Summary
ここでは、 サッカロミセスセレビシエの増加したコピー数サプレッサー画面を介して遺伝的相互作用を識別するためのプロトコルです。この方法により、研究者は短命酵母変異体のサプレッサーを同定、クローン化、および試験することができます。オートファジーヌル変異体における SIR2 のコピー数増加が寿命に及ぼす影響を試験する。
Abstract
老化は、死の確率を高める生物の正常な生物学的プロセスの時間依存性の悪化である。多くの遺伝的要因は、通常の老化プロセスの変化に寄与する。これらの要因は、多くの生物で同定され保存された豊富な文書化されたリンクによって証明されるように、複雑な方法で交差します。これらの研究のほとんどは、多くの遺伝子を同時に迅速にスクリーニングすることを可能にする機能喪失、ヌル突然変異体に焦点を当てています。このプロセスにおける遺伝子の過剰発現の役割を特徴付けすることに焦点を当てた作業ははるかに少ないです。本研究では、多くの遺伝的背景に見られる短命の年代順寿命表現型の抑制に関する研究のために、出芽酵母サッ カロミセス・セレビシエの遺伝子を同定し、クローン化するための簡単な方法論を提示する。このプロトコルは、さまざまな背景から、様々な学問段階で研究者がアクセスできるように設計されています。ヒストンデアセチラーゼをコードする SIR2 遺伝子は、時系列寿命への影響に関する矛盾する報告があったため、pRS315ベクターのクローニングに選択された。 SIR2 はまた、オートファジーにおいて役割を果たし、転写因子 ATG1を含む複数の遺伝子の欠失を介して破壊された場合に生じる。原理の証明として 、SIR2 遺伝子をクローン化し、オートファジー欠損型 atg1Δ 変異体の短寿命表現型特性にサプレッサースクリーンを実行し、それ以外のアイソジェニックで野生型の遺伝的背景と比較する。
Introduction
老化は、最終的に生物死亡の確率を高める無数の生物学的プロセスにおける誠実さの時間依存的喪失である。老化は、すべての種のためにほぼ避けられません。細胞レベルでは、ゲノム不安定性、エピジェネティック変化、プロテオスタシスの喪失、ミトコンドリア機能不全、規制緩和された栄養センシング、細胞老化、およびテロメア消耗11、22など、老化に関連するいくつかの特徴があります。酵母のような単細胞生物では、これは複製電位および年代的寿命33、44の減少をもたらす。これらの細胞変化は、癌、心不全、神経変性、糖尿病、骨粗鬆症55、6、76,を含む病理として、ヒトのようなより複雑な生物に現れる。老化のプロセスを特徴づける多くの複雑さにもかかわらず、広く発散する生物,8、9、109に渡ってこのプロセスの根8底にあるこれらの分子的特徴の保全がある。10老化時にこれらの経路の変化を同定すると、生活習慣の変化によって操作できることが実現した- 食事制限は、多くの生物の寿命を大幅に延ばすことを示している11.これらの経路は、複雑な方法で互いに収束し、交差し、他の多くの経路。これらの相互作用の解明と特徴付けは、寿命と健康寿命を延ばすために治療介入の可能性を提供します12,,13,,14.
老化の分子基盤の保全は、より単純なモデル生物の使用を通じてプロセスの基礎となる遺伝的相互作用の機能的解剖を可能にする - 出芽酵母、サッカロマイセスcerevisiae15、16,16を含む。出芽酵母によってモデル化された老化の2つの確立されたタイプがあります:時系列老化(時系列寿命、CLS)および複製老化(複製寿命、RLS)17。時系列のエージングは、細胞が非分割状態で生き残ることができる時間を測定します。これは、細胞4などG0で人生の大半を過ごす細胞に見られる老化に似ています。あるいは、複製寿命は、細胞が枯渇前に分裂できる回数であり、有糸分裂的に活性な細胞型(例えば、細胞が有することができるドーター細胞の数)18である。
この方法の全体的な目標は 、S.cerevisiaeを使用して老化の遺伝学の機能的解剖を可能にするプロトコルを提示することです。多くの研究者が多くの優れた研究を行い、現在の理解を得ていますが、新進研究者が学業の早い段階から高齢化に貢献する機会は数多く残っています。研究者が老化の分野をさらに進めることを可能にする明確な方法論を提示します。このプロトコルは、独自の新しい仮説を策定し、テストするために必要なツールを提供することにより、彼らの学術的なキャリアの段階に関係なく、すべての研究者のためにアクセスできるように設計されています。私たちのアプローチの利点は、これは、機関に関係なく、すべての研究者が容易にアクセスできる費用対効果の高い方法であるということです - そして、いくつかのプロトコル19に必要な高価な、特殊な機器を必要としません。このタイプのスクリーンを設計する方法はいくつかありますが、この研究で概説されているアプローチは、酵母の等原性野生型株と比較して時系列寿命の著しい減少を示す非本質的遺伝子のヌル突然変異体をスクリーニングするのに特に適しています。
