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Genetics

सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में कालक्रम जीवनकाल को विनियमित करने वाले आनुवंशिक लिंक के लक्षण वर्णन के लिए एक दमन स्क्रीन

Published: September 17, 2020 doi: 10.3791/61506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, William Paterson University

Summary

यहां सैकरोमाइसेस सेरेविसियामें बढ़ी हुई कॉपी नंबर दबाने वाले स्क्रीन के माध्यम से आनुवंशिक बातचीत की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल है । यह विधि शोधकर्ताओं को अल्पकालिक खमीर म्यूटेंट में दबाने वालों की पहचान करने, क्लोन करने और परीक्षण करने की अनुमति देती है। हम ऑटोफैगी नल उत्परिवर्ती में उम्र पर SIR2 की कॉपी संख्या में वृद्धि के प्रभाव का परीक्षण करते हैं।

Abstract

उम्र बढ़ने से एक जीव की सामान्य जैविक प्रक्रियाओं का समय निर्भर गिरावट है जो मृत्यु की संभावना को बढ़ाता है। कई आनुवंशिक कारक सामान्य उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में परिवर्तन में योगदान देते हैं। ये कारक जटिल तरीकों से छेड़छाड़ करते हैं, जैसा कि कई जीवों में पहचाने गए और संरक्षित दस्तावेज लिंक के धन से पता चलता है। इनमें से अधिकांश अध्ययन नुकसान-कार्य, नल म्यूटेंट पर ध्यान केंद्रित करते हैं जो एक साथ कई जीनों की तेजी से जांच करने की अनुमति देते हैं। बहुत कम काम है जो इस प्रक्रिया में जीन की अधिक एक्सप्रेशन की भूमिका की विशेषता पर केंद्रित है। वर्तमान कार्य में, हम कई आनुवंशिक पृष्ठभूमि में देखे गए अल्पकालिक कालक्रम जीवन कालण फेनोटाइप के दमन में अध्ययन के लिए नवोदित खमीर, सैकरोमाइसेस सेर्विसियामें जीन की पहचान और क्लोन करने के लिए एक सीधी पद्धति प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकार की पृष्ठभूमि और विभिन्न अकादमिक चरणों में शोधकर्ताओं के लिए सुलभ होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। SIR2 जीन, जो एक हिस्टोन deacetylase के लिए कोड, pRS315 वेक्टर में क्लोनिंग के लिए चुना गया था, के रूप में वहां कालक्रम उम्र पर इसके प्रभाव पर परस्पर विरोधी रिपोर्ट किया गया है । SIR2 भी ऑटोफैगी में एक भूमिका निभाता है, जो परिणाम जब प्रतिलेखन कारक ATG1सहित कई जीन के हटाने के माध्यम से बाधित । सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम SIR2 जीन क्लोन करने के लिए छोटा उम्र की कमी atg1 म्यूटेंट की छोटा उम्र फेनोटाइप विशेषता पर एक दमन स्क्रीन प्रदर्शन और यह एक अंयथा आइसोजेनिक, जंगली प्रकार आनुवंशिक पृष्ठभूमि से तुलना करें ।

Introduction

उम्र बढ़ने असंख्य जैविक प्रक्रियाओं में अखंडता का समय निर्भर नुकसान है जो अंततः संगठित मृत्यु की संभावना को बढ़ाता है। उम्र बढ़ने सभी प्रजातियों के लिए लगभग अपरिहार्य है। सेलुलर स्तर पर कई अच्छी तरह से विशेषता वाली पहचान हैं जो उम्र बढ़ने से जुड़ी होती हैं, जिनमें शामिल हैं: जीनोमिक अस्थिरता, एपिजेनेटिक परिवर्तन, हानि-प्रोटेओस्टेसिस, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, नियंत्रणमुक्त पोषक तत्व संवेदन, सेलुलर सेन्सेंस, और टेलोमेरे उदासीनता1,,2। खमीर जैसे एकल कोशिकीय जीवों में, इससे प्रतिकृति क्षमता और कालक्रम जीवन काल3,,4में कमी आती है। ये सेलुलर परिवर्तन मनुष्यों की तरह अधिक जटिल जीवों में प्रकट होते हैं, जैसे कि कैंसर, हृदय विफलता, न्यूरोडिजेनरेशन, मधुमेह और ऑस्टियोपोरोसिस5,,6,,7शामिल हैं। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को चित्रित करने वाली कई जटिलताओं के,बावजूद, व्यापक रूप से भिन्न जीवों8,9,10में इस प्रक्रिया को अंतर्निहित इन आणविक पहचान का संरक्षण है।, वृद्धावस्था के दौरान इन रास्तों में परिवर्तन की पहचान करने से यह अहसास हुआ कि जीवनशैली में बदलाव के माध्यम से उनमें हेरफेर किया जा सकता है - आहार प्रतिबंध कई जीवों में उम्र बढ़ाने के लिए दिखाया गया है11. ये रास्ते जटिल तरीकों से एक-दूसरे और कई अन्य रास्तों के साथ एकाग्र और एक दूसरे को एक दूसरे से छेड़छाड़ करते हैं । इन बातचीतों की स्पष्टता और लक्षण वर्णन 12 , 13,14 ,,1414उम्र और स्वास्थ्य को लम्बा करने के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेपों की क्षमता प्रदान करता है ।13

वृद्धावस्था के आणविक आधार का संरक्षण सरल मॉडल जीवों के उपयोग के माध्यम से प्रक्रिया में अंतर्निहित आनुवंशिक बातचीत के कार्यात्मक विच्छेदन के लिए अनुमति देता है - जिसमें नवोदित खमीर, सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई15,16शामिल हैं । नवोदित खमीर द्वारा मॉडलिंग उम्र बढ़ने के दो स्थापित प्रकार हैं: कालक्रम उम्र बढ़ने (कालक्रम उम्र, सीएलएस) और प्रतिकृति उम्र (प्रतिकृति उम्र, आरएलएस)17। कालक्रम उम्र बढ़ने से उस समय की मात्रा मापता है जो एक कोशिका गैर-विभाजित अवस्था में जीवित रह सकती है। यह उन वृद्धावस्था के अनुरूप है जो उन कोशिकाओं में देखी जाती हैं जो अपने अधिकांश जीवन जी0में बिताती हैं , जैसे न्यूरॉन्स4. वैकल्पिक रूप से, प्रतिकृति उम्र कई बार है कि एक कोशिका थकावट से पहले विभाजित कर सकते है की संख्या है और मिटोटिक रूप से सक्रिय सेल प्रकार के लिए एक मॉडल है (जैसे, बेटी कोशिकाओं की संख्या है कि एक सेल हो सकता है)18।

