Summary
הפרוטוקול המוצג כאן מספק מידע על אלקטרואנצפלוגרפיה בו זמנית (EEG) והערכה התנהגותית בזמן אמת. דנו בכל השלבים הכרוכים בפרוטוקול זה כפתרון אטרקטיבי לחוקרים בתחומים רבים של מדעי המוח, במיוחד בתחומי למידה וזיכרון.
Abstract
משרעת גלי המוח המתקבלת מאלקטרואנצפלוגרפיה (EEG) מוכרת היטב כבסיס ליכולת קוגניטיבית, זיכרון ולמידה על בעלי חיים ובני אדם. מנגנון נוירוגנזה למבוגרים קשור גם לשיפור הזיכרון והלמידה. באופן מסורתי, חוקרים נהגו להעריך פרמטרים של למידה וזיכרון במודלים של מכרסמים לפי משימות התנהגותיות. לכן, ניטור סימולטני של שינויים התנהגותיים ו- EEG מעניין במיוחד בקורלציה בין נתונים בין פעילות מוחית והתנהגויות הקשורות למשימה. עם זאת, רוב הציוד הנדרש לביצוע שני המחקרים הוא מורכב, יקר, או משתמש ברשת התקנה קווית המעכבת את תנועת בעלי החיים הטבעיים. במחקר זה, EEG נרשם באמצעות מכשיר אלקטרופיזיולוגיה אלחוטי יחד עם ביצוע משימת זיהוי אובייקטים חדשה (NORT). התנהגות החיה נוטרה בו זמנית על ידי מערכת מעקב וידאו. שתי ההקלטות נותחו באופן לא מקוון על ידי חותמות הזמן שלהן, שסונכרו כדי לקשר בין אותות EEG לבין פעולות החיה. הנבדקים מורכבים מחולדות וויסטאר בוגרות לאחר טיפול העשרה סביבתי לטווח בינוני. שש אלקטרודות בורג גולגולת היו קבועות בזוגות על שתי ההמיספרות מעל האזור המצחי, המרכזי והקודקודי והופנו לאלקטרודה הממוקמת בחלק האחורי של עצם האף. פרוטוקול NORT מורכב מחשיפת בעל החיים לשני חפצים זהים למשך 10 דקות. לאחר שעתיים ו -24 שעות, אחד החפצים הוחלף בחדש. זמן החיפוש של כל אובייקט נוטר על ידי תוכנת מעקב התנהגותית (BTS) ורישום נתוני EEG. ניתוח ה-EEG המסונכרן עם נתונים התנהגותיים מורכב מהערכות של עוצמת פס אלפא ובטא יחסית והשוואות בין זיהוי עצמים חדשים לעומת חקר עצמים מוכרים, בין שלושה שלבי ניסוי. בכתב יד זה דנו בתהליך ייצור אלקטרודות, ניתוח השתלת אלקטרודות אפידורליות, פרוטוקול העשרה סביבתית, פרוטוקול NORT, הגדרת BTS, צימוד EEG – BTS לניטור סימולטני בזמן אמת, וניתוח נתוני EEG המבוסס על זיהוי אירועים אוטומטי.
Introduction
מבחן התנהגותי הוא חיוני במחקר מדעי המוח עבור כמות גדולה של מידע שנוצר בהקשר in vivo. בהקשר זה, חוקרים השתמשו באופן נרחב במבחנים התנהגותיים שונים כדי לנתח תפקוד סנסורי-מוטורי, אינטראקציות חברתיות, התנהגות דמוית חרדה ודיכאון, תלות בחומרים וצורות שונות של תפקודים קוגניטיביים1. הקלטה ידנית של מבחנים התנהגותיים עשויה להיות קשה, מתישה ולא מדויקת אפילו עבור רוב הצופים המומחים. למרות שנעשו מאמצים מסוימים לפתח תוכנה חופשית וקוד פתוח לרישום התנהגות (למשל, אפליקציית sexrat male2 להתנהגות מינית), מספר חלופות מאפשרות רישום התנהגותי אוטומטי ובזמן אמת של מיני בעלי חיים שונים מדגים3 ועד מכרסמים 4,5,6. מעקב וידאו הוא שיטה חשובה להקלטת התנהגות מהירה ומדויקת המשמשת במגוון רחב של יישומים7. תכונה פוטנציאלית יותר באזור ההקלטה ההתנהגותית היא לחקור את הפעילות העצבית במהלך הביטוי ההתנהגותי. רישום סימולטני של פעילות עצבית (מתאים בודדים לאזורי המוח העיקריים) ומשימות התנהגותיות יכול להראות לנו כיצד המוח מייצר דפוסי התנהגות ספציפיים8. התנהגויות הן רצף של מרכיבים מינוריים שיכולים לחשוף קורלציה בין הפעילות העצבית לבין תנועות או פעולות. אם פעילות עצבית ודפוסים התנהגותיים יכולים להיות מתועדים בו זמנית באמצעות טווחי זמן מרובים, הם יכולים להסביר כיצד כל מצב מוחי מתואם עם כל התנהגות מסוימת (לבחינה מעמיקה יותר של רישום התנהגותי, ראו Datta et al., 2019 review8). לכן, רישום מסונכרן של פעילות התנהגותית ועצבית בקנה מידה רצוי (מנוירונים לאזורים גדולים במוח) נחשב ככלי שימושי ביותר. ישנן מספר מערכות המיועדות לשלב הקלטות התנהגותיות עם מדידות אחרות כפעילות עצבית 4,5.
למרות שאלקטרואנצפלוגרפיה נחשבת לאחת הטכניקות הנפוצות ביותר בתחום מדעי המוח הקליניים והמחקריים, הניידות הגבוהה יחסית, כמו גם גודלו של מכשיר ההקלטה EEG, הופכת טכניקה זו לייחודית ומאתגרת לזיהוי במקרה של דגמי in vivo9. כמה פתרונות לבעיה זו פותחו, למשל, שימוש בכבלים ובמכשירים מסתובבים המאפשרים לבעלי חיים לנוע בחופשיות בזירה. עם זאת, מערכות מבוססות כבלים מטילות לעתים קרובות בעיות לביצוע מחקרים, למשל, במהלך העברת בעל חיים מכלוב אחד למשנהו, נצפית הפרעה או הסתבכות של בעל החיים עם הכבלים. מכשירים טלמטריים פותחו עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות אלחוטיות כדי להגדיל את הגמישות של מצב ההקלטה10,11. עם זאת, מערכות אלה הראו מגבלות ניכרות בשל מספרן הנמוך של ערוצי הקלטה ושיעורי דגימה נמוכים11. במחקר זה השתמשנו במערכת אלחוטית מסחרית השולחת אותות EEG מהחיה דרך חיבור Wi-Fi עם מערכת מכרסמים הנעה בחופשיות12. המכשיר שוקל 6 גרם ועומד עד 16 ערוצים שהוקלטו ב 1 kSps. מערכת זו מאפשרת רישום EEG או ספייק בסביבת בעלי החיים, עם הפרעה מופחתת, ומהווה פתרון חסכוני בהשוואה למערכות האלקטרופיזיולוגיות המסורתיות בשוק. בנוסף, סנכרנו נתונים אלה באמצעות תוכנת מעקב וידאו כדי לספק מתאם בין EEG לבין דפוסי התנהגות. סנכרון זה נעשה באופן לא מקוון על ידי יישור ואינטרפולציה של נתונים ואירועים בהתבסס על חותמות זמן שנוצרו על ידי שתי המערכות ומעובד ב- MATLAB.