我々の原理証明として、我々はSIR2、リジンデアセチラーゼを過剰発現時に延長および短縮CLSの両方を示すと報告したクローンを作成する。SIR2過剰発現は最近、ワイン造酵母のCLSを増加させることが判明した。しかし、いくつかのグループはSIR2とCLS拡張間のリンクを報告していない、 特徴付けられる20、21,、22の下でその役割を残す 。文献のこれらの矛盾する報告のために、我々は、ある場合、時系列老化におけるSIR2の役割を明確にするために独立した研究を追加するために、この遺伝子を選択しました。さらに、SIR2ホモローグのコピー数を増やすと、線虫モデルシステム23の寿命が延びる。
オートファジーは、細胞内分解系であり、タンパク質やオルガネラなどの細胞質製品をリソソーム24に送達する。オートファジーは、細胞の恒常性を維持するために損傷したタンパク質およびオルガネラを分解する役割を通じて長寿と密接に結びついている。オートファジーの誘導は、多くの遺伝子の発現を調整することに依存し、そしてATG1遺伝子の欠失は出芽酵母26において異常に短いCLSをもたらす。オートファジーおよび細胞質-液胞(真菌リソソーム等価)経路27,28,28における小胞形成に必要なタンパク質セリン/スレオニンキナーゼに対するATG1コード。ここでは、コピー数の増加画面のメソッドを紹介し、野生型のCLSおよびatg1-nullバックグラウンドでSIR2コピーが増加した場合の効果をテストします。この方法は、主に学部の機関の若手研究者や研究グループに特に適しています, その多くは、科学で過小評価され、限られたリソースを持っているコミュニティにサービスを提供しています.
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Protocol
1. スクリーニングのための潜在的な遺伝的相互作用を特定する
- 遺伝的背景を同定し、サッカロマイセスゲノムデータベース(SGD、https://www.yeastgenome.org29,30)を用いてサッカロマイセス・セレビシエで異常に短い時系列寿命(CLS)を生じ、この生物の既知のフェノ29,30ミカル情報をまとめます。
- Web ページの上部にあるオプションから[ 関数 ]タブを選択します。
- [ 表現型] を 選択し、[ すべての表現型を参照]を選択します。
- 酵母表現型オントロジーオプションから「開発」の小見出しまでスクロールし、「寿命」の下にある「時系列の寿命」を選択します。
- 減らされた修飾子を選択すると、削除時に年代的な寿命表現型が減少する表現型を示す遺伝子を同定できます。この方法証明atg1Δが選択された場合、短命のCLS表現型を生じ、オートファジー26に対して破壊される。
- 部分1.2で同定された変異体の報告または予測されたオントロジー属性に基づいて、表現型を抑制する可能性のある遺伝的相互作用をスクリーニングする標的遺伝子を同定する。上記の手順 1.1.1~1.1.4 に示すように表現型検索を繰り返し、野生型のバックグラウンドで過剰発現すると CLS が長くなる遺伝子を検索します。SIR2は報告されたCLS表現型に基づいて選択され、オートファジー31,32,との相互作用を報告した。
2. 試薬の準備
注:特に指定されていない限り、各溶液を121°Cで20分間、使用前に滅菌してください。
- YPAD液体培地:1%酵母エキス、2%ペプトン、2%デキストロース(グルコース)、40mgアデニン(アデニン硫酸脱水)を2リットル当たり2倍蒸留水で添加します。磁気攪拌機でよく混ぜます。
- LB液体培地:トリプトン(10g)、酵母エキス(5g)、塩化ナトリウム(10g)を2重蒸留水1リットル当たりに添加する。磁気攪拌機でよく混ぜます。
- 1000x(100 mg/mL)アンピシリンストックを二重蒸留水で調製します。よく混ぜて、殺菌をフィルターに入れ。
- 合成完了 - ロイシン (SC-LEU) 液体メディア: 1.7 gの酵母窒素塩基 w/o アミノ酸を加え、 2% グルコース、 SC-LEU ドロップアウトミックスの 1.92 g、 硫酸アンモニウムの 5 g 2 重蒸留水 1 リットルあたり.磁気攪拌機でよく混ぜます。
- TEバッファー:二重蒸留水で溶液中のトリス(10 mM最終濃度)、EDTA(1 mM最終濃度)を混合します。磁気攪拌機でよく混ぜます。
- 二重蒸留水で溶液に50%PEG 3350を準備します。磁気攪拌機でよく混ぜます。
- 1 Mと100 mMの酢酸リチウム溶液を二重蒸留水で調製します。磁気攪拌機でよく混ぜます。
注:固体寒天プレートを作るためには、オートクレーブする前に2.1と2.2上記の媒体に寒天(二重蒸留水でリットル当たり)を追加します。アンピシリンプレートを準備する場合は、約60°Cに冷却した後、上記2.2で培地にアンピシリンの1mLを追加します。滅菌プレートに注ぎ、使用前に48〜72時間に設定することができます。プレートを4°Cで保管し、より長く保管してください。