इस विधि का समग्र लक्ष्य एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करना है जो एस सेरेविसियाका उपयोग करके एजिंग की आनुवंशिकी के कार्यात्मक विच्छेदन की अनुमति देता है। हालांकि कई शोधकर्ताओं द्वारा किए गए कई उत्कृष्ट अध्ययन हुए हैं जो हमारी वर्तमान समझ के कारण हुए हैं, नवोदित शोधकर्ताओं के लिए अपने अकादमिक कैरियर की शुरुआत से उम्र बढ़ने के क्षेत्र में योगदान करने के लिए कई अवसर उपलब्ध हैं। हम एक स्पष्ट कार्यप्रणाली पेश करते हैं जो शोधकर्ताओं को उम्र बढ़ने के क्षेत्र को आगे बढ़ाने की अनुमति देगा। यह प्रोटोकॉल अपने स्वयं के उपन्यास परिकल्पनाओं को तैयार करने और परीक्षण करने के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करके अपने अकादमिक कैरियर में मंच की परवाह किए बिना सभी शोधकर्ताओं के लिए सुलभ होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हमारे दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह एक लागत प्रभावी तरीका है जो संस्था की परवाह किए बिना सभी शोधकर्ताओं के लिए आसानी से सुलभ है - और कुछ प्रोटोकॉल19के लिए आवश्यक महंगे, विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार की स्क्रीन को डिजाइन करने के कई अलग-अलग तरीके हैं, इस काम में उल्लिखित दृष्टिकोण विशेष रूप से गैर-आवश्यक जीन के शून्य म्यूटेंट को स्क्रीन करने के लिए उत्तरदायी है जो खमीर के आइसोजेनिक जंगली-प्रकार के तनाव की तुलना में कालक्रमीय जीवन काल में गंभीर कमी प्रदर्शित करते हैं।

सिद्धांत के हमारे सबूत के रूप में, हम SIR2क्लोन करते हैं, एक lysine deacetylase दोनों एक विस्तारित और एक छोटा सील्स प्रदर्शन के रूप में रिपोर्ट जब overexpressed । SIR2 अतिउपप्रयोग हाल ही में वाइनमेकिंग यीस्ट में सीएसएस बढ़ाने के लिए पाया गया था; हालांकि, कई समूहों SIR2 और CLS विस्तार के बीच कोई संबंध की सूचना दी है,विशेषता 20, 21, 22,21,के तहत अपनी भूमिका छोड़। साहित्य में इन परस्पर विरोधी रिपोर्टों के कारण, हमने इस जीन का चयन स्वतंत्र अनुसंधान जोड़ने के लिए किया ताकि कालक्रम की उम्र में SIR2 की भूमिका को स्पष्ट करने में मदद मिल सके, यदि कोई हो । इसके अतिरिक्त, एक SIR2 समरूप की प्रतिलिपि संख्या में वृद्धि एक सूत्रकृमि कृमि मॉडल प्रणाली23में उम्र का विस्तार करती है ।

ऑटोफैगी एक इंट्रासेलुलर रक्षित प्रणाली है जो प्रोटीन और ऑर्गेनेल्स जैसे साइटोसोलिक उत्पादों को लाइसोसोम24तक पहुंचाने के लिए है। ऑटोफैगी को सेलुलर होमोस्टेसिस25को बनाए रखने के लिए क्षतिग्रस्त प्रोटीन और ऑर्गेनेल्स को अपमानजनक बनाने में अपनी भूमिका के माध्यम से दीर्घायु से परिचित रूप से जोड़ा जाता है। ऑटोफैगी का प्रेरण कई जीनों की अभिव्यक्ति को आर्केस्ट्रा करने पर निर्भर करता है, और एटीजी 1 जीन को हटाने के परिणामस्वरूप नवोदित खमीर26में असामान्य रूप से कम सील्स होता है। एक प्रोटीन सेरीन/थ्रेनिन किनेज़ के लिए ATG1 कोड जो ऑटोफैगी और साइटोप्लाज्म-टू-वैक्यूल (फंगल lysosomal समकक्ष) मार्ग27,,28में वेसिकल गठन के लिए आवश्यक है। यहां, हम एक बढ़ी हुई कॉपी संख्या स्क्रीन के लिए अपनी विधि प्रस्तुत करते हैं, जो सील्स पर एक जंगली प्रकार और एक atg1-शून्य पृष्ठभूमि में बढ़ी हुई SIR2 कॉपी के प्रभाव का परीक्षण करते हैं। यह विधि मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों में कनिष्ठ शोधकर्ताओं और अनुसंधान समूहों के लिए विशेष रूप से उत्तरदायी है, जिनमें से कई विज्ञान में कम प्रतिनिधित्व समुदायों की सेवा करते हैं और सीमित संसाधन हैं।

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Protocol

1. स्क्रीनिंग के लिए संभावित आनुवंशिक बातचीत की पहचान

  1. लक्षण वर्णन के लिए आनुवंशिक पृष्ठभूमि (एस) की पहचान करें, जिसके परिणामस्वरूप सैकरोमाइसेस जीनोम डेटाबेस (एसजीडी, https://www.yeastgenome.org29,,30)का उपयोग करके सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में असामान्य रूप से छोटा कालक्रमिक जीवन काल (सील्स) होता है, जो इस जीव के लिए ज्ञात फेनोपिक जानकारी संकलित करता है।
    1. वेबपेज के शीर्ष पर विकल्पों में से फ़ंक्शन टैब का चयन करें।
    2. सभी फेनोटाइप ब्राउज़ करने के बाद फेनोटाइपका चयन करें।
    3. खमीर फेनोटाइप ओंटोलॉजी विकल्पों से विकास उपसिरिंग के लिए स्क्रॉल करें और कालक्रम की उम्रका चयन करें, जो जीवनकाल उपसिर के तहत पाया जाता है।
    4. कमके लिए क्वालीफायर का चयन करें, जो जीन की पहचान के लिए अनुमति देता है जो एक फेनोटाइप प्रदर्शित करता है जिसके परिणामस्वरूप हटाए जाने पर कालक्रम की उम्र में कमी आती है। इस प्रूफ-ऑफ-मेथड के लिए atg111 का चयन किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक अल्पकालिक सील्स फेनोटाइप होता है और ऑटोफैगी26के लिए बाधित होता है।
  2. आंशिक बातचीत के लिए स्क्रीन करने के लिए लक्ष्य जीन (ओं) की पहचान करें जो फेनोटाइप को दबा सकता है, रिपोर्ट या भविष्यवाणी की गई ऑन्टोलॉजी विशेषताओं के आधार पर, भाग 1.2 में पहचाने गए उत्परिवर्ती के। ऊपर के चरणों 1.1.1-1.1.4 में पाए गए फेनोटाइप खोज को दोहराएं, जीन के लिए क्वेरी, जिसके परिणामस्वरूप जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में अधिक लंबे समय तक सील्स होता है। एसआईआर2 का चयन सील्स फेनोटाइप के आधार पर किया गया और ऑटोफैगी31,32के साथ बातचीत की सूचना दी गई ।

2. रिएजेंट्स तैयार करें

नोट: जब तक अन्यथा निर्दिष्ट ऑटोक्लेव प्रत्येक समाधान को उपयोग से पहले स्टरलाइज करने के लिए 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर नहीं।