נוירוגנזה בוגרת מוגדרת כהתפשטות, הישרדות והתמיינות בתאי עצב של תאים חדשים שנוצרו בבליטה המשוננת של בעלי חיים13,14. תהליך זה ידוע כקשור לשיפור הזיכרון והלמידה אשר מגביר נוירוגנזה של מבוגרים במכרסמים באמצעות תנאי סביבה מועשרת (EE)15. EE מורכב משיכון מכרסמים בקבוצות קטנות בתוך כלוב גדול המסופק עם צעצועים וצינורות, שבו לבעלי חיים יש חידושים ומורכבים אך ללא רלוונטיות ביולוגית15. למרות ש- EE מגרה נוירוגנזה בהיפוקמפוס, הוא משתנה גם בגורמים רבים כגון גיל, זן בעלי חיים, תנאי גירוי ספציפיים או הליך זיהוי נוירוגנזה. בעכברים בגיל העמידה שנחשפו לדיור EE במשך שבעה ימים, דווח על לידת תאים גרגיריים חדשים (GC) בבליטה המשוננת בהיפוקמפוס (DG)16. מחקרים המנסים לעבד נוירוגנזה בוגרת בחולדות בוגרות באופן סלקטיבי הציעו כי תאים גרגיריים חדשים בני שבוע עד שבועיים נדרשים בתגובה הנלמדת17. בסביבות 2 או 3 שבועות לאחר GC נולדים במבוגרים DG, כמה תכונות אופייניות כגון קוצים דנדריטיים, אשר חיוניים עבור שידור סינפטי מעורר18, מתחילים להופיע. Zhao et al. ביצעו ניתוח כמותי כדי להראות כי שיא צמיחת עמוד השדרה מתרחש במהלך 3 - 4 השבועות הראשונים19. מספר מחקרים אלקטרופיזיולוגיים in vivo מצביעים על כך שרק שלושה שבועות של תנאי דיור EE מייצרים שינויים בשידור הסינפטי של DG ומגבירים את עוררות התאים20. כמו כן, דווח כי חשיפה לסביבה מועשרת 1-4 שבועות לאחר זריקות BrdU הגדילה באופן משמעותי את צפיפות תאי BrdU/NeuN בשכבה הגרגירית DG בעכברים21. מחברים אלה מציעים כי תקופה קריטית קיימת בין שבוע לשלושה שבועות לאחר החשיפה ל- EE מאז נצפתה עלייה משמעותית במספר נוירונים חדשים21. מחקרים על נוירוגנזה של ההיפוקמפוס הבוגר (AHN) בבני אדם היו שנויים במחלוקת מכיוון שלא היו ראיות ישירות. עם זאת, דו"ח שפורסם לאחרונה תיאר את שלבי ההתפתחות של AHN במוח הבוגר האנושי, זיהה אלפי נוירונים לא בשלים ב- DG, ובכך הדגים את החשיבות של AHN במהלך ההזדקנות בבני אדם22. בהתבסס על הראיות שהוזכרו קודם לכן, המחקר של AHN במודלים של בעלי חיים חשוב יותר מאי פעם (לבחינה מעמיקה יותר של AHN, ראו Leal-Galicia et al., 2019 review15).
כאמור, ההיפוקמפוס נקשר לפונקציה בסיסית ביכולות למידה וזיכרון. היווצרות זיכרונות עוברת שלושה תהליכים נפרדים: קידוד (רכישת זיכרון), קונסולידציה (אחסון זיכרון) ושליפה (זיהוי זיכרון)23. זיכרון זיהוי בבני אדם נבדק באמצעות משימת השוואות חזותיות24. היסודות של מודלים אנושיים וחייתיים של זיכרון ואמנזיה הם המבחנים ההתנהגותיים המעריכים את היכולת לזהות גירויים שהוצגו קודם לכן25,26, כפי שעושה משימת ההשוואה הזוגית החזותית בבני אדם. לכן, אחד המבחנים ההתנהגותיים הנפוצים ביותר להערכת יכולתו של מכרסם לזהות גירוי שהוצג בעבר, כלומר, יכולת הלמידה והזיכרון הוא משימת זיהוי אובייקט ספונטנית חדשה (NORT)23,27. פרוטוקול NORT מורכב משני אובייקטים חדשניים זהים בזירה מוכרת למשך 10 דקות במשפט הרכישה. לאחר זמן מסוים בין 0 28 ל48 שעות29 (זמן משתנה על פי כל פרוטוקול), החיה מוחזרת לאותה זירה המכילה אחד מאותם חפצים מוכרים, ואובייקט חדש אחד. החיה חוקרת באופן ספונטני את האובייקט החדש אם האובייקט המוכר היה בעל פה26 . יחס ההעדפה משמש בדרך כלל להערכת ביצועי חיפוש. היא נקבעת על ידי חלוקת זמן חקר האובייקט הכולל מזמן החקירה של הרומן או האובייקט המוכר. ל- NORT יש כמה יתרונות על פני מבחני זיכרון זיהוי אחרים. והכי חשוב, זה לא דורש מוטיבציה חיצונית, תגמול או עונש. זה לא יוצר תנאים מלחיצים. לבסוף, אין צורך באימון כדי לעורר את ההתנהגות של חקירת האובייקטים (לבחינה מעמיקה יותר של NORT, ראה ref.23).
לכן, רישום סימולטני של אופני נתונים מרובים ושילובם בחקר הלמידה והזיכרון, כהשפעה של נוירוגנזה בהיפוקמפוס בוגר, אטרקטיבי ביותר ומספק פתרון משכנע לחוקרים בתחום. העבודה הנוכחית תחשוף את כל התהליכים המעורבים בהערכת מעקב וידאו התנהגותית בו זמנית (משימת זיהוי אובייקטים חדשנית) והקלטת אלקטרואנצפלוגרפיה אלחוטית. כאן סקרנו את תהליך ייצור האלקטרודות, ניתוח השתלת אלקטרודות אפידורליות (בורג גולגולת), פרוטוקול העשרה סביבתית (להשראת נוירוגנזה בהיפוקמפוס), פרוטוקול NORT, הגדרת BTS, צימוד EEG – BTS לניטור סימולטני בזמן אמת, וניתוח נתוני EEG והתנהגות המבוצע בסביבת מחשוב MATLAB.
Protocol
כל הנהלים עוקבים אחר המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (NIH Publications N°. 8023, תוקן בשנת 1978) המיושם על ידי מוסדות בריאות לאומיים וחוקים מקסיקניים מקומיים כדי להפחית את מספר בעלי החיים המשמשים לרווחת בעלי חיים ואיסור על סבלם של בעלי חיים. ועדת האתיקה של אוניברסיטת איברואמריקנה אישרה את פרוטוקולי הניסוי לשימוש בבעלי חיים במחקר זה.
1. הגדרה כללית
- התקן את תוכנת המעקב ההתנהגותי במחשב בהתאם להוראות הייצור.
- הרכיבו את המצלמה ישירות מעל המכשיר, כך שהיא פונה כלפי מטה. המצלמה צריכה להיות מחוברת למחשב.
- התקן את תוכנת מנהל ההתקן הנדרשת על-ידי המצלמה (בהתאם להוראות הייצור).
- אם המצלמה כוללת עדשת זום, התאם אותה כך שתתאים באופן מושלם לתצוגת המצלמה.
- כבה את מצב המיקוד האוטומטי (AF) של המצלמה בהתאם לתוכנת הייצור.
- ודא שהמצלמה פועלת כראוי בזמן אמת ובדוק את מצב לכידת הווידאו עד שהיא מוכנה לשימוש.
2. פרוטוקול העשרה סביבתית (ראה איור 1)
הערה: חולדות וויסטאר זכרים בני שלושה חודשים שימשו לניסוי זה והוחזקו בתנאי אור כהה טבעיים.
- מניחים מצעי נסורת בזירה אקרילית מרובעת שקופה (500 x 500 x 500 מ"מ).
- שים שלושה סוגים שונים של צעצועים על הזירה עבור מכרסמים אינטראקציה עם (למשל, גלגלי פעילות, סיפון כפול, מדרגות, וכו ').
- הוסף ארבעה צינורות PVC אטומים בגודל 2 אינץ' וארבעה צינורות PVC אטומים אפורים מעוקלים.
- לספק למתקני מזון ומים גישה לבעלי חיים.
- הניחו שלושה מכרסמים בכל כלוב בתוך חדר הוויבריום בתנאים קבועים.
- השאירו את בעלי החיים בזירה זו למשך הזמן הנדרש על פי הפרוטוקול המתאים. בניסוי זה, בעלי חיים צריכים להישאר בתוך הזירה במשך 20 יום.
הערה: לאחר ניתוח השתלת אלקטרודות, בעלי חיים אינם חוזרים לטיפול העשרה סביבתית. במקום זאת, הם הוכנסו לכלובים בודדים עד להשלמת מבחן זיהוי האובייקטים החדש.
3. תהליך ייצור אלקטרודות
- חותכים חתיכת חוט נחושת בערך 2 ס"מ ומשתמשים בנייר זכוכית כדי לשפשף כ 0.5 ס"מ מכל קצה.
- גלגלו קצה אחד של חוט הנחושת לראש בורג קטן (אלקטרודות) וודאו שהוא קבוע היטב מכיוון שזהו שלב מכריע. יש להבטיח מגע נכון בין שני החומרים כדי למנוע ממצאים באותות EEG.