3. クローン作成戦略を設計して 、SIR2 をpRS315ベクターに複製する
- PCRプライマーを設計して、pRS315ベクターにクローニングするための SIR2 遺伝子を増幅します。
- SIR2の上流および下流のインタージェニック領域に対して 21 ~ 22 のヌクレオチド相補性を持たるように、プライマーを手動で設計します。利用可能なデータセット,33,34からこれらの特徴をマッピングすることによって、mRNA の未翻訳領域と共に、遺伝子全体がクローン化されることを確認します。
- PCR プライマー設計により、53 °C 以上の融解温度(Tm)と 60 °C 以下の順方向および逆プライマーが得られるようにします。
注:理想的には、両方のプライマーは、配列が許す限り互いに近いTmを持ち、およそのGC含有量は40〜50%であり、二ヌクレオチドの繰り返しを避け、配列全体でGCとATの分布をバランスさせる必要があります。 - クローニング用のアンプリコンの生成を可能にするPCRプライマーの設計後、プラスミドクローニングベクターと互換性のある各プライマーの5'末端に制限酵素消化(R.E.D.)標的部位を追加します。この方法では、上流にHindIII制限酵素消化部位(5'-AAGCTT-3')を加え、前進プライマーおよびSacII制限酵素消化部位(5'-CCGCGG-3')を下流に添加し、逆プライマー。
注:SacIIおよびHindIIIサイトの使用は、各エンドヌクレアーゼのコンセンサスカット部位が標的遺伝子に存在しないことを要求する。いずれかの酵素が標的遺伝子内で標的となる場合は、代替制限酵素を選択する必要があります。pRS315 ベクター上のポリリンカー領域と互換性のある多くがあります。 - 最後に、4つのヌクレオチド(5'-NNNN-3')配列を各プライマーの5'末端に追加し、制限酵素がアンプリコンを結合して消化できるようにします。プライマーが設計されたら 、SIR2 遺伝子をクローニングして使用するためにオリゴヌクレオチドを商業的に合成している。
- PCRプライマーの再懸濁液:最大速度で最大速度で卓上マイクロフュージを使用してPCRプライマーを4分間遠心分離します。TE溶液を添加して100μMのストック濃度を得て、-20°Cでストック濃度を保存し、1/10を希釈してPCR用途に使用します。
注:100 μMストックを作るためには、プライマーチューブ内のnモルの量の10倍である無菌TEバッファの体積にプライマーを溶解し、TEのマイクロリットルを使用します。たとえば、チューブにプライマーの15.6 nモルが含まれている場合は、156 μLのTEバッファを追加します。
- SIR2クローニングコンストラクトのPCR増幅のために野生型酵母gDNAを分離します。
注:酵母gDNAを単離するために、いくつかの高品質のオプションが市販されています。真菌細胞壁の消化を含むキットをzymolyaseで利用すると、gDNAの品質が向上します(高収率、不純物が少なくなります)。以下のプロトコルは一貫して高濃度および純度を返す。キットの詳細は、材料表をご覧ください。- YPADなどの濃縮培地中でログ後段階に48〜72時間野生型酵母の5mL培養を成長させます。酵母細胞を>800 x g で室温で3分間ペレットし、成長培地を取り除き、5 μLのジモリヤーゼ酵素を補ったジモリアーゼ消化バッファーの120 μLで再懸濁します(2単位酵素/μL)。37°Cで40分間、ボルテックスでサンプルを混ぜます。
- 120 μLのカオトロピックリシスバッファー(例えば、塩化グアニジニウム)、250 μLのクロロホルム、および渦を60秒に加えます。
- 2分間の>8,000 x g で遠心分離機を用い、滅菌回収管の浄化カラムに上清を移します。
- 60 s の場合は 8,000 x g の遠心分離機を使用して、流れを破棄します。gDNAはカラムマトリックスにバインドされます。
- 300 μLのエタノールベースの洗浄バッファーでカラムを2回洗浄し、上から遠心分離ステップを繰り返します(3.2.4)。各スピンの後に流れを破棄します。カラムを1.5 mLマイクロフュージチューブに移し、60μLのTEバッファを加え、室温で60秒インキュベートします。フラッシュは、DNAを溶出するために30 sのサンプルを回転させます。
注:サンプル中のDNAの濃度(260nmの吸光度)と品質(吸光度260nm/280nm)を決定します。一般的な収量は、260nm/280nmの吸光度比を可能な限り1.8に近づけて、gDNAの100〜200 ng / μLになります。
- クローニング用のpRS315プラスミドベクターを増幅および分離します。
注: プラスミドベクターの精製には、いくつかの高品質のオプションが市販されています。このステップでは、シリカ系カラムケミストリーをお勧めします。以下に示す変化は、最高濃度と純度につながっています。.詳細については、 資料一覧を参照してください。- pRS315ベクターを含む 大腸菌 の培養5mLをLB+アンピシリン(80μg/mL)培地で一晩成長させます。RT(15~25°C)で2分間、>8,000 x g で遠心分離して培養を行う。
