlich, und eine fast ungeschulte oder nicht spezialisierte Gruppe von Experten oder Einzelpersonen kann diese Software verwenden. Der Preis für das EEG-Gerät ist niedriger als bei einem normalen EEG-Verstärker. Behavioral Tracking Software ist auch eine der günstigsten Software für Video-Tracking auf dem Markt. Für diese Software sind Jahreslizenzen erforderlich. Die Geräte können in mehr als einem Versuchsaufbau, verschiedenen Tieren und der Art der Vielseitigkeit verwendet werden. Wir hoffen, dass diese Bemühungen der wissenschaftlichen Gemeinschaft helfen und einen einfachen Zugang zur gleichzeitigen Untersuchung des Verhaltens und der Elektroenzephalografie ermöglichen.
Disclosures
Dr. Sylvia Ortega-Martinez arbeitet als Mitarbeiterin von Stoelting Co., einer Firma, die die Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel bereitgestellt und gesponsert hat.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Herrn Miguel Burgos und Herrn Gustavo Lago für die technische Unterstützung. Wir danken der Firma Stoelting für die Übernahme der Kosten für die Videoproduktion, Jinga-hi, Inc. für die Bereitstellung technischer Unterstützung und der División de Investigación y Posgrado der Universidad Iberoamericana Ciudad de México für die Bereitstellung von Mitteln für diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
| #4 Scalpel and blade | |||
| 50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
| 8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
| 8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
| Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
| ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
| benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
| Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
| Camera | Logitech | c920 | |
| Copper wire | |||
| Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
| DELL PC | DELL | ||
| Electrode | |||
| JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
| Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
| MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
| Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
| Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
| Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
| Screws | |||
| Screws equiped with electrode | |||
| Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
| Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
| Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
| Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |
References
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