- הכנס את הקצה השני בקצה ההדקים של המחבר וודא שהוא קבוע כראוי על ידי חיזוק באמצעות מלקחיים עדינים. טיפ זה אמור להתחבר באמצעות כבל מגבר.
- מדדו את המוליכות המתאימה מהקצה ועד הבורג באמצעות מולטימטר. תהליך זה מבטיח כי חיבור האלקטרודה מותקן כראוי.
4. ניתוח השתלת אלקטרודות אפידורליות (בורג גולגולת)
הערה: לאחר 20 יום של טיפול העשרה סביבתית, בעלי החיים יעברו ניתוח בעקבות ההליך המתואר להלן:
- הזריקו קוקטייל של קטמין/קסילזין (90/10 מ"ג/ק"ג, כלומר לבעל החיים).
הערה: כדי למנוע חסימה של דרכי הנשימה, המתינו עד שהחולדה תפסיק לנוע, ואז הוציאו אותה מכלוב הדיור והניחו את בעל החיים על משטח שטוח. הזריקו נוגדי דלקת לא סטרואידים (מלוקסיקאם 1 מ"ג/ק"ג, s.c.) ואנטיביוטיקה (אנרופלוקסצין 2.5 מ"ג/ק"ג, p.o.) כמשככי כאבים מונעים. - לאחר שהחולדה מורדמת לחלוטין, יש לגלח את אזור הראש של החולדה.
הערה: יש לוודא כי בעל החיים מורדם לחלוטין לפני המשך הניתוח. בזהירות לצבוט את אחת הרגליים או את הזנב. אם בעל החיים מגיב לגירוי, המתן עוד כמה דקות וצבט אותו שוב. אם החיה אינה מגיבה לצביטה, עבור לשלב הבא. אם הציוד הנדרש זמין, מומלץ מאוד להשתמש בהרדמה בגז (כגון איזופלורן), מכיוון שקל יותר לטיטרציה מטעמי בטיחות. - הניחו את בעל החיים על המנגנון הסטריאוטקסי על ידי קיבוע שתי האוזניים תחילה עם מוטות האוזניים (היזהרו שלא לפגוע באוזן הפנימית של החיה). לבסוף, הניחו את השיניים הקדמיות מעל מוט הנשיכה ואבטחו את מוט האף.
הערה: ספק לבעל החיים כרית חימום לכל הניתוח מכיוון שההרדמה המשמשת בהליך זה גורמת בדרך כלל להיפותרמיה ולבעיות נשימה. - נקו את החלק העליון של אזור הראש באמצעות שלושה סיבובים לסירוגין של פילינג על בסיס כלורהקסידין או יוד ולאחר מכן שטיפת מי מלח או אלכוהול.
- מתן לידוקאין תת עורי (20 מ"ג / מ"ל) מתחת לעור אזור הראש (0.5 מ"ל).
- להחדיר טיפה של תמיסת עיניים או מלוחים לעיניים של כל חיה כל 5-10 דקות כדי לעזור להם לא להתייבש.
- באמצעות אזמל, לבצע חתך של כ 2 ס"מ מהכיוון הקדמי האחורי כדי לחשוף כראוי את האזור העליון של הגולגולת.
- משכו את העור באמצעות מלחציים של בולדוג וגרדו את הרקמה שמעל הגולגולת.
- זהה ורשום את קואורדינטות הברגמה המתקבלות.
- החל מברגמה, באמצעות פקסינוס הסטריאוטקסי ואטלסווטסון 30, אתר וסמן את המיקום של כל אחת משבע הנקודות (קואורדינטות) שבהן האלקטרודות יתקבעו.
הערה: בניסוי זה, ברגי F3, F4 (+2.0 מ"מ מברגמה, 2.25 מ"מ לרוחב מקו האמצע); ברגי C3, C4 (-3.0 מ"מ מברגמה, 2.75 מ"מ לרוחב מקו האמצע); והותקנו ברגי P3, P4 (-7.0 מ"מ מברגמה, 2.75 מ"מ רוחבי מקו האמצע). בורג שביעי נמצא בחלק האחורי של עצם האף (NZ), כנקודת ייחוס קרקעית (ראה איור 2). - באמצעות כלי מקדח במהירות משתנה, לעשות חור עם קצה גודל 2 (אורך 44.5 מ"מ) על כל אחד מהסימנים, להיזהר לא לחדור את הגולגולת במלואה.
- הכנס את האלקטרודה לתוך החור והברג אותה לתוך הגולגולת בזהירות.
- חזור על שלבים 4.10 ו- 4.11 עד שכל שבעת הברגים יתוקנו כראוי.
- תקן את כל 7 הברגים עם שכבה ראשונה של מלט דנטלי. הכנס כל אלקטרודה למחבר. כסו את החוטים לחלוטין בשכבה שנייה של מלט דנטלי (זה ימנע מהחיה למשוך ברגים), ובתחתית המחבר. במידת הצורך, כסו בשכבה שלישית של מלט דנטלי, והשאירו את מחבר ה-EEG נקי לחיבור תקין, כך שניתן יהיה לחבר את מכשיר ה-EEG כראוי (ראו איור 3).
הערה: לאחר הצבת כל זוג ברגים דו-צדדיים, ניתן לקבע אותם באמצעות מלט דנטלי (שלב אופציונלי). - השאירו את החולדה בטיפול לאחר הניתוח למשך הלילה. התבונן בחיה וספק לחיה כרית חימום למשך 1-2 שעות לאחר הניתוח, שכן ההרדמה המשמשת בהליך זה גורמת בדרך כלל להיפותרמיה ולבעיות נשימה.
- יש לתת 50 מ"ל/ק"ג/24 שעות (מינון תחזוקה) של תמיסת מלח תת עורית למניעת התייבשות. יש להזריק נוגדי דלקת לא סטרואידים (מלוקסיקאם 2 מ"ג/ק"ג, s.c.) ואנטיביוטיקה (אנרופלוקסצין 5 מ"ג/ק"ג, p.o.) לאחר הניתוח ולמשך 24 השעות הבאות.
- לאחר הניתוח, החזיקו את החולדות בכלובים בודדים להחלמה מלאה במשך שבעה ימים לפני ביצוע מבחני ההתנהגות.
- בעדינות לתפעל את החיה על בסיס תקופתי (לפחות פעם ביום) כדי לעזור להפחית את הלחץ במניפולציות עתידיות. בעת החזקת החולדה ביד אחת, לחץ האצבע מופעל בעדינות על גב החיה, מחליק את האצבעות דרך הפרווה. בדקו את פציעת הראש, המצב הבריאותי, ההתנהגות בכלל ומשקל הגוף לתקופה של שבוע לאחר הניתוח.
הערה: אם נמצאו חריגות או סימני מחלה/לחץ אצל בעל החיים, יש להודיע על כך לרופא הווטרינרי האחראי. לאחר תקופה זו, בצע את בדיקת זיהוי האובייקטים החדשנית ואת טכניקת הקלטת EEG.
5. מבחן זיהוי אובייקטים חדשני (NORT)
הערה: שבעה ימים לאחר הניתוח, המשך לבדיקות התנהגותיות. כל ההליכים ההתנהגותיים, בניסוי המוצג בוצעו בין 14 שעות 00 דקות ו 16 שעות 00 דקות, אשר מתאים מחזור האור של החולדה.
- הניחו אפוד עשוי בד רך (אליו יונח מכשיר ה-EEG במהלך מבחן ההתנהגות) על החולדה. אפשר התרגלות במשך 2-3 ימים לפני ביצוע הבדיקה ההתנהגותית.
- מקמו זירה מרובעת אקרילית שחורה (500 x 500 x 500 מ"מ) בחדר הקלטות מואר באור עמום.
- מקבעים שני חפצים חדשניים זהים למרכז הרצפה של הזירה באמצעות סרט דו-צדדי (כדי למנוע את תזוזתו על ידי בעלי החיים). חפצים חייבים להיות במרחק שווה זה מזה ומקירות הזירה.
- נקו היטב כל חפץ מראש עם 50% אתנול, כמו גם את רצפת הזירה לאחר כל ניסוי (כדי למנוע רמזי ריח).