- ペレット化された細菌細胞を250 μLのTEバッファーにRNase A(100 μg/mL)で再懸濁し、マイクロ遠心チューブに移します。セルの束が残らないようにします。
- 250 μL のライシスバッファーを加え、チューブを 6 ~8 回反転して混合します。室温で5分間インキュベートします。5分以上の間、リシスを進めないようにしてください- 少し少ない方が好ましいです。
- 350 μLの中和バッファーを加え、チューブを10回反転して、すぐに完全に混ぜます。遠心分離機 10分間 >8,000 x g.
- 上清を上からシリカスピンカラムに慎重に移します。30 sの遠心分離機とフロースルーを破棄します。
- ステップ3.3.5のように、高塩洗浄バッファーと遠心分離機を500 μL加えます。フロースルーを破棄します。750μLのエタノールベースの洗浄バッファーを加えてDNA結合スピンカラムを洗浄し、残留塩、および遠心分離機をステップ3.3.5のように除去します。
- 流れを通して遠心分離機を廃棄し、さらに 2 分間 >8,000 x g で残りの洗浄バッファーを除去します。スピンカラムを、1.5 mLマイクロ遠心チューブにラベル付けされた清潔なチューブに入れます。DNAを溶出するには、スピンカラムの中心に20μLのTEバッファを追加し、室温で1分間インキュベートし、遠心分離機を>8,000 x gで1分間インキュベートします。
- 分光光度計を使用して、DNAの量(260nmの吸光度)とDNAの品質(吸光度260 nm/280 nm)を決定します。一般的な収量は1~2 μg/μLです。
- 候補遺伝子のPCR増幅 、SIR2、 野生型ゲノムDNAからの
- クローニングに適したアンプリコンを製造するには、高忠実度(HF)PCRポリメラーゼを利用して、増幅される配列への意図しない突然変異の生成を回避します。
注: 多くの異なる高忠実度 PCR オプションが市販されています。PCR 反応条件の最適化を容易にするために、2 バッファーの組み合わせ(標準の HF バッファと高い GC および複合アンプリコン用に最適化されたもの)を使用します。詳細については、 材料表を参照してください。 - PCRは、表1に記載されているように、複製用のSIR2コンストラクトを増幅する。
注:クローン作成ステップでの成功を最大化するために、PCRカラムのクリーンアップ手順で、同一の50 μLを複数設定して集中させることができます。gDNAテンプレートコントロールリアクション(ネガティブコントロール)を設定してください。 - 表 2 に記載されているように、PCR のサイクリング条件を設定 します。
注:異なるプライマーペアは、そのアニーリング温度と異なる速度で異なるポリメラーゼ機能に異なります。選択した酵素と設計されたプライマーの組み合わせの仕様に基づいて、増幅条件を最適化してください。 - PCR反応の成功を確認するには、約2.5 kbのDNA断片を生成するPCR反応を、1.0%のTAE-アガロースゲル(可視化用の0.5 μg/mL臭化エチジウム)で可視化します。
- クローニングに適したアンプリコンを製造するには、高忠実度(HF)PCRポリメラーゼを利用して、増幅される配列への意図しない突然変異の生成を回避します。
- 候補遺伝子の消化およびライゲーションは、SIR2、pRS315プラスミドベクターに。 SIR2
- ベクターとインサートの制限消化を行います:625 ng DNA(ベクターまたはインサート)、q.s.水を用いて最終反応量を50 μL、5 μLバッファー、1 μL SacII、および1 μL HindIIIにします。制限消化を37°Cで3時間インキュベートし、続いて80°Cで20分間酵素を加熱不活性化させる。消化は、次のステップに進む前に4°Cで保存することができます。
- 15 μL のライゲーション反応を設定して、望ましいプラスミドを作成します:6 μL の無菌水、2 μL 消化ベクター(50 ng DNA)、4 μL 消化インサート(100 ng DNA)、2 μL T4 反応バッファー、T4 DNA リガーゼ 1 μL。ライゲーション反応を16°Cで一晩インキュベートし、続いて80°Cで20分間酵素を加熱不活性化させる。
注:インサートの代わりに、4μLの無菌水(合計10μL)を追加で置き換えて、無挿入制御を設定します。 - ライゲーション反応を 大腸菌に変換します。
注:使用可能な有能なセルに利用可能な多くのオプションがあります。このプロトコルは使用前に-80 °Cで貯えられている化学的に有能な細胞を使用する。- 凍結した有能な 大腸菌 細胞の50μLチューブを氷上で解凍するだけで解凍し、15 μLのライゲーション反応をすぐに加えます。チューブを数回フリックします。すぐにチューブを氷に戻し、30分間インキュベートします。