  1. YPAD तरल मीडिया: डबल आसुत पानी के प्रति लीटर 1% खमीर निकालने, 2% पेप्टोन, 2% डेक्सट्रोस (ग्लूकोज), और 40 मिलीग्राम एडेनिन (एडेनिन सल्फेट निर्जलीकरण के रूप में) जोड़ें। एक चुंबकीय उभारने के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. पौंड तरल मीडिया: ट्राइप्टोन (10 ग्राम), खमीर निकालने (5 ग्राम), और सोडियम क्लोराइड (10 ग्राम) प्रति लीटर डबल आसुत पानी जोड़ें। एक चुंबकीय उभारने के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. डबल डिस्टिल्ड पानी में 1000x (100 मिलीग्राम/एमएल) एम्पिसिलिन स्टॉक तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं और स्टरलाइज को फ़िल्टर करें।
  4. सिंथेटिक पूरा - Leucine (अनुसूचित जाति-एलआईयू) तरल मीडिया: खमीर नाइट्रोजन बेस w/o अमीनो एसिड, 2% ग्लूकोज, अनुसूचित जाति के 1.92 ग्राम-एलआईयू ड्रॉपआउट मिश्रण, 5 ग्राम अमोनियम सल्फेट प्रति लीटर डबल आसुत पानी जोड़ें। एक चुंबकीय उभारने के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. ते बफर: डबल आसुत पानी के साथ समाधान में मिक्स ट्रिस (10 एमएम अंतिम एकाग्रता), ईडीटीए (1 mm अंतिम एकाग्रता) । एक चुंबकीय उभारने के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  6. डबल डिस्टिल्ड पानी के साथ घोल में 50% खूंटी 3350 तैयार करें। एक चुंबकीय उभारने के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  7. डबल डिस्टिल्ड पानी के साथ 1 एम और 100 एमएम लिथियम एसीटेट सॉल्यूशन तैयार करें। एक चुंबकीय उभारने के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: ठोस आगर प्लेटें बनाने के लिए ऑटोक्लेविंग से पहले 2.1 और 2.2 में तैयार मीडिया को 20 ग्राम आगर (प्रति लीटर डबल आसुत पानी के साथ) जोड़ें। यदि एम्पीसिलिन प्लेटें तैयार करने के बाद यह लगभग 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया है ऊपर 2.2 में मीडिया के लिए एम्पीसिलिन के 1mL जोड़ें। बाँझ प्लेटों में डालो और उपयोग करने से पहले 48-72 घंटे के लिए सेट करने के लिए अनुमति देते हैं । लंबे भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें स्टोर करें।