הערה: תמיד להעביר את החיות לחדרי דיור (מחדר הוויבריום לחדר הניסויים) לפחות חצי שעה לפני תחילת כל מפגש. לאחר סיום ההקלטה, השאירו את החיות בחדר הניסויים למשך שעה נוספת. זאת כדי למנוע את הלחץ שיכול להשפיע על הביצועים של בדיקה זו. - חבר את מכשיר ה- EEG, לפני תחילת כל בדיקה. רסן בעדינות את החיה וחבר היטב את הכבל למחבר שעל ראשה של החיה באמצעות ערכת EEG המחוברת לגבה של החיה (ראה איור 4). רק עמדה אחת מותרת.
הערה: מניפולציה עדינה קודמת של בעל החיים עשויה לעזור להפחית את הלחץ אצל בעלי חיים במהלך הליך החיבור. אחרת, הסיכון לנזק למכשיר או לבעלי החיים עולה. טען מראש את סוללת המכשיר במלואה באמצעות יציאת USB. - שלבי בדיקות זיהוי אובייקטים חדשניים
- הרגלה: טפלו בבעל החיים במרווחים של 5 דקות במשך יומיים רצופים, ומיד לאחר מכן, הניחו אותו על הזירה (ללא חפצים) ואפשרו לו לחקור במשך 10 דקות בחופשיות.
הערה: לפני ביצוע כל מפגשי בדיקת רכישה וזיכרון, חולדות טופלו בקפידה וחוברו למכשיר EEG המתאים, שתוקן כראוי לפני תחילת הבדיקה. - מפגש רכישה: הניחו את בעל החיים על הזירה מול אחד הקירות המנוגדים לחפצים. אפשרו לבעלי חיים לחקור בחופשיות במשך 10 דקות. עבור לשלב 6.13 להקלטת בדיקה באמצעות תוכנת מעקב התנהגותי.
הערה: יש לוודא שמכשיר ה-EEG מחזיק כראוי את האפוד המחובר לגב החולדה (כדי להבטיח מעקב נאות אחר החיה). לחיזוק נוסף, השתמשו במסקינג טייפ. - מבחן זיכרון לטווח קצר (SMT): החלף אחד מהאובייקטים בכל אובייקט אחר שונה לחלוטין בצורה, בצבע ובמרקם. הניחו את החיה, שעתיים לאחר פגישת הרכישה, בזירה הפונה לאחד הקירות המנוגדים לחפצים. אפשרו לבעל החיים לחקור בחופשיות במשך 10 דקות. עבור לשלב 6.13 להקלטת בדיקה באמצעות תוכנת המעקב ההתנהגותי.
- מבחן זיכרון לטווח ארוך (LMT): החלף את האובייקט המשמש בכל אובייקט אחר השונה לחלוטין בצורה, בצבע ובמרקם ממבחן הזיכרון לטווח קצר. הניחו את בעל החיים 24 שעות לאחר פגישת הרכישה, בזירה הפונה לאחד הקירות שממול לחפצים. אפשר לבעל החיים לחקור בחופשיות במשך 10 דקות עבור לשלב 6.13 להקלטת בדיקה באמצעות תוכנת המעקב ההתנהגותי.
- הרגלה: טפלו בבעל החיים במרווחים של 5 דקות במשך יומיים רצופים, ומיד לאחר מכן, הניחו אותו על הזירה (ללא חפצים) ואפשרו לו לחקור במשך 10 דקות בחופשיות.
6. הגדרת תוכנת מעקב התנהגותי
- פתח את תוכנת המעקב ההתנהגותי.
- היכנס לחשבון באמצעות המשתמש והסיסמה של המוסד.
- פתח את הקש על "ניסוי ריק חדש" ובחר שם עבור הפרוטוקול (לדוגמה, "NORT").
- בחר "מצב מעקב וידאו".
הערה: בניסוי זה, המצלמה מוגדרת להזרים את מעקב הווידאו בשידור חי. עם זאת, קיימת אפשרות נוספת לבחור סרטונים מוקלטים מראש. - עבור אל "מנגנון". הגדר את אזור הזירה, על ידי התאמת המלבן הכתום לגבולות הזירה המוקרנת. קבעו את אזור האובייקט, תוך התאמת העיגולים הכתומים בגבול האובייקטים בתוך הזירה המוקרנים מהמצלמה על המסך.
- הגדר את קנה המידה המזיז את קו הסרגל למיקום לאורך הידוע של התמונה (הזירה). הזן את אורך האובייקט במילימטרים באפשרות "אורך קו הסרגל הוא" בחלונית 'הגדרות'. במקרה זה, הזירה מודדת 500 x 500 מ"מ.
- עבור אל "מעקב והתנהגות". המשך אל "אזורים". לחץ על תפריט "הוסף פריט" ובחר "אזור חדש". בחר את אזור הזירה ותן שם לאזור החדש (לדוגמה, "שדה").
- חזור על השלב הקודם עם אזור האובייקטים ותן שם לאזור החדש (לדוגמה, "אובייקטים").
- עבור אל "צבע בעלי חיים" ובחר באפשרות "בעלי החיים בהירים יותר מרקע המנגנון".
הערה: חולדות לבנות (Wistar) שימשו לניסוי זה. עם זאת, התוכנה כוללת אפשרויות נוספות עבור חוקרים המשתמשים בחולדות שחורות ומנומרות. שני גזעי בעלי החיים יכולים לשמש באותו ניסוי. - עבור אל "מעקב אחר הראש והזנב של החיה" ובחר "כן, אני רוצה לעקוב אחר הראש והזנב של החיה".
- עבור אל "בדיקה" | "שלבים", ומהתפריט "הוסף פריט", בחר "שלב חדש". קרא לשלב החדש, "רכישה". הגדר את משך השלב (למשל, 600 שניות).
- חזור על השלב הקודם של השלבים "מבחן זיכרון לטווח קצר" ו"מבחן זיכרון לטווח ארוך".
הערה: בפרוטוקול זה, לכל השלבים יש משך זהה (10 דקות). - עבור אל "נהלים". הגדר את האירועים שיש לעקוב אחריהם עבור כל שלב (רכישה, מבחן זיכרון לטווח קצר ומבחן זיכרון לטווח ארוך).
- התחל את הבדיקה (עם כל חיה). עבור אל "בדיקות" (בשורת התפריטים העליונה) ובחר "הוסף בדיקה (+)". הקצו מספר לבעל החיים שייבדק (לדוגמה, "1").
- בחר "הקלט" ותן שם לבעלי החיים ולהפעלה (לדוגמה, "M1 Acq").
- לפני הצבת החיה בזירה, לחץ פעם אחת על כפתור "הפעל". תוצג הודעה "ממתין להתחיל".
- לאחר הצבת החיה בזירה, לחץ פעם שנייה על כפתור "הפעל". הבדיקה תתחיל ותסתיים באופן אוטומטי.
- חזור על שלבים 6.13-6.16 עבור מבחן הזיכרון לטווח קצר (שעתיים לאחר הפעלת הרכישה) ומבחן הזיכרון לטווח ארוך (24 שעות לאחר הפעלת הרכישה).
7. הגדרת מכשיר אלקטרופיזיולוגיה אלחוטית
- חבר את המודם למארח מחשב והפעל אותו. כבה כל התקן רשת אחר במחשב. רצוי, להשתיק כל תקשורת אלחוטית אחרת בחדר הרישום כמו Bluetooth, טלפונים סלולריים, מודמים אחרים, או אפילו מכשירים אלחוטיים.
- חברו את המגבר לגבה של החולדה, כאמור בשלב 5.5.
- הפעל את התקן ה- EEG על-ידי חיבור הסוללה.
הערה: 2 שניות לאחר חיבור המכשיר, נורית LED אדומה במגבר ה- EEG תהבהב, המציינת שהתקשורת עם המודם פעילה, ולאחר מכן נורית LED ירוקה תופעל. אם התקשורת מצליחה, נוריות המודם יתחילו להבהב ברציפות. המגבר מוכן כעת לשלוח מידע למודם. - הפעל את תוכנת EEG והגדר אותה בהתאם להוראות היצרן לשילוב במכשיר רכישת EEG אלחוטי
- לחץ על כפתור "התחל תצוגה". תוכנת EEG תציג את קליטת האות בפועל.
הערה: השתמש ב"מנהל המשימות של Windows" כדי להקצות את מצב העדיפות "בזמן אמת" כדי למנוע מידע חסר במהלך הניסוי.