- ちょうど42°Cの水浴で20sの細胞を熱ショックし、すぐに2分のインキュベーションのために氷にチューブを戻します。各変換反応に室温回復媒体(SOCまたはLBなど)を450μL加え、37°Cで60分間、揺れでインキュベートします。
- 各変換反応に対して、細胞の1:10希釈を行います。滅菌技術を用いて、希釈されていない細胞のプレート150μLおよびLB+(80μg/mL)アンピシリンプレート35に1:10希釈液を用いた。プレートを一晩37°Cでインキュベートします。
- 過剰発現ベクトルの将来の形質転換体をスクリーンします。
- 滅菌技術を使用して、5 mL LB + (80 μg/mL) アンピシリンに成長した潜在的な形質転換体を接種し、一晩成長します。上記のセクション3.3.1~3.3.7で概説した手順に従って、制限消化によって挿入物を正常に統合し、その後1.0%TAE-アガロースゲル(可視化用臭化エチジウム0.5μg/mLエチジウム)をゲル電気泳動して、挿入物を正常に統合するために、プラスミドをあらゆる潜在的な形質とスクリーンから分離します。
4. ベクターを atg1Δ および野生型酵母菌株に変換する
注: これは、改変された酢酸リチウム変換プロトコル36を使用して実行されます。
- 野生型のペレット15mLおよびatg1-ヌル酵母細胞は、YPAD培地で一晩成長し、室温で3分間の成長を3分間の初期から中ログ相(O.D. 600nm = 0.4-0.9)にする。
- 上清をデカントし、細胞ペレットを1mLの無菌ddH2Oで再懸濁し、内容物を1.7 mLマイクロフュージチューブに移す。細胞を室温で>800 x g で3分間ペレットします。
- 上清を取り除き、優しいピペットで100mMの酢酸リチウムの250 μLで細胞を再懸濁します。実行する変換のそれぞれについて、セルを別々のマイクロフュージチューブに分割します。セル-酢酸リチウムミックスを変換ごとに50μL使用してください。
- 変換ミックスを設定します。各変換に加えて:50%PEG3350の240 μL、1.0 M酢酸リチウムの36 μL、および5 μLのサケ精子(または他のキャリア)DNAを、5分間沸騰させ、氷上で煮込んだ。
注:PEGは非常に粘性です。ピペットと慎重に測定します。移る前に各成分を添加した後にピペットで混合する。 - 実行される変換ごとに適切なプラスミドを5μL追加します。各チューブを渦が完全に混合する。30°Cで45分間インキュベートします。42°Cで10分間熱ショックサンプル。
- ペレット細胞は室温で> 800 x g で3分間、変換ミックスを慎重に取り除き、上記のスピンを繰り返して300 μLの滅菌ddH2O.ペレットセルでサンプルを再中断し、慎重に水を取り除き、200 μLの無菌ddH2Oでサンプルを再中断します。
- 酵母の形質転換株ごとに1/10と1/100希釈液を設定します。
- 各サンプルからSC-ロイシンプレートに150μLの滅菌技術プレートを使用して、プラスミドを選択した。細胞を均一に均等に広げ、30°Cで反転してインキュベートする前にプレートを乾燥させて48〜72時間成長させます。
注:適切な株が生成されると、-80°Cで25%グリセロールに長期保存されてもよいです。 存在するコピー数の定量は、qPCR、RNA-FISH、または別の適切な尺度37、38,38を含むいくつかの方法論によって決定することができる。
5. 短縮CLS表現型抑制をテストする時系列の寿命を決定する
- 短命酵母におけるCLSに対する推定サプレッサーの過剰発現の効果をテストし 、atg1Δ 変異体は、時間39の関数として残っているコロニー形成単位(CFUs)の数を決定することによってである。
注: 実験のこの部分は、適切なコントロールを使用して設定する必要があります。典型的な実験では、酵母の野生型(WT)株を空のベクター、WTをサプレッサーベクター、削除変異体を空ベクトル、およびサプレッサーベクターを用いた欠失変異体とを比較する。- 研究し、SC-LEUメディアにそれを接種するために株の単一のコロニーを取ります。30°Cで72時間培養し、振る。
- ヘモサイトメーターを用いて、培養40に存在する細胞の濃度を決定する。
- 培養物のアリコートを希釈し、その結果、150μLの無菌水量で均一な数の細胞となるようにする。滅菌技術を使用して培養液をSC-LEUプレートにプレートし、30°Cで72時間成長させます。これらのプレートは3日目のタイムポイントであり、実験はこの時点まで100%生存率39として正規化されます。
注: セルの数は 200 ~ 500 で、分析には十分な大きさ、カウント用の管理可能な数に十分な大きさを指定してください。本研究では、めっき量に200個の細胞を用いた。 - 5.1.3で概説されているように、通常のアリコートとメッキを取って、30°Cで酵母培養をインキュベートし続けます。株が生存できなくなるまでこのプロセスを続け、結果をコンパイルして分析します。
注: この研究で使用される株の完全なリストは 、表 3にあります。