3. pRS315 वेक्टर में SIR2 क्लोन करने के लिए क्लोनिंग रणनीति डिजाइन

  1. PRS315 वेक्टर में क्लोनिंग के लिए SIR2 जीन बढ़ाना करने के लिए पीसीआर प्राइमर डिजाइन करें।
    1. डिजाइन प्राइमर मैन्युअल रूप से 21-22 न्यूक्लियोटाइड पूरकता के लिए इंटरजेनिक क्षेत्रों के ऊपर और सिर2के नीचे । सुनिश्चित करें कि एमआरएनए के अअनुवादित क्षेत्रों के साथ-साथ पूरे जीन को उपलब्ध डेटासेट33, 34,से उन विशेषताओं का मानचित्रण करके क्लोन कियाजाताहै।
    2. सुनिश्चित करें कि पीसीआर प्राइमर डिजाइन के परिणाम आगे और रिवर्स प्राइमर हैं जो 53 डिग्री सेल्सियस से ऊपर और 60 डिग्री सेल्सियस से नीचे पिघलने वाले तापमान (टीएम) हैं।
      नोट: आदर्श रूप में, दोनों प्राइमर में एक दूसरे के करीब टीएम होना चाहिए क्योंकि अनुक्रम 40-50% के बीच की अनुमानित जीसी सामग्री के साथ, पूरे अनुक्रम में डीन्यूक्लियोटाइड दोहराता है और जीसी और एटी वितरण को संतुलित करने से बचना सुनिश्चित करेगा।
    3. पीसीआर प्राइमर के डिजाइन के बाद जो क्लोनिंग के लिए एम्प्लिकॉन की पीढ़ी के लिए अनुमति देगा, प्रतिबंध एंजाइम पाचन (आरईडी) प्रत्येक प्राइमर के 5 ' अंत में लक्षित साइटों को जोड़ते हैं जो प्लाज्मिड-क्लोनिंग वेक्टर के लिए संगत हैं। इस विधि में, एक हिंदआईआई प्रतिबंध एंजाइम पाचन साइट (5'-AAGCTT-3') को अपस्ट्रीम में जोड़ा जाता है, फॉरवर्ड प्राइमर और एक सैसी प्रतिबंध एंजाइम पाचन साइट (5'-CCGCGG-3') को डाउनस्ट्रीम, रिवर्स प्राइमर में जोड़ा जाता है।
      नोट: SacII और HindIII साइटों के उपयोग के लिए आवश्यक है कि प्रत्येक अंतःक्रिया के लिए आम सहमति कटौती साइट लक्ष्य जीन में मौजूद नहीं है । यदि या तो एंजाइम लक्ष्य जीन के भीतर लक्ष्य, वैकल्पिक प्रतिबंध एंजाइमों चुना जाना चाहिए । ऐसे कई हैं जो पीआरएस 315 वेक्टर पर पॉलीलिंकर क्षेत्र के साथ संगत हैं।
    4. अंत में, प्रतिबंध एंजाइम को एम्प्लिकॉन को बांधने और पचाने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक प्राइमर के 5 ' अंत में चार न्यूक्लियोटाइड (5'-एनएनएन-3') अनुक्रम ओवरहांग जोड़ें। एक बार प्राइमर डिजाइन किए जाने के बाद, SIR2 जीन क्लोनिंग के उपयोग के लिए वाणिज्यिक रूप से संश्लेषित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स है।
    5. पीसीआर प्राइमर का रीसेपन: 4 मिनट के लिए अधिकतम गति से टेबलटॉप माइक्रोफ्यूज का उपयोग करके पीसीआर प्राइमर को सेंट्रलाइज करें। 100 माइक्रोन का स्टॉक एकाग्रता बनाने के लिए टीई समाधान जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक एकाग्रता स्टोर करें और पीसीआर अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए 1/10 पतला करें।
      नोट: 100 माइक्रोन स्टॉक बनाने के लिए, प्राइमर को बाँझ ते बफर की मात्रा में भंग करें जो ते के माइक्रोलीटर का उपयोग करके प्राइमर ट्यूब में nmoles की मात्रा 10x है। उदाहरण के लिए, यदि ट्यूब में प्राइमर के 15.6 एनएमोल होते हैं, तो ते बफर के 156 माइक्रोन जोड़ें।
  2. SIR2 क्लोनिंग निर्माण की पीसीआर प्रवर्धन के लिए जंगली प्रकार खमीर gDNA अलग।
    नोट: खमीर gDNA को अलग करने के लिए कई उच्च गुणवत्ता वाले विकल्प व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। एक किट का उपयोग जिसमें फंगल सेल दीवार का पाचन शामिल है जिसमें zymolyase के परिणामस्वरूप बेहतर गुणवत्ता वाले gDNA (उच्च उपज, कम अशुद्धियों) में परिणाम होते हैं। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल लगातार उच्च एकाग्रता और शुद्धता देता है। एक किट का विवरण हम अनुशंसा सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।
    1. YPAD जैसे समृद्ध मीडिया में पोस्ट-लॉग चरण के लिए 48-72 घंटे के लिए जंगली प्रकार खमीर की 5 एमएल संस्कृति बढ़ाएं। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए और gt;800 x g पर खमीर कोशिकाओं गोली, विकास मीडिया को दूर करने, और zymolyase पाचन बफर के १२० माइक्रोन में resuspend zymolyase (2 इकाइयों एंजाइम/μL) के 5 μL के साथ पूरक । 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर भंवर और इनक्यूबेट द्वारा नमूना मिलाएं।
    2. एक च्रोट्रोपिक लाइसिस बफर (जैसे, ग्वानिउद्दीनियम क्लोराइड), क्लोरोफॉर्म के 250 माइक्रोन, और 60 एस के लिए नमूने भंवर के 120 μL जोड़ें।
    3. 2 मिनट के लिए 8,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और एक बाँझ संग्रह ट्यूब में एक शुद्धि स्तंभ में सुपरनैंट स्थानांतरित करें।
    4. 60 एस के लिए 8,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और प्रवाह को त्यागें। जीडीएनए कॉलम मैट्रिक्स से बंधे होंगे।
    5. कॉलम को एक इथेनॉल-आधारित वॉश बफर के 300 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं, ऊपर से अपकेंद्रित्र चरण (3.2.4) को दोहराते हुए। प्रत्येक स्पिन के बाद प्रवाह को त्यागें। कॉलम को 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, ते बफर के 60 माइक्रोल जोड़ें, और 60 एस के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। फ्लैश डीएनए को elute करने के लिए 30 एस के लिए नमूना स्पिन ।
      नोट: नमूने में डीएनए की एकाग्रता (260nm पर अवशोषण) और गुणवत्ता (अवशोषण 260nm/280nm) का निर्धारण करें । एक विशिष्ट उपज 100-200 एनजी/260nm/280nm पर अवशोषण अनुपात के साथ gDNA के μL के रूप में संभव के रूप में १.८ के करीब होगा ।
  3. क्लोनिंग के लिए पीआरएस 315 प्लाज्मिड वेक्टर को बढ़ाना और अलग करना।
    नोट: प्लाज्मिड वैक्टर के शुद्धिकरण के लिए कई उच्च गुणवत्ता वाले विकल्प व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस चरण के लिए सिलिका-आधारित कॉलम रसायन शास्त्र की सिफारिश की जाती है। नीचे दिए गए बदलावों के कारण सबसे ज्यादा एकाग्रता और शुद्धता हुई है । विवरण सामग्री की तालिकामें पाए जाते हैं ।
    1. एलबी + एम्पिसिलिन (80 μg/mL) मीडिया में रातोंरात पीआरएस 315 वेक्टर युक्त ई. कोलाई की संस्कृति का एक 5 एमएल बढ़ें। आरटी (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर 2 मिनट के लिए 8,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा संस्कृति को गोली मारें।
    2. आरएनएज़ ए (100 माइक्रोजी/एमएल) के साथ ते बफर के 250 माइक्रोल में पैलेट बैक्टीरियल कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं के कोई झुरमुट नहीं रहते हैं।
    3. लाइसिस बफर के 250 माइक्रोन जोड़ें और ट्यूब को 6-8 बार उलटा करके मिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट। लाइसिस को 5 मिनट से अधिक समय तक आगे बढ़ने की अनुमति न दें - थोड़ा कम बेहतर है।
    4. बेअसर बफर के 350 माइक्रोन जोड़ें और 10 बार ट्यूब को उलटा करके तुरंत और अच्छी तरह से मिलाएं। 8,000 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज
    5. ऊपर से सुपरनेट को पिपिंग करके सिलिका स्पिन कॉलम में सावधानी से स्थानांतरित करें। 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    6. स्टेप 3.3.5 के रूप में एक उच्च नमक धोने बफर और अपकेंद्रित्र के 500 μL जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। अवशिष्ट लवण को हटाने के लिए, अवशिष्ट लवण को हटाने के लिए, और चरण 3.3.5 के रूप में अपकेंद्रित्र के लिए, एक इथेनॉल आधारित वॉश बफर के 750 माइक्रोन जोड़कर डीएनए बाध्यकारी स्पिन कॉलम धोएं।
    7. अवशिष्ट वॉश बफर को हटाने के लिए अतिरिक्त 2 मिनट के लिए प्रवाह और अपकेंद्रित्र को छोड़ दें। स्पिन कॉलम को एक साफ, लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। डीएनए को elute करने के लिए, स्पिन कॉलम के केंद्र में ते बफर के 20 माइक्रोन जोड़ें, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट, और 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र & 8,000 x g.
    8. डीएनए की मात्रा (260एनएम पर अवशोषण) और डीएनए की गुणवत्ता (अवशोषण 260 एनएम/280 एनएम) निर्धारित करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें। एक विशिष्ट उपज 1-2 μg/μL होगी ।
  4. उम्मीदवार जीन, SIR2, जंगली प्रकार जीनोमिक डीएनए से पीसीआर प्रवर्धन
    1. क्लोनिंग के लिए उपयुक्त एम्प्लिकॉन का उत्पादन करने के लिए, अनुक्रम में उत्परिवर्तन की गैरइरादतन पीढ़ी से बचने के लिए एक उच्च-निष्ठा (एचएफ) पीसीआर बहुलक का उपयोग करें।
      नोट: कई अलग-अलग उच्च निष्ठा पीसीआर विकल्प व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। पीसीआर प्रतिक्रिया स्थितियों के अनुकूलन को सुविधाजनक बनाने के लिए, दो-बफर संयोजन का उपयोग करें: एक जो एक मानक एचएफ बफर है और एक उच्च जीसी और जटिल एम्प्लिकॉन के लिए अनुकूलित है। विवरण सामग्री की तालिकामें पाया जा सकता है ।
    2. पीसीआर टेबल 1 में वर्णित क्लोनिंग के लिए एसआईआर 2 निर्माण को बढ़ाती है।
      नोट: क्लोनिंग चरणों में सफलता को अधिकतम करने के लिए, कई समान 50 माइक्रोन को पीसीआर कॉलम द्वारा स्थापित और केंद्रित किया जा सकता है। एक नहीं GDNA टेम्पलेट नियंत्रण प्रतिक्रिया (नकारात्मक नियंत्रण) स्थापित करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    3. टेबल 2 में वर्णित पीसीआर साइकिलिंग की स्थिति स्थापित करें।
      नोट: विभिन्न प्राइमर जोड़े अपने एनीलिंग तापमान पर भिन्न होते हैं और विभिन्न पॉलीमरेस विभिन्न गति से कार्य करते हैं। चयनित एंजाइम और डिजाइन के रूप में प्राइमर संयोजन के विनिर्देशों के आधार पर प्रवर्धन शर्तों को अनुकूलित करना सुनिश्चित करें।
    4. पीसीआर प्रतिक्रिया की कल्पना करके पीसीआर प्रतिक्रिया की सफलता को सत्यापित करें, जो 1.0% TAE-agarose gel (दृश्य के लिए 0.5 μg/mL ethidium ब्रोमाइड के साथ) पर डीएनए टुकड़े के लगभग 2.5 केबी का उत्पादन करेगा।
  5. पाचन और उम्मीदवार जीन, SIR2के बंधन, pRS315 प्लाज्मिड वेक्टर में ।
    1. वेक्टर और डालने के प्रतिबंध पाचन करें: 625 एनजी डीएनए (या तो वेक्टर या डालें), क्यू एस पानी अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा को 50 माइक्रोल, 5 माइक्रोन बफर, 1 माइक्रोल सैकि, और 1 माइक्रोन हिंदआईआई में लाने के लिए। 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिबंध पाचन, इसके बाद एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के बाद। अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले डाइजेस्ट को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. वांछित प्लाज्मिड बनाने के लिए 15 माइक्रोन लिगेशन प्रतिक्रिया सेट करें: बाँझ पानी के 6 माइक्रोन, 2 माइक्रोन पचाने वाले वेक्टर (50 एनजी डीएनए), 4 माइक्रोन डाइजेस्ट डालने (100 एनजी डीएनए), 2 माइक्रोल टी 4 रिएक्शन बफर, और टी 4 डीएनए लिगाज़ के 1 माइक्रोल। 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर लिगेशन प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें, इसके बाद एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस का समय दिया जाता है।
      नोट: एक नो डालने नियंत्रण सेट करें, डालने के बदले बाँझ पानी (10 माइक्रोन कुल) के अतिरिक्त 4 माइक्रोन प्रतिस्थापन करें।
    3. लिगेशन प्रतिक्रियाओं को ई. कोलाईमें बदलें ।
      नोट: सक्षम कोशिकाओं के लिए कई विकल्प उपलब्ध हैं जो उपलब्ध हैं। यह प्रोटोकॉल रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करता है जो उपयोग से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होते हैं।
      1. बर्फ पर जमे हुए, सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं की एक ५० μL ट्यूब गल जब तक बस गल और तुरंत लिगेशन प्रतिक्रिया के 15 μL जोड़ें । ट्यूब को कई बार झटका दें। तुरंत ट्यूबों को बर्फ में वापस करें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      2. गर्मी-बिल्कुल 42 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 20 एस के लिए कोशिकाओं को झटका, और तुरंत एक 2 मिनट इनक्यूबेशन के लिए बर्फ के लिए ट्यूबों वापस। प्रत्येक परिवर्तन प्रतिक्रिया में कमरे के तापमान वसूली मीडिया (जैसे, एसओसी या एलबी) के 450 माइक्रोन जोड़ें और मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      3. प्रत्येक परिवर्तन प्रतिक्रिया के लिए, कोशिकाओं का 1:10 कमजोर पड़ना है। बाँझ तकनीक का उपयोग करना, बिना पतला कोशिकाओं के १५० μL प्लेट और LB + (८० μg/mL) एम्पिसिलिन प्लेट३५ पर1:10कमजोर पड़ने । रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  6. ओवरएक्सप्रेशन वेक्टर के लिए स्क्रीन संभावित ट्रांसफॉर्मेंट।
    1. बाँझ तकनीक का उपयोग करके, 5 एमएल एलबी + (80 μg/l) एम्पिसिलिन में वृद्धि हुई है कि संभावित ट्रांसफॉर्मेंट टीका और रातोंरात हो जाना। ऊपर धारा 3.3.1-3.3.7 में उल्लिखित प्रक्रिया के बाद, प्लाज्मिड्स को हर संभावित ट्रांसफॉर्मेंट और स्क्रीन के सफल एकीकरण के लिए हर संभावित ट्रांसफॉर्मेंट और स्क्रीन से अलग करें, जिसके बाद 1.0% TAE-agaroseg gel पर जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (विज़ुअलाइज़ेशन के लिए 0.5 μg/mL ethidium ब्रोमाइड) पर जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पीछा किया जाता है।