8. הקלטת אותות אלקטרואנצפלוגרפיה (EEG)
- לאחר שווידאתם שתוכנת ה-EEG רוכשת נתונים, הפעילו את תוכנת המעקב ההתנהגותי והגדירו פרוטוקול ניסוי כדי לוודא שבעל החיים נמצא באזור התצפית ושההתקנה פועלת כראוי.
- בשלב זה, התחל את הקלטת תוכנת EEG על ידי לחיצה על כפתור "התחל הקלטה". לאחר בדיקה כי אות הרכישה פועל, להתחיל ניסויים BTS.
- לאחר סיום הניסוי, חזרו לתוכנת EEG ועצרו את תהליך ההקלטה. ההקלטה תישמר באמצעות שם ברירת מחדל המורכב מתאריך ההקלטה בפורמט הבא: "yyyy-mmdd-hhmm_SubjectID_Ephys.plx". כברירת מחדל, כל ההקלטות נשמרות בתיקיית תוכנת EEG (NeurophysData).
- ודא ששני קבצי הנתונים נוצרו. רשום את יומן הניסויים או שנה את השם כדי למנוע בלבול.
9. מטלה התנהגותית וסנכרון אותות EEG
- פתחו את MATLAB ובצעו את הפקודה: convert_plx2mat. פונקציה כזו תפתח תיבת דפדפן. פונקציות ההמרה מסופקות על ידי היצרן ויש להוסיף אותן לנתיב של MATLAB.
- בחר את *.plx להמרה ולחץ על "Enter" בשורת הפקודה של MATLAB כדי להמיר אותו לפרמטרי ברירת המחדל.
- פתח את קובץ הניסויים BTS ועבור אל "פרוטוקול". לחץ על האפשרות "תוצאות, דוחות ונתונים" בחר את כל האירועים של שני האובייקטים ולחץ על "בחר את פורמט הזמן עבור הדוח", בחר באפשרות השלישית: "הצג את זמני האירועים בזמן אמת ב- HH:MM:SS.sss - לדוגמה 13:20:14.791".
- עכשיו ללכת "קובץ" ולחץ על "ייצוא" ו "ייצוא ניסוי כמו XML", לבדוק "תאריך ושעה של הבדיקה", לבסוף לחץ על "צור XML".
- עבור אל "ייצוא נתוני בדיקה" ולחץ על "שמור נתונים". ייווצר קובץ .csv עם זמני אירועים.
- חזור על שלבים 9.1 עד 9.5 עבור כל קובץ. במקרה שלנו, שלושת הניסויים היו: ACQ, STM ו-LTM.
- לאחר המרת קובצי EEG והתנהגות, אסוף אותם בתיקייה אחת. התיקיה חייבת לכלול שישה קבצים, שלושה קבצי .mat ושלושה .csv, בהתאמה. במקרה שלנו, הקבצים נקראו: PID_01_ACQ_N.mat, PID_02_STM_N.mat, PID_03_LTM_N.mat, PID_01_ACQ_M.csv, PID_02_STM_M.csv ו- PID_03_LTM_M.csv. תעודת זהות מתייחסת למספר זיהוי של בעל חיים.
- פתח את הפונקציה "procesa_sujeto.m" באמצעות MATLAB, והתאם את השורה השנייה למזהה החיה.
- כעת העבר את MATLAB לתיקייה כזו ובצע: "procesa_sujeto" כדי ליצור דמויות של פס אלפא ובטא יחסית לעוצמה המשויכת לזיהוי אובייקטים בשלבי ACQ, STM ו- LTM.
הערה: "procesa_sujeto" היא פונקציה המבצעת/מפעילה מספר ניתוחי עיבוד אותות. ניתוחים אלה מסוכמים באופן הבא בשלבים 9.10 עד 9.15. - סנן כל אות EEG עם מסנן פס פס Butterworth מסדר רביעי ב- [5-40] הרץ, באמצעות תיקון פאזה.
- בדוק חזותית אותות לפני הניתוח הבא, ותעלות עם ממצאים שמקורם במיקום אלקטרודות פגומות או התאמה שגויה על ידי תנועות בעלי חיים לא נכללו בניתוח נוסף.
- אותות ייחוס לממוצע משותף כדי להקל על חפצי תנועה.
- אותות EEG מקטע יוצרים תקופות באורך 4 שניות המסונכרנות על ידי חותמות זמן הנגזרות מ- BTS. אירועי המטרה היו חקר האובייקט המסומן על ידי המרחק של החיה לאובייקט הגבול. אירועים אלה מסומנים בחותמות הזמן של BTS ושימשו כמזהים לתיקון מיקומי החלונות. לכן, תקופות EEG מתוחמות ב-1 שניות לפני תחילת החקירה ל-3 שניות אחרי. בשלב זה, לא נעשה שימוש בתיקוף לגבי אורך החיפוש, אך הוא יישקל למחקרים עתידיים.
- הערכת צפיפות ההספק הספקטרלי בתקופות אלה על ידי שימוש בשיטת הפריודוגרמה של וולש באמצעות אורך חלון של 1 s, חפיפה של 90%, חלון האנינג לפני הערכת התמרת פורייה, עם פרמטרים אלה הושגה רזולוציה של 1 הרץ.
- הערך ספקטרלי הספק בכל רצועה על ידי הערכת שטח תחת פריודוגרמה, והערכים המוצגים מתאימים לאנרגיה יחסית, זה אומר שהאנרגיה של כל רצועת EEG חולקה באנרגיה הכוללת של התקופה. הליך זה גם מפחית הערכות שגויות עקב ממצאים על אותות EEG.
Representative Results
השיטות שתוארו לעיל יושמו לרישום פעילות EEG וחולדות בו זמנית לאחר טיפול העשרה סביבתי. חולדות וויסטאר זכרים בני שלושה חודשים היו תחת פרוטוקול טיפול העשרה סביבתית לטווח בינוני במשך 20 יום, והם נותחו כדי לתקן שש אלקטרודות בורג גולגולת שהותאמו באזורים הקדמיים, המרכזיים והקודקודיים שהופנו לאלקטרודה שביעית הממוקמת בניו זילנד. בעלי החיים הוחזקו בתנאי אור חשוך טבעיים, עם גישה למזון ולמים. עבודה זו מציגה את האינטגרציה בין מערכת EEG לבין תוכנת המעקב ההתנהגותי להקלטה חיה בו זמנית. השתמשנו רק בבעלי חיים שטופלו תחת פרוטוקול EE מכיוון שאיננו מתיימרים להשוות את יעילות הטיפול, אלא רק מדגימים את יתרונות הציוד. כראיה לכך שפרוטוקול הדיור להעשרה סביבתית בן 20 הימים המשמש מגרה את הנוירוגנזה הבוגרת, אנו מציגים נתוני ספירת תאים חיובית BrdU מבעלי חיים תחת הנדסת חשמל ובעלי חיים השוכנים בתנאים סטנדרטיים מנתונים שלא פורסמו מהמעבדה שלנו. נעשה שימוש בחולדות וויסטאר זכרים בני שלושה חודשים. הם הוזרקו שלוש פעמים עם BrdU עם 12 שעות אחד מהשני. בעלי חיים הורדמו (pentobarbital (50 מ"ג/ק"ג, כלומר הרדימו אותם) והומתו באמצעות זילוח טרנסקרדיאלי (ראו איור 5). כדי לוודא שהאפוד המחובר למכשיר ה-EEG אינו מגביל את תנועת בעלי החיים, ביצענו את בדיקת השדה הפתוח (OFT) לשתי קבוצות, קבוצה אחת נותחה כשהיא לובשת את הציוד (אפוד ומגבר EEG), וקבוצת החיות השנייה נותרה שלמה מבלי ללבוש את החומרה. לא מצאנו הבדלים משמעותיים במרחק שעברו החיות ב-10 דקות של ניסוי (ראו איור 5). פרוטוקול NORT טיפוסי מורכב מהצגת שני אובייקטים, והחלפת אחד מהם באובייקט חדש. תוכנת המעקב ההתנהגותי עקבה אחר זמן החיפוש.