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Representative Results
加齢時のSIR2の役割に関する矛盾する報告があるので、atg1Δ変異体の短縮CLS表現型26の潜在的な抑制剤としてこの遺伝子を研究に選んだ。SIR2の役割はやや議論の余地があり、CLSを拡張する役割に関する矛盾する報告がありますが、少なくとも1つの酵母バックグラウンドにおけるCLSの増加に明確に関連しており、オート22ファジーと31、32、41,32の両方の役割を果たしています。,41,
プラスミドベクターの私達の選択は、出芽酵母および細菌42の両方における遺伝子操作、伝播、および維持の容易さのために構築されたpRS315シャトルベクターである。このベクターは、LEU2栄養マーカーを含み、T7およびT3プロモーター、および細胞分割42中の安定な通過のための中心(CEN)ベクターである。このベクターの有糸分裂間の安定性は、栄養マーカー42によって異なる等元性ベクターと比較した場合より望ましい。pRS315ベクターには自律的に複製するシーケンスも含まれており、CENと組み合わさって、細胞集団43内(および全体)内の低い、一貫したプラスミドレベルを維持する。
SIR2遺伝子とそれに対応する上流(5'UTR)および下流(3'UTR)ゲノム領域のDNA配列を33に得た。転写された遺伝子にタンパク質産物の安定性と翻訳に必要な成分UtRが含まれていることを確認するために、私たちの最初のウィンドウは+/- 400 bpでした。このウィンドウは、この領域内のヌクレオチド組成物に基づいて+/- 500bpに拡大しました。我々は、各プライマーの5'末端に加えた制限消化部位と4ヌクレオチドのオーバーハングを組み込んで、遺伝子および対応する調節領域の増幅を可能にするPCRプライマーを設計した(図1A)。PCRによるこの領域の増幅が成功すると、DNA断片の長さは2.469kbになります(図1B)。
SIR2をPCRによって増幅し、この反応の産物をアガロースゲル電気泳動で可視化し、鋳式制御反応なしと比較した(図2)。SIR2増幅はゲノムDNAテンプレートを用いて両方のレーンで見られた。2つの反応をプールし、濃縮した。大腸菌からpRS315のプラスミド精製を行い、アガロースゲル電気泳動により可視化した(図3)。試料を分光光度法で定量し、256ng/μL(OD260/280= 1.87)の濃度を有するクローニング用に、変換素#2からプラスミドの準備を選択した。
プラスミドとインサートをHindIIIおよびSacIIで消化し、一緒に結紮し、増幅およびスクリーニングのために 大腸菌 に変換した。これらの制限消化部位の選択には、複製される領域にどちらのサイトも存在しないという検証が必要でした。一方の(または両方)部位の存在は 、SIR2 遺伝子をクローン化するために代替制限酵素を使用する必要があり、そしてpRS315ポリリンカー領域42内から選択するいくつかがある。
ヒンドIIIとSacIIによる二重消化による挿入物の切除によってpRS315-SIR2ベクターの正常な作成のための形質転換体をスクリーニングし、続いてアガロースゲルの視覚化を行った(図4)。pRS315-SIR2ベクターは、CLS特性評価に使用される株を生成するために野生型とatg1Δ変異体の両方に変換された。pRS315ベクターは、この特定のシステムの利点の1つである広く使用され、特徴付けられている古典的なベクターです。相対コピー番号は、前述の37のように qPCR (図 5) によって決定されました。その結果、コピー数はセル当たり平均 1 コピーからセルあたり平均 2.5 コピーにまで、以前のレポート42と一致するように、適度に増加しました。
atg1Δ+pRS315-SIR2の年代順寿命を、挿入物の代わりに空のベクターを含む酵母の等元性株(atg1Δ+pRS315)と比較した。老化培養物を一貫した、等価な希釈でめっきし、イメージングおよび定量化の前に30°Cで72時間成長させた(図6A)。成長したコロニー形成単位の数を決定し、3日目のタイムポイント(最初に採取したもの)に正規化し、プロットした(図6B)。ATG1ΔバックグラウンドのCLSに対するSIR2構造の統計的に有意な影響はないと報告する。さらに、野型の背景には CLS の拡張は見ませんでした - 控えめなSIR2過剰表現は、実際には空のベクトル コントロールと比較して CLS の減少を生じさせます (図 6B)。