4. atg1 और जंगली प्रकार खमीर उपभेदों में वेक्टर को बदलना

नोट: यह एक संशोधित लिथियम एसीटेट परिवर्तन प्रोटोकॉल36का उपयोग करके किया जाता है।

  1. गोली 15 एमएल जंगली प्रकार और atg1-शून्यखमीर कोशिकाओं को YPAD मीडिया में रात भर में उगाया मध्य लॉग चरण (O.D. 600nm = 0.4-0.9) के लिए विकास की 3 मिनट के लिए वृद्धि के लिए और अधिक से अधिक ८०० एक्स ग्राम कमरे के तापमान पर ।
  2. सुपरनेट को डिकेंट करें, बाँझ डीडीएच2ओ के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें और सामग्री को 1.7 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 3 मिनट और जीटी; 800 x ग्राम के लिए कोशिकाओं को गोली दें।
  3. सुपरनेट निकालें और कोमल पाइपटिंग के साथ 100 एमएम लिथियम एसीटेट के 250 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को प्रत्येक परिवर्तन के लिए अलग माइक्रोफ्यूज ट्यूब में विभाजित करें जो आप प्रदर्शन करेंगे। प्रति परिवर्तन सेल-लिथियम एसीटेट मिश्रण के 50 माइक्रोन का उपयोग करें।
  4. एक परिवर्तन मिश्रण की स्थापना की। प्रत्येक परिवर्तन में जोड़ें: 50% PEG3350 के 240 माइक्रोन, 1.0 मीटर लिथियम एसीटेट के 36 माइक्रोन, और सामन शुक्राणु (या अन्य वाहक) डीएनए के 5 माइक्रोन, 5 मिनट के लिए उबला हुआ और बर्फ पर।
    नोट: खूंटी बहुत चिपचिपा है। पिपेट और उपाय सावधानी से करें। आगे बढ़ने से पहले प्रत्येक घटक के अलावा के बाद पाइपिंग करके मिलाएं।
  5. किए गए प्रत्येक परिवर्तन के लिए उपयुक्त प्लाज्मिड के 5 माइक्रोन जोड़ें। भंवर प्रत्येक ट्यूब अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए। 45 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। 10 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर हीट शॉक नमूने।
  6. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के x g लिए पैलेट कोशिकाएं, सावधानी से परिवर्तन मिश्रण को हटा दें, और ऊपर स्पिन को दोहराकर, ध्यान से पानी निकालकर, और बाँझ डीडीएच2ओ के 200 माइक्रोन में अपने नमूनों को फिर से निलंबित करके बाँझ डीडीएच2ओ के 300 माइक्रोन में नमूनों को फिर से निलंबित करें।
  7. खमीर के प्रत्येक परिवर्तनित तनाव के लिए 1/10 और 1/100 कमजोर पड़ने की स्थापना की ।
  8. प्लास्मिड के लिए चयन करने के लिए एससी-ल्यूसिन प्लेटों पर प्रत्येक नमूने से बाँझ तकनीक प्लेट 150 माइक्रोन का उपयोग करना। कोशिकाओं को समान रूप से और समान रूप से फैलाएं और प्लेट को 48-72 घंटे तक बढ़ने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर उलटा और इनक्यूबेटिंग करने से पहले सूखने दें।
    नोट: एक बार उपयुक्त तनाव उत्पन्न होने के बाद, इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर 25% ग्लाइसरोल में लंबी अवधि में संग्रहीत किया जा सकता है। वर्तमान कॉपी नंबर की मात्रा क्यूपीसीआर, आरएनए-फिश, या एक अन्य उपयुक्त उपाय37,,38सहित कई पद्धतियों द्वारा निर्धारित की जा सकती है।