תוכנת המעקב ההתנהגותי רשמה קבוצה של בעלי חיים כדי להעריך את פרמטרי הביצועים העיקריים שלהם. לכן, השתמשנו בשלושה פרמטרים כדי להעריך את ביצועי החיפוש. יחס ההעדפות חושב באמצעות זמן הראש של בעלי החיים באזור האובייקט, אשר מדווח על משך הזמן הכולל שראש החיות בילה בכל אובייקט. כמו כן, חישבנו יחס העדפות עבור הזמן שהוקדש לתנועה לעבר האובייקטים, אשר מראה את כמות הזמן הכוללת שהושקעה בכל חיה שנעה לעבר כל אזור אובייקט. בנוסף, חושב הזמן המושקע בכל ביקור בכל חפץ. איור 6 מציג את תוצאות שלושת הפרמטרים שהוזכרו לעיל. בניסוי הרכישה לא נמצאו הבחנות בין אובייקטים בשלושת הפרמטרים שהוערכו: זמן ראש באזור האובייקט בשלושת הניסויים, זמן תנועה לעבר האובייקטים בשלושת הניסויים וזמן לביקור בכל אובייקט. לא היו הבדלים בניסוי STM. בינתיים, בניסוי LTM, נצפה יחס מועדף לחקירה גבוה משמעותית עבור האובייקט החדש. בנוסף, בניסוי LTM ניתן היה לראות גם העדפה לאובייקט החדש בזמן השהייה בכל ביקור (לוח C). סרטון 1 מציג דוגמה מייצגת של חולדה שתועדה בניסוי ואילו סרטון 2 מציג דוגמה מייצגת של EEG בו זמנית ורישום התנהגותי.
ניתן היה להתאים את אירועי הזמן שאחריהם בוצע מעקב עם המעקב ההתנהגותי והקלטת תוכנת EEG באמצעות שעון המחשב. איור 7 ואיור 8 מראים את השינויים בעוצמה היחסית של EEG על תדרי אלפא ובטא. אלה קשורים לשליטה מוטורית, ריכוז וזיכרון, מה שמרמז על כך שחקירה קשורה רק לתפקודים אלה. התוצאות של חיה 3 מראות כי כוח אלפא נוטה להפחית על STM לגבי ACQ ו- LTM, מה שמרמז על דה-סנכרון הקשור לחקירה או אחזור זיכרון. מספר זיהוי האובייקטים (תקופות מעובדות) היה נמוך. בשלב זה, לא ניתן לקבוע אם מבחן סטטיסטי יאמת אם הבדל כזה הוא אמיתי, או שחפץ היה מסוגל לייצר תנאי ניסוי כאלה. אף על פי כן, סגמנטציה, תיוג וניתוח של תקופות התאפשרו על ידי ציר זמן של אירועי סימון סימולטני בבעלי חיים ותוצאות EEG שהופקו עבור פרויקטים מחקריים עתידיים. שילוב מערכות אלה מונע זיהוי שגוי של אירועים בתהליך סימון ידני, שהפך לנושא משמעותי למטרות ניסויים בבעלי חיים. השילוב של פעילות BTS ואלקטרופיזיולוגית (EP) יכול להיות קשור במדויק להתנהגות בעלי חיים; עם זאת, תנאי הניסוי דורשים שימוש בטכניקות עיבוד אותות מתקדמות כדי לחסל ארטיפקטים תנועתיים ולבצע שיפורים במערך הניסוי ביעילות.
איור 1: דוגמאות לכלוב תנאי סביבה מועשרת (EE). הדיור סופק עם צעצועים וצינורות, שבהם בעלי חיים מוצאים חדשני ומורכב אך ללא רלוונטיות ביולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקומי אלקטרודות אפידורליות בגולגולת החולדה. הברגים שימשו בו זמנית כעוגן לאוזניות וכאלקטרודות. F = חזיתית; C = פרונטופריאטלי; P = קודקוד; 3 = שמאל; 4 = ימין; NZ = כנקודת ייחוס קרקעית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מייצגות של ניתוח השתלת אלקטרודות אפידורליות (בורג גולגולת). תמונה המציגה השתלת אלקטרודות תוך גולגולתיות בחולדות בשלבים שונים של הניתוח. ודא טכניקות אספטיות הם אחריו בעת ביצוע הליך זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של חולדה יחד עם מערך הניסוי. החולדה אולצה ללבוש את האפוד המחובר למכשיר ה-EEG עם סוללה משובצת, בתוך הזירה המשמשת לפרוטוקול NORT. התמונה מציגה את האוזניות ואת מחבר הכבל המותקן על חולדת הראש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: עדות ליכולת תנועה וגירוי נוירוגנזה של מבוגרים באמצעות פרוטוקול EE. (A) תמונות מייצגות של פעילות בעלי החיים במשך 10 דקות בניסוי השדה הפתוח (OFT) והמרחק הממוצע שעברו בעלי חיים עם הציוד/ניתוח, ובעלי חיים ללא הציוד/ללא ניתוח. (ב-ה) מדור DG מייצג עם תאים מסומנים BrdU (כהה אינטנסיבי) עבור EE וקבוצות דיור סטנדרטיות. לוחות B ו- D מציגים הגדלה נמוכה של ה- DG, ולוחות C ו- E מציגים את אזור התיבה בהגדלה גבוהה יותר. לוחות B ו- C הם רקמות מקבוצת הדיור EE, לוחות D ו- E הם מקבוצת הדיור הסטנדרטי. הכניסה מדגימה את המספרים הממוצעים של תאים מסומנים בשתי הקבוצות. ML - שכבה מולקולרית; GCL – שכבת תאים גרעינית; SGZ – אזור תת-גרעיני; חצים - תאי BrdU+. הגרפים מראים את הממוצע ± SEM. מבחן T-student שימש להשוואה בין קבוצות. * עמ≤0.05. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בין הקבוצות במבחן השדה הפתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ביצועי חקר בהערכת NORT. (A) זמן ראש באזור האובייקט עבור שלושת הניסויים. (B) הזמן נע לעבר האובייקטים עבור שלושת הניסויים. (ג) זמן לביקור בכל חפץ. הגרפים מראים את הממוצע ± SEM. מדידת ANOVA דו-כיוונית חוזרת עם מבחן ההשוואות המרובות של סידאק שימשה בכל הפרמטרים. * עמ≤0.05, ** עמ≤0.01 בין האובייקטים במשפט המתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: שינויים בעוצמת פס אלפא EEG הקשורים לחקירה. איור זה מראה שינויים בכוח אלפא יחסי, מחצי שנייה ל -2.5 לאחר שהחיה מתחילה לחקור את האובייקטים. ששת הגרפים התאימו לאלקטרודות המצחיות, המרכזיות והקודקודיות (מלמעלה למטה) ולצד שמאל וימין. עלילות קופסה מציגות את ההתפלגות של סדרות זמן כאלה עבור כל צירוף תנאים של אובייקט: "מוכר" ו"רומן", ושלב: "ACQ", "STM" ו- "LTM". אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: שינויים בעוצמת פס הבטא EEG הקשורים לחקירה. איור זה מראה שינויים בעוצמת הבטא היחסית, מחצי שנייה ל-2.5 לאחר שהחיה מתחילה לחקור את האובייקטים. ששת הגרפים התאימו לאלקטרודות המצחיות, המרכזיות והקודקודיות (מלמעלה למטה) ולצד שמאל וימין. עלילות קופסה מציגות את ההתפלגות של סדרות זמן כאלה עבור כל צירוף תנאים של אובייקט: "מוכר" ו"רומן", ושלב: "ACQ", "STM" ו- "LTM". אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
סרטון 1: סרטון מייצג המציג חולדה שהוקלטה בניסוי. החולדה הייתה בתוך הזירה ששימשה לפרוטוקול NORT. החולדה לבשה את האפוד המחובר למכשיר ה-EEG עם סוללה משובצת. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
סרטון 2: סרטון מייצג המציג EEG בו זמנית והקלטה התנהגותית. אות EEG הוצג בצד שמאל ואילו מבחן ההתנהגות (NORT) הוצג בצד ימין של הסרטון. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
Discussion
מחקר התנהגותי ואלקטרואנצפלוגרפיה הוא קשה ומאתגר מטבעו. לכן, השילוב של שתי הטכניקות מציג צעדים קריטיים משמעותיים. לפיכך, שתי הטכניקות בו זמנית אינן בשימוש נרחב. בפועל, כל קבוצה בעולם מבצעת מבחני התנהגות עם מצבים מיוחדים, כמו בעלי חיים, פרמטרים מנותחים או טיפולים. האמור לעיל יוצר מחלוקות משמעותיות בתחום ואת הצורך בפיתוח נהלים סטנדרטיים הזמינים לכולם. כאן, הכנו נוהל מפורט זה עם כל השלבים הקריטיים והשיקולים המתודולוגיים שאינם מתוארים או מוזכרים בדרך כלל ברוב המאמרים המתפרסמים. אלה יידונו להלן.