図 1: SIR2のクローンを作成するためのコンストラクトの設計 SIR2 遺伝子に隣接するゲノム領域を利用して、遺伝子の増幅およびクローニングのためのPCRプライマーを設計した。プライマーは、遺伝子の上流の領域419塩基対(FP)および351塩基対遺伝子(RP)の下流に対する相補性の21ntを含む、HindIIIまたはSacII制限消化部位、および4ヌクレオチドのオーバーハング(A)のいずれか。 SIR2 の新生領域をクローニングするために設計されたプライマーを用いてPCRによって作成されたアンプリコンの概略図と、対応するサイズ(B)を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゲル電気泳動により可視化された SIR2 遺伝子のPCR増幅。 SIR2 遺伝子を増幅する高忠実度PCR反応の産物を、1%アガロースゲル(臭化エチジウム)で可視化した。重複反応は、酵母gDNAをテンプレート(+)として使用して行い、テンプレートコントロールなし(-)と比較した。予想されるアンプリコンサイズは2.469 kbです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ゲル電気泳動によるpRS315ベクターの可視化。複製精製プラスミド反応を1%アガロースゲル(臭化エチジウム)で行い、可視化した。pRS315 ベクトルのサイズは 6.018 kb です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ゲル電気泳動による pRS315-SIR2 ベクターのスクリーニング pRS315-SIR2 ベクターを含む潜在的な形質転換体をHindIIIおよびSacIIで消化し、1%のアガロースゲル(臭化エチジウム)で視覚化した。ベクターの作成に成功すると、バンドは 5.963 kb (pRS315 バックボーン) と 2.461 kb (SIR2 遺伝子) で生成されます。2 つの潜在的な変換物質を空のベクトル コントロールと比較しました。変換#1は 、pRS315-SIR2 ベクターで想定されるパターンを示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:pRS315-SIR2ベクターは、野生型酵母バックグラウンドでSIR2コピー数を増加させます。野生型の遺伝的背景に存在するSIR2コピーの数は、定量的PCRによって決定した。値は、ACT1を内部制御44として選択した2-ΔΔCt法を用いて計算した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: atg1Δ+pRS315-SIR2の時系列の寿命 。CLSは、生存コロニー形成ユニットの数を時間の関数として定量することによって求めた。酵母の老化培養物を500細胞/プレートに希釈し、イメージング前に30°Cで72時間増殖させた(A)。データを 3 日目のタイム ポイントに正規化し、視覚化用にプロットした (B) 。EV は空のベクトル (挿入なし pRS315) であり、SIR2O/E には挿入(pRS315-SIR2)が含まれています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| コンポーネント | 最終濃度 |
| ヌクレアーゼフリー水 | Q.S.から最終版まで |
| バッファー | 1X |
| dNTPs(コンク:10mM) | 200uM |
| フォワードプライマー(コンク:10μM) | 0.5μM |
| リバースプライマー(コンク:10μM) | 0.5μM |
| テンプレート gDNA | 100-200ng |
| HFポリメラーゼ | 1単位/50μL PCR |
表1:PCR反応成分。
| ステップ | 温度 | 時間 |
| 初期変性 | 98°C | 2分 |
| サイクリング | 98°C | 30 代 |
| (35サイクル) | 53~60°C(プライマー固有) | 30 代 |
| 72°C | kB あたり 30 秒 | |
| 最終拡張 | 72°C | 5-10m |
| 保持 | 10°C | 無期限 |
表2:PCRサイクリング条件
| ひずみ： | 親： | プロイディ: | ||
| MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315 (LEU ベクター) | BY4741 | 半数 | ||
| MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315-SIR2 O/E (LEU ベクター) | BY4741 | 半数 | ||
| MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315 空ベクトル (LEU ベクター) | BY4741 | 半数 | ||
| MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315-SIR2 O/E (LEU ベクター) | BY4741 | 半数 | ||
表3:使用する株。
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Discussion