5. छोटा सील्स फेनोटाइप दमन के लिए परीक्षण करने के लिए कालक्रम जीवन काल का निर्धारण करें

  1. 39 के कार्य के रूप में रहने वाली कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की संख्या निर्धारित करके, कम रहते हुए खमीर, atg11ant उत्परिवर्ती में सील्स परख्यातदबाने वाले के अधिकएक्सप्रेशन के प्रभाव का परीक्षण करें।
    नोट: प्रयोग के इस हिस्से को उचित नियंत्रणों के साथ स्थापित करना आवश्यक है। एक विशिष्ट प्रयोग खाली वेक्टर के साथ खमीर के जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) तनाव की तुलना करेगा, दबाने वाले वेक्टर के साथ डब्ल्यूटीई, खाली वेक्टर के साथ हटाने उत्परिवर्ती, और दमनकर्ता वेक्टर के साथ हटाने उत्परिवर्ती।
    1. पढ़ाई के लिए तनाव की एक ही कॉलोनी लें और उसे एससी-एलआईयू मीडिया में टीका लगा लें । मिलाते हुए के साथ, 72 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बढ़ें।
    2. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करना,40संस्कृति में मौजूद कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित करें।
    3. संस्कृति का एक aliquot पतला है, ताकि परिणाम बाँझ पानी की एक १५० μL मात्रा में कोशिकाओं की एक समान संख्या है । एससी-एलआईयू प्लेटों पर बाँझ तकनीक का उपयोग करके संस्कृति को प्लेट करें और 72 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस से आगे बढ़ें। ये प्लेटें दिन तीन बार बिंदु हैं और प्रयोग को इस समय-बिंदु तक सामान्यीकृत किया जाएगा क्योंकि 100% व्यवहार्यता39है।
      नोट: कोशिकाओं की संख्या 200-500 होनी चाहिए, विश्लेषण के लिए पर्याप्त रूप से बड़ी और गिनती के लिए एक प्रबंधनीय संख्या। इस अध्ययन में, हमने अपनी चढ़ाना मात्रा के लिए 200 कोशिकाओं का उपयोग किया।
    4. 5.1.3 में उल्लिखित नियमित एलिकोट्स और प्लेटिंग लेने, 30 डिग्री सेल्सियस पर खमीर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करना जारी रखें। इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक उपभेद अब व्यवहार्य न हों, फिर परिणामों को संकलित और विश्लेषण न करें।
      नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उपभेदों की पूरी सूची तालिका 3में पाई गई है ।

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Representative Results

चूंकि उम्र बढ़ने के दौरान SIR2 की भूमिका पर परस्पर विरोधी रिपोर्टें हैं, इसलिए हमने इस जीन को अध्ययन के लिए एटग1ए म्यूटेंट के छोटा सील्स फेनोटाइप26के संभावित दमन के रूप में चुना। SIR2 की भूमिका कुछ हद तक विवादास्पद है, सीटीएस का विस्तार करने में अपनी भूमिका पर परस्पर विरोधी रिपोर्टों के साथ, हालांकि यह स्पष्ट रूप से कम से कम एक खमीर पृष्ठभूमि में बढ़ी हुई CLS से जुड़ा हुआ है, दोनों ऑटोफैगी और mitophagy22,31,,,32,,41में एक भूमिका के साथ।

प्लाज्मिड वेक्टर की हमारी पसंद pRS315 शटल वेक्टर है, जिसका निर्माण नवोदित खमीर और बैक्टीरिया42दोनों में आनुवंशिक हेरफेर, प्रचार और रखरखाव में आसानी के लिए किया गया था। इस वेक्टर में LEU2 पोषण मार्कर, T7 और T3 प्रमोटर शामिल हैं, और सेल डिवीजन42के दौरान स्थिर मार्ग के लिए एक सेंट्रोमेरिक(CEN)वेक्टर है। माइटोटिक सेल डिवीजनों में इस वेक्टर की स्थिरता अधिक वांछनीय थी जब आइसोजेनिक वेक्टर की तुलना में जो पोषण मार्कर42से भिन्न थे। PRS315 वेक्टर भी एक स्वायत्त नकल अनुक्रम है, जो CEN के साथ संयुक्त कम रखता है, के भीतर लगातार प्लाज्मिड स्तर (और भर में) एक सेलजनसंख्या ४३।

SIR2 जीन और इसी अपस्ट्रीम (5 ' यूटीआर) और डाउनस्ट्रीम (3 ' यूटीआर) जीनोमिक क्षेत्र के डीएनए अनुक्रम३३प्राप्त किया गया था । यह सुनिश्चित करने के लिए कि लिखित जीन में प्रोटीन उत्पाद की स्थिरता और अनुवाद के लिए आवश्यक घटक यूपीआर शामिल थे, हमारी प्रारंभिक खिड़की +/-४०० बीपी थी । इस विंडो का विस्तार इस क्षेत्र के भीतर न्यूक्लियोटाइड संरचना के आधार पर +/-500bp तक हुआ, क्योंकि हमारी प्रारंभिक खिड़की के परिणामस्वरूप क्लोनिंग के लिए अनुकूल क्षेत्र नहीं था । हमने पीसीआर प्राइमर डिजाइन किए हैं जो जीन और इसी नियामक क्षेत्रों के प्रवर्धन के लिए अनुमति देते हैं, जिसमें प्रतिबंध पाचन साइटों को शामिल किया गया है और प्रत्येक प्राइमर(चित्रा 1 ए)के 5 अंत में चार-न्यूक्लियोटाइड ओवरहांग जोड़ा गया है। पीसीआर द्वारा इस क्षेत्र के सफल प्रवर्धन के परिणामस्वरूप डीएनए खंड 2.469 केबी लंबाई(चित्रा 1 बी) होता है।

SIR2 पीसीआर द्वारा परिलक्षित किया गया था, और इस प्रतिक्रिया के उत्पादों को एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा कल्पना की गई थी और नो टेम्पलेट कंट्रोल रिएक्शन(चित्र 2) कीतुलना में। SIR2 प्रवर्धन जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट के साथ दोनों गलियों में देखा गया था; दो प्रतिक्रियाओं को पूल और केंद्रित किया गया था । ई. कोलाई से पीआरएस 315 का प्लाज्मिड शुद्धिकरण किया गया था, जिसे एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस(चित्र 3)द्वारा कल्पना की गई थी। नमूनों को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था, और ट्रांसफॉर्मेंट #2 से प्लाज्मिड प्रेप क्लोनिंग के लिए चुना गया था, जिसमें 256 एनजी/माइक्रोन (ओडी260/280 = 1.87) की एकाग्रता थी।