ייצור החומרים הדרושים הוא צעד בסיסי בהצלחת טכניקה זו. בהקשר זה, האלקטרודה צריכה להיות בנויה מאפס באמצעות ברגי נירוסטה, כבלי נחושת ורתך כסף. קשה לרתך חומרים אלה יחד לצמיתות, באופן כזה שיש לוודא את המוליכות והחוזק של כל אלקטרודה לפני השימוש. ניתן להשתמש בסוג אחר של חוט להרכבת האלקטרודות; עם זאת, הנחושת גמישה מספיק כדי לתפעל את האלקטרודה כדי להכניס אותה למחבר המגבר. בהקשר זה, השימוש אלקטרודות מסחריות רצוי, אבל הרכישה שלהם יכול להיות מסובך ויקר. הניתוח הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה. מומלץ מאוד ואף הכרחי להיעזר בכירורג מנוסה, במיוחד להשתלת אלקטרודות. מכיוון שהניתוח דורש לעיתים קרובות הארכת זמן ההרדמה ולעיתים גם יישום ריתוך במהלך הניתוח, על כל מעבדה לבצע את הבדיקות הנדרשות בהרדמה המתאימה (ניתן להשתמש בקוקטיילים שונים) לכל זן מכרסמים, במיוחד בתנאי ויבריום, הבדלים בין המלטות ואף הבדלים אינדיבידואליים בין בעלי חיים. תכנון והתחשבות נכונים יכולים למנוע אובדן בעלי חיים במהלך ניתוחים. השתלת אלקטרודות היא שלב מכריע נוסף. זה דורש זהירות רבה כדי למנוע אגרוף הגולגולת ולפגוע קרומי המוח או רקמת המוח. ברגים צריכים להיות ממוקמים כראוי, כלומר, קבוע לחלוטין בגולגולת, אחרת, רעש וממצאים יוצגו על אותות, כמו אלה הקשורים colocation או תנועה שאינה משתמשת ברישום EEG. תמיד יש לבצע ולצפות בטיפול ובתנאים לפני ואחרי הניתוח כדי למנוע את סבלו של המכרסם. לידוקאין תת עורי ניתן להשתמש על עור הראש לפני ביצוע החתך עם אזמל. טיפת מלח לעיני החיה תסייע במניעת יובש. כמו כן, תמיסת מלח חייבת להינתן בפה, ולאחר הניתוח, 1 מ"ל חייב להיות מנוהל או תת עורית או intraperitoneally כדי לפצות את מאזן הנוזלים של החיה ולמנוע התייבשות. מיד לאחר הניתוח, יש לתת תרופה אנטי דלקתית (להפחתת כאב), כמו גם אנטיביוטיקה באמצעות אנטיביוטיקה תת עורית או מקומית, ישירות בשולי הקרקפת שם נמצא כובע הצמנט הדנטלי (כדי להקטין את ההסתברות לזיהום). חזור על ההליך הנ"ל 24 שעות לאחר הניתוח. מיקום מגבר ה- EEG על גב החיה הוא הקושי העיקרי להקלטה בו זמנית. העיצוב והייצור של אפוד מבוססים במיוחד על גודל בעלי החיים. האפוד חייב לאפשר תנועה טבעית של המכרסם (ראה איור 5). זה האחרון יבטיח את היתרון העיקרי של הטכניקה, שהוא הקלטה של תנועות חופשיות. מאחר שבעלי החיים לא ניסו להסיר את האפוד, מחבר הראש או הכבלים לאחר הניתוח ובימים שלאחר מכן, ההנחה הייתה כי ההתקנה לא יצרה הגבלה משמעותית בתנועה או גרמה לכאב או אי נוחות. עבור פילוח EEG נכון בתקופות המבוססות על אירועים המסומנים על ידי BTS חובה לרשום פרוטוקול מוגדר היטב. ניתן למזג את הסימנים הזמניים על ידי מניפולציה של סדרות זמן מכיוון ששתי המערכות משתמשות באותו שעון כדי להגדיר את חותמות הזמן שלהן. האמור לעיל מרחיב את האפשרויות לניסויים בבעלי חיים תוך שילוב נתונים אלקטרופיזיולוגיים לניתוח.
הטכניקה המוצגת כאן יכולה לשמש בכל תחום מחקר במדעי המוח ועם מיני המורינים הנפוצים ביותר ואפילו מינים אחרים. הרבגוניות של תוכנת המעקב ההתנהגותי היא אחד היתרונות המשמעותיים ביותר מכיוון שניתן להשתמש בה ברבגוניות גדולה של מבוכים כמו מבוך מים מוריס, שדה פתוח, זיהוי עצמים חדשני, העדפת מקום מותנה, לוח חורים, מבוך מוגבה פלוס, מבוך Y, מבוך זרועות רדיאלי, מבוך בארנס ואחרים. ניתן להשתמש בו עד 16 מצלמות בו זמנית. בנוסף, ניתן לדווח על מאות מדדים שונים (למידע מפורט יותר ראו מדריכים31,32). קחו בחשבון שעבודה זו מתארת ניסויים עבור הקלטות EEG, כמה טכניקות אחרות כמו פוטנציאלי שדות מקומיים או הקלטה של יחידה אחת אפשריות. עם זאת, על המשתמשים לקחת בחשבון שההגדרה הכללית וכמה שלבי הכנה צריכים להשתנות למטרות אחרות. לכן, כאשר משתמשים בטכניקה זו יחד עם הקלטת EEG Wi-Fi, האפשרויות מורחבות, מכיוון שהיא מוסיפה פרספקטיבות חדשות למחקרים בבעלי חיים כמו אלה שבוצעו על בני אדם כדי להעריך מספר מאפיינים של אינטגרציה ודינמיקה של EEG, כמו קישוריות, עוצמת פס EEG או תגובות מעוררות. שלא כמו בני אדם, ניסויים בבעלי חיים אפשריים כדי להעריך מתן תרופות, שינויים גנטיים, או ביטוי, בין פרדיגמות ניסוי רבות אחרות. עבור ניתוח EEG, קחו בחשבון כי פרוטוקולים מסוימים יש מספר נמוך מאוד של חזרות על התנהגויות רצויות, אשר מגביל את האפשרות ממוצע תגובות ולקבל תוצאות אמינות. לכן, יש להקפיד לתכנן את פרוטוקולי ההקלטה והניתוח שהוא נחשב לבצע לפני תחילת הניסוי. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי עבודה בניסויים בבעלי חיים אינה אפשרית למניעת תנועה, מה שמגדיל את מורכבות פרוטוקול הניסוי ואת השיקולים לניתוח אותות ומשימות התנהגותיות. נכון לעכשיו, ציוד למערכות מעקב מלאות והקלטות EEG אינו סטנדרטי או מודולרי, מה שאומר שההתקנה שלהם מיועדת לפרוטוקול יחיד והתאמות לחקור משימות התנהגותיות אחרות, מה שמרמז / מציע עלויות גבוהות יותר למספר רב של מעבדות. מצב זה יכול להיפתר על ידי ביצוע האפשרויות שהוסברו במחקר זה. עם זאת, מספר שיפורים יכולים להתממש עבור ניסויים אמינים יותר. ניתן לשפר את העבודה במספר שלבים, החל מייצור אלקטרודות דרך עיבוד התנהגותי ואותות. עם זאת, הוכח כי מעקב אחר בעלי חיים ורכישת EEG אפשריים באמצעות מערך היי-טק זול אך זול.