老化の遺伝学を解明することは困難な課題であり、存在する複雑な相互作用に関する重要な洞察を得ることができるさらなる研究の機会が多い。酵母45,46,46のヌル株の研究のための機能喪失変異体の迅速な生成を可能にする多くの方法がある。この方法は、過剰発現サプレッサー研究のためにpRS315ベクター上の遺伝子を同定し、クローン化するための簡単なアプローチを提示する。このアプローチの利点の1つは、安定したベクターからの中程度の過剰発現を可能にし、染色体積分47の使用から生じる可能性のある予期せぬ課題を回避できることである。このアプローチは、科学的キャリアの様々なレベルでの研究者の採用を奨励する方法で提示され、この出版物の著者の多くは、彼らの教育の構成要素として推定サプレッサーの同定とクローニングを通じて貢献しています。
本研究では、Saccharomycesゲノムデータベースに組み込まれた豊富なデータを使用して、所望の表現型(この場合は遺伝的リンク)を、変化した時系列寿命に関連付ける方法を示す。我々は、短時間のオートファジー欠損変異体atg1ΔのCLSに対する中程度の過剰発現の効果を試験するために、pRS315ベクターにSIR2をクローン化した。17日間の老化タイムコースを通して、オートファジー変異体のCLSに対する効果はなく、野生型の背景に見られるより加速的なCLSはなかった。これは、SIR2の控えめなコピー数増加がatg1Δ変異体バックグラウンドのCLSに影響を及ぼさないと解釈することができる。ATG1はオートファジーを誘導するために必要な転写因子であるため、我々の結論はオートファジー経路の開始に限定される。さらに、私たちの野生型遺伝的背景におけるCLSの増加は見当たらず、おそらくSIR2のコピー数を増やす表現型を拡張するCLSは、特定の遺伝的背景に特異的であり、ユビキタスではないことを示唆している。
このプロトコル内の重要なステップには、クローンを作成するためのSIR2コンストラクトの適切な設計と、ライゲーションを最適化するための適切な条件が含まれます。これらのステップのトラブルシューティングはCLSアッセイを介して特徴付けのために遺伝子をクローン化するために必要な場合があります。このアプローチの1つの制限は、プラスミドを保持し、細胞周期に再び入ることができる細胞を選択することです。これはフィットネスのマーカーですが、老化表現型を解剖するための補完的なアプローチを使用したフォローアップ研究には不可欠です。これには、重要な色素染色による細胞生存率の定量化、ならびにプラスミド保持に依存しないアプローチが含まれる。老化した細胞の成長の定量化または複製寿命48、49、50,49,50の特性化を通じてCLSのさらなる特徴付けを実証する優れた方法がある。さらに、我々のアプローチは、非致死的な相互作用の同定に限定され、致死的な表現型をもたらす遺伝子のクローン化に成功した遺伝子のクローン化に失敗した試みを区別することは困難であろう。
我々のアプローチは、さらなる研究のための遺伝子推定遺伝的相互作用の同定に有用である。これは簡単で簡単で、これまでこのアプローチを使用してSIR2、AIF1、UBI4、MDH1をクローンMDH1化し、これらの各構成体を使用して研究を進めています。 SIR2 AIF1 UBI4この手法は、この研究のプロトコルの概要に従うことによって、任意の数の遺伝的相互作用を特徴付けるために適用することができる。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
ジェームズ・T・アーノーネは、ウィリアム・パターソン大学の2017年と2018年の組換えDNA技術コースの学生の支援を認めたいが、その努力は著者のしきい値を超えなかった:クリストファー・アンディーノ、フアン・ボテロ、ジョセフィーヌ・ボザン、ブレンダ・カルパ、ブレンダ・キューバズ、ヘッドラブ・エッセル・ダッセル、ウェイン・コ、ネルソン・メヒア、ヘクター・モットーラ、ラビア・ナズ、アブドゥッラー・オデ、パール・パグンタラン、ダニエル・ラザエ、ガブリエラ・レクター、アイーダ・ショノ、マシュー・ソー。あなたは偉大な科学者であり、私は皆さんがいなくて寂しいです!
著者らは、ウィリアム・パターソン大学の指導研究技術の支援(グレッグ・マティソン、ピーター・カンナロッツィ、ロブ・マイヤー、ダンテ・ポルテラ、ヘンリー・ハイニッシュ)の貴重な支援を認めたいと考えています。著者らはまた、ARTサポートのためのプロボストのオフィス、学部長と科学と健康の大学研究センターは、この仕事のサポート、およびこのプロジェクトをサポートするための生物学部門を認めたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
| SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
| Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |
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