לסיכום, העבודה הנוכחית היא ניסיון לסייע למדענים, במיוחד בתחום מדעי המוח, להיות מסוגלים להשתמש בשתי טכניקות אלה שאינן נפוצות בשילוב. לטכניקת ההקלטה הסימולטנית של EEG ובדיקות התנהגותיות באמצעות תוכנת מעקב התנהגותי יש יתרונות רבים, והיא יכולה להיות שימושית במיוחד בתחומים רבים של מדעי המוח, במיוחד בתחומי למידה וזיכרון. בהתחשב בציוד זה יש יכולות אחרות כמו הקלטה עמוקה של מבנים subcortical כמו ההיפוקמפוס, אבל כאמור, כמה שלבי הכנה ישתנו. ציוד אלחוטי פותר כמעט את כל המגבלות של גישת חוטים קונבנציונלית, כגון בעיות ניידות של בעלי חיים מכלוב אחד למשנהו, בעלי חיים מעוכבים או מסובכים עם הכבלים. טכניקת התקנה זו ידידותית למשתמש, כמתואר לעיל, וקבוצה כמעט לא מאומנת או לא מתמחה של מומחים או יחידים יכולה להשתמש בתוכנה זו. מחיר ציוד EEG נמוך יותר ממגבר EEG רגיל. תוכנת מעקב התנהגותית היא גם אחת התוכנות הזולות ביותר למעקב וידאו בשוק. תוכנה זו דורשת רישיונות שנתיים. ניתן להשתמש בציוד ביותר ממערך ניסוי אחד, בעלי חיים שונים וסוג הרבגוניות. אנו מקווים כי מאמץ זה יסייע לקהילה המדעית ויספק גישה קלה לחקור בו זמנית את ההתנהגות ואת electroencephalography.
Disclosures
ד"ר סילביה אורטגה-מרטינז עובדת כעובדת של Stoelting Co., חברה שסיפקה ומימנה את ההפקה וגישה פתוחה למאמר זה.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות למר מיגל בורגוס ולמר גוסטבו לאגו על מתן סיוע טכני. אנו אסירי תודה ל- Stoelting Co. על כיסוי עלויות הפקת הווידאו, Jinga-hi, Inc. על מתן סיוע טכני, ו- División de Investigación y Posgrado של Universidad Iberoamericana Ciudad de México על הענקת כספים לעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #2 Variable speed rotary tool tip | Reorder #310048, Lenght 44.5mm | SS White | For making the holes where the screws will be inserted |
| #4 Scalpel and blade | |||
| 50 X 50 X 50 cm Open Field Black Mate Arena | |||
| 8 pin Receptacle Housing Female | Amphenol FCI | 10147606-00008LF | |
| 8 pin Receptacle Housing Male | Amphenol FCI | 10147603-00008LF | |
| Acrylic Resin | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
| ANY-maze video tracking software | Stoelting, Co. | version 6.1 | http://www.anymaze.co.uk/) |
| benzalkonium chloride antiseptic solution | Benzal | Benzal | |
| Bulldog clamps | Cientifica VelaQuin | For retracting the skin | |
| Camera | Logitech | c920 | |
| Copper wire | |||
| Crimp contact | Amphenol FCI | 10147604-01LF | |
| DELL PC | DELL | ||
| Electrode | |||
| JAGA16 | Jinga-Hi, Inc. | JAGA16 | |
| Ketamine | PiSA Agropecuaria | ANESKET | For anesthesia |
| MATLAB | R2020a | MathWorks | Script was develop ped in collaboration with Jinga-Hi, Inc. |
| Monomer | MDC Dental | NicTone | For fixating the screws to the skull |
| Neurophys software | Jinga-Hi, Inc./ Neurosys, LLC | Neurosys 3.0.0.7 | |
| Screwdrive | For inserting the screws into the skull | ||
| Screws | |||
| Screws equiped with electrode | |||
| Stereotaxic instrument | KOPF | For the surgery | |
| Variable speed rotary tool | Dremel 3000 | Dremel | For making the holes where the screws will be inserted |
| Voltmeter | PROAM | MUL-040 | For confirming that the electrode conducts electricity |
| Xilazine | PiSA Agropecuaria | PROCIN | For anesthesia |
References
- Hånell, A., Marklund, N. Structured evaluation of rodent behavioral tests used in drug discovery research. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 1-13 (2014).
- Buenrostro-Jáuregui, M., et al. SEXRAT MALE: A smartphone and tablet application to annotate and process live sexual behavior in male rodents. Journal of Neuroscience Methods. 320, 9-15 (2019).
- Jun, J. J., Longtin, A., Maler, L. Long-term behavioral tracking of freely swimming weakly electric fish. Journal of Visualized Experiments. (85), e50962 (2014).
- Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
- Zheng, W., Ycu, E. A. A fully automated and highly versatile system for testing multi-cognitive functions and recording neuronal activities in rodents. Journal of Visualized Experiments. (63), e3685 (2012).
- Melo-Thomas, L., et al. A wireless, bidirectional interface for in Vivo recording and stimulation of neural activity in freely behaving rats. Journal of Visualized Experiments. (129), e56299 (2017).
- Noldus, L. P. J. J., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. J. Ethovision Video Tracking System. Behavior Research Methods, Instruments, and Computers. 33 (3), 398-414 (2001).
- Datta, S. R., Anderson, D. J., Branson, K., Perona, P., Leifer, A. Computational Neuroethology: A Call to Action. Neuron. 104 (1), 11-24 (2019).
- Medlej, Y., et al. Enhanced setup for wired continuous long-term EEG monitoring in juvenile and adult rats: application for epilepsy and other disorders. BMC Neuroscience. 20, 8 (2019).
- Weiergräber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Research Protocols. 14 (3), 154-164 (2005).
- Etholm, L., Arabadzisz, D., Lipp, H. P., Heggelund, P. Seizure logging: A new approach to synchronized cable-free EEG and video recordings of seizure activity in mice. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 254-260 (2010).
- Jinga-hi. JAGA16 Wireless Electrophysiology Recording Device. , Available from: https://www.jinga-hi.com/hardware-jaga16 1 (2020).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Bruel-Jungerman, E., Laroche, S., Rampon, C. New neurons in the dentate gyrus are involved in the expression of enhanced long-term memory following environmental enrichment. European Journal of Neuroscience. 21 (2), 513-521 (2005).
- Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).
- Trinchero, M. F., Herrero, M., Monzón-Salinas, M. C., Schinder, A. F. Experience-Dependent Structural Plasticity of Adult-Born Neurons in the Aging Hippocampus. Frontiers in Neuroscience. 13, 739 (2019).
- Shors, T. J., et al. Erratum: Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories (Nature (2001) 410 (372-376)). Nature. 414 (6866), 938 (2001).
- Song, H., et al. New neurons in the adult mammalian brain: Synaptogenesis and functional integration. Journal of Neuroscience. 25 (45), 10366-10368 (2005).
- Zhao, C., Teng, E. M., Summers, R. G., Ming, G. L., Gage, F. H. Distinct morphological stages of dentate granule neuron maturation in the adult mouse hippocampus. Journal of Neuroscience. 26 (1), 3-11 (2006).
- Irvine, G. I., Logan, B., Ecket, M., Abraham, W. C. Enriched environment exposure regulates excitability, synaptic transmission, and LTP in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 16 (2), 149-160 (2006).
- Tashiro, A., Makino, H., Gage, F. H. Experience-specific functional modification of the dentate gyrus through adult neurogenesis: A critical period during an immature stage. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3252-3259 (2007).
- Moreno-Jiménez, E. P., et al. Adult hippocampal neurogenesis is abundant in neurologically healthy subjects and drops sharply in patients with Alzheimer's disease. Nature Medicine. 25 (4), 554-560 (2019).
- Cohen, S. J., Stackman, R. W. Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task. A review. Behavioural Brain Research. 285, 105-117 (2015).
- Fagan, J. Memory in the infant. Journal of Experimental Child Psychology. 9 (2), 217-226 (1970).
- Baxter, M. G., et al. I've seen it all before" Explaining age-related impairments in object recognition. Theoretical comment on Burke et al. Behavioral Neuroscience. 124 (5), 706-709 (2010).
- Antunes, M., Biala, G. The novel object recognition memory: Neurobiology, test procedure, and its modifications. Cognitive Processing. 13 (2), 93-110 (2012).
- Ennaceur, A., Delacour, J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behavioural Brain Research. 31 (1), 47-59 (1988).
- Winters, B. D., Forwood, S. E., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Double dissociation between the effects of peri-postrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: Heterogeneity of function within the temporal lobe. Journal of Neuroscience. 24 (26), 5901-5908 (2004).
- Forwood, S. E., Winters, B. D., Bussey, T. J. Hippocampal lesions that abolish spatial maze performance spare object recognition memory at delays of up 48 hours. Hippocampus. 15 (3), 347-355 (2005).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (1997).
- Stoelting Co. Getting started with ANY-maze Setting up and starting work with ANY-maze. , Available from: https://www.braintreesci.com/images/ANYMaze.pdf (2006).
- Stoelting Co. A detailed description of the ANY-maze measures. , Available from: https://www.anymaze.co.uk/a-detailed-description-of-the-any-maze-measures.pdf (2010).