प्लाज्मिड और डालने को हिंडिया और सैकिया के साथ पचाया गया, एक साथ लिगा किया गया, और प्रवर्धन और स्क्रीनिंग के लिए ई कोलाई में तब्दील हो गया। इन प्रतिबंध पाचन स्थलों के विकल्प के सत्यापन की आवश्यकता है कि न तो साइट क्षेत्र में मौजूद है क्लोन किया जाएगा । एक (या दोनों) साइटों की उपस्थिति के लिए SIR2 जीन क्लोन करने के लिए वैकल्पिक प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग की आवश्यकता होगी, और पीआरएस 315 पॉलीलिंकर क्षेत्र42में से चयन करने के लिए कई हैं।

हमने हिंडिया और सैकि के साथ दोहरे पाचन द्वारा डालने के उत्तेजन द्वारा पीआरएस 315-एसआईआर2 वेक्टर के सफल निर्माण के लिए ट्रांसफॉर्मेंट की जांच की और इसके बाद एगर उठे जेल(चित्रा 4)पर दृश्य ों का पालन किया। पीआरएस 315-SIR2 वेक्टर दोनों जंगली प्रकार और atg1.म्यूटेंट में तब्दील हो गया था CLS लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल उपभेदों उत्पन्न करने के लिए । PRS315 वेक्टर एक शास्त्रीय वेक्टर है जिसका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है और विशेषता है, जो इस विशेष प्रणाली के फायदों में से एक है। सापेक्ष प्रतिलिपि संख्या का निर्धारण क्यूपीसीआर द्वारा किया गया था , जैसाकिपहले37वर्णित था . इसके परिणामस्वरूप प्रति सेल प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति प्रति कॉपी संख्या में मामूली वृद्धि हुई, जो पिछली रिपोर्टों के अनुरूप४२है ।

atg1 +pRS315-SIR2 के कालक्रम की उम्र खमीर के एक आइसोजेनिक तनाव की तुलना में की गई थी जिसमें एक डालने के बजाय एक खाली वेक्टर(atg1+pRS315) होता है। एजिंग संस्कृतियों को लगातार, समकक्ष कमजोर पड़ने पर चढ़ाया गया था और इमेजिंग और क्वांटिफिकेशन(चित्र 6 ए)से पहले 30 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए उगाया गया था। इकाइयों को बनाने वाली कॉलोनियों की संख्या निर्धारित की गई थी और दिन 3 समय-बिंदु (पहले एक लिया गया) और प्लॉट(चित्रा 6B)के लिए सामान्यीकृत किया गया था। हम रिपोर्ट करते हैं कि atg1Τ पृष्ठभूमि में सील्स पर हमारे SIR2 निर्माण का कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है। इसके अतिरिक्त, हमने जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में सील्स का कोई विस्तार नहीं देखा - जहां हमारे मामूली SIR2 अतिव्यक्तता ने वास्तव में खाली वेक्टर नियंत्रण(चित्रा 6B)की तुलना में सील्स में कमी का उत्पादन किया।

Figure 1
चित्रा 1: निर्माण के डिजाइन SIR2क्लोन करने के लिए ।  जीआर2 जीन को फ्लैंक करने वाले जीनोमिक क्षेत्र का उपयोग जीन के प्रवर्धन और क्लोनिंग के लिए पीसीआर प्राइमर डिजाइन करने के लिए किया गया था । प्राइमर में इस क्षेत्र के लिए 21nt पूरकता होती है ४१९ आधार जोड़े जीन (एफपी) के ऊपर और जीन (आरपी) के ३५१ आधार जोड़े डाउनस्ट्रीम, या तो हिंदआईआई या SacII प्रतिबंध पाचन स्थल, और एक चार न्यूक्लियोटाइड ओवरहांग(ए)। पीसीआर द्वारा बनाए गए एम्पलिकन की योजनाबद्ध रूप से एसआईआर 2 जेनिक क्षेत्र की क्लोनिंग के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करके, संबंधित आकारों(बी)के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा कल्पना की गई SIR2 जीन की पीसीआर प्रवर्धन।  SIR2 जीन को बढ़ाने के लिए एक उच्च निष्ठा पीसीआर प्रतिक्रिया के उत्पादों को 1% एगर उठे जेल (एथिडियम ब्रोमाइड के साथ) पर कल्पना की गई थी। एक टेम्पलेट (+) के रूप में खमीर gDNA का उपयोग करके डुप्लिकेट प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया था और एक नो टेम्पलेट नियंत्रण (-) की तुलना में। अपेक्षित एम्प्लिकॉन का आकार 2.469 केबी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पीआरएस 315 वेक्टर का दृश्य। डुप्लिकेट शुद्ध प्लाज्मिड प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया और 1% एगर उठे जेल (एथिडियम ब्रोमाइड के साथ) पर कल्पना की गई। पीआरएस 315 वेक्टर का आकार 6.018 केबी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा pRS315-SIR2 वेक्टर के लिए स्क्रीनिंग । संभावित ट्रांसफॉर्मेंट जिनमें पीआरएस 315-SIR2 वेक्टर होते हैं, को हिंडआईआई और सैसीआईआई के साथ पचाया गया था, और फिर 1% एग्रिजैर्ड जेल (एथिडियम ब्रोमाइड के साथ) पर कल्पना की गई थी। वेक्टर के सफल निर्माण ५.९६३ केबी (pRS315 रीढ़) और २.४६१ kb (SIR2 जीन) पर एक बैंड निकलेगा । दो संभावित ट्रांसफॉर्मेंट की तुलना एक खाली वेक्टर नियंत्रण से की गई थी। ट्रांसफॉर्मेंट #1 पीआरएस 315-SIR2 वेक्टर द्वारा अपेक्षित पैटर्न प्रदर्शित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: pRS315-SIR2 वेक्टर एक जंगली प्रकार खमीर पृष्ठभूमि में SIR2 कॉपी संख्या बढ़ जाती है । जंगली प्रकार की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में मौजूद SIR2 प्रतियों की संख्या मात्रात्मक पीसीआर द्वारा निर्धारित की गई थी । मानों की गणना आंतरिक नियंत्रण44के रूप में चुने गए ACT1 के साथ2 -Τ.1सीटी विधि का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: atg11S + pRS315-SIR2के कालक्रम उम्र । सील्स समय के एक समारोह के रूप में व्यवहार्य कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या की मात्रा के परिमाणीकरण द्वारा निर्धारित किया गया था। खमीर की उम्र बढ़ने संस्कृतियों ५०० कोशिकाओं/प्लेट को पतला किया गया और इमेजिंग(ए)से पहले 30 डिग्री सेल्सियस पर ७२ घंटे के लिए उगाया गया । डेटा को तीन बार-पॉइंट पर सामान्यीकृत किया गया था और दृश्य(बी)के लिए प्लॉट किया गया था। EV खाली वेक्टर है (कोई डालने के साथ pRS315) और SIR2O/ई डालने(pRS315-SIR2)शामिल हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घटक अंतिम एकाग्रता
नाभिक मुक्त पानी Q.S. अंतिम मात्रा में
बफ़र 1X
DNTPs (conc: 10mM) 200यूएम
फॉरवर्ड प्राइमर (कॉन: 10μM) 0.5μM
रिवर्स प्राइमर (कॉन: 10μM) 0.5μM
टेम्पलेट जीडीएनए 100-200ng
एचएफ पॉलीमरेज 1 यूनिट/50μL पीसीआर

तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रिया घटक।

चरण Temp समय
प्रारंभिक डेनैचेशन 98 डिग्री सेल्सियस 2मिनट
साइकल चलाना 98 डिग्री सेल्सियस 30
(35 चक्र) 53-60 डिग्री सेल्सियस (प्राइमर विशिष्ट) 30
72 डिग्री सेल्सियस 30s प्रति केबी
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 5-10 मीटर
पकड़ 10 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल

तालिका 2: पीसीआर साइकिलिंग की स्थिति।

तनाव: जनक: प्लॉयडी:
MATa his3.1 leu2.'0 met15.0 ura3.0 + pRS315 (LEU वेक्टर) BY4741 हैप्लॉयड
MATa his3.1 leu2.आप मेट150 ura3.0 + pRS315-SIR2 O/E (LEU वेक्टर) BY4741 हैप्लॉयड
MATa his3.1 leu2.आप met150 ura3.0atg111 + pRS315 खाली वेक्टर (एलआईयू वेक्टर) BY4741 हैप्लॉयड
MATa his3.1 leu2Τ0 met150 ura3.0atg11 + pRS315-SIR2 O/E (LEU वेक्टर) BY4741 हैप्लॉयड

तालिका 3: उपभेदों का उपयोग किया जाता है।

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Discussion

उम्र बढ़ने की आनुवंशिकी को खोलना एक कठिन चुनौती है, आगे के अध्ययन के लिए कई अवसरों के साथ जो संभावित रूप से मौजूद जटिल बातचीत में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं। ऐसे कई तरीके हैं जो खमीर45, 46,के शून्य उपभेदों के अध्ययन के लिए नुकसान-कार्य म्यूटेंट के तेजी से उत्पादन की अनुमतिदेतेहैं। यह विधि अधिक अभिव्यक्ति दमन अध्ययन के लिए pRS315 वेक्टर पर जीन की पहचान करने और क्लोन करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इस दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि यह एक स्थिर वेक्टर से मध्यम अतिव्यक्तता की अनुमति देता है, जो किसी भी अप्रत्याशित चुनौतियों से बच सकता है जो गुणसूत्र एकीकरण47के उपयोग से उत्पन्न हो सकती है। इस दृष्टिकोण को एक तरीके से प्रस्तुत किया गया है जो अपने वैज्ञानिक कैरियर के विभिन्न स्तरों पर शोधकर्ताओं की भर्ती को प्रोत्साहित करेगा, इस प्रकाशन पर कई लेखकों ने अपनी शिक्षा के घटक के रूप में ख्यात दमनकर्ताओं की पहचान और क्लोनिंग के माध्यम से योगदान दिया है।

इस काम में, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक वांछित फेनोटाइप की पहचान करने के लिए सैकरोमाइसेस जीनोम डेटाबेस में संकलित डेटा के धन का उपयोग कैसे करें, इस मामले में एक परिवर्तित कालक्रम की उम्र के आनुवंशिक लिंक। हमने कम रहते ऑटोफैगी की कमी वाले उत्परिवर्ती, atg11के सील्स पर मध्यम अतिव्यय के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए पीआरएस 315 वेक्टर में SIR2 का क्लोन किया। एक 17 दिन की उम्र बढ़ने समय पाठ्यक्रम के दौरान ऑटोफैगी उत्परिवर्ती में सील्स पर कोई प्रभाव नहीं देखा गया था और जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में देखा गया एक अधिक त्वरित सील्स। इसकी व्याख्या की जा सकती है क्योंकि SIR2 में मामूली कॉपी संख्या में वृद्धि का atg11ant उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में सील्स पर प्रभाव नहीं पड़ता है। चूंकि ATG1 ऑटोफैगी को प्रेरित करने के लिए आवश्यक एक ट्रांसक्रिप्शन कारक है, इसलिए हमारे निष्कर्ष ऑटोफैगी मार्ग की शुरुआत तक सीमित हैं। इसके अतिरिक्त, हम अपने जंगली प्रकार आनुवंशिक पृष्ठभूमि में CLS पर वृद्धि नहीं देख-शायद सुझाव है कि CLS SIR2 की प्रतिलिपि संख्या बढ़ाने के फेनोटाइप का विस्तार कुछ आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए विशिष्ट हो सकता है और सर्वव्यापी नहीं हैं ।

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदमों में क्लोन करने के लिए SIR2 निर्माण का उचित डिजाइन और लिगेशन को अनुकूलित करने के लिए उचित शर्तें शामिल हैं। इन कदमों का निवारण सील्स परख के माध्यम से लक्षण वर्णन के लिए एक जीन क्लोन करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि यह उन कोशिकाओं के लिए चुनता है जो प्लाज्मिड को बनाए रखते हैं और जो कोशिका चक्र में फिर से प्रवेश कर सकते हैं। हालांकि यह फिटनेस का एक मार्कर है, यह पूरक दृष्टिकोण का उपयोग कर अध्ययन का पालन करने के लिए आवश्यक है उंर बढ़ने फेनोटाइप विच्छेदन । इसमें महत्वपूर्ण डाई धुंधला के साथ-साथ उन दृष्टिकोणों द्वारा सेल व्यवहार्यता का मात्राकरण शामिल हो सकता है जो प्लाज्मिड प्रतिधारण पर निर्भर नहीं करते हैं। वृद्ध कोशिकाओं की वृद्धि की मात्रा या प्रतिकृति48 , 4949,,50के लक्षण वर्णन के माध्यम से सीआरएस के आगे लक्षण वर्णन करने के लिए उत्कृष्ट तरीके उपलब्ध हैं । इसके अतिरिक्त, हमारा दृष्टिकोण बातचीत की पहचान तक ही सीमित है जो गैर-घातक हैं, और एक जीन क्लोन करने के सफल प्रयास के साथ जीन क्लोन करने के असफल प्रयास में अंतर करना चुनौतीपूर्ण होगा जिसके परिणामस्वरूप घातक फेनोटाइप होता है।

हमारा दृष्टिकोण आगे के अध्ययन के लिए जीन ख्यात आनुवंशिक बातचीत की पहचान के लिए उपयोगी है । यह सरल और सीधा है, और इस प्रकार अब तक, हमने इस दृष्टिकोण का उपयोग SIR2, AIF1, UBI4और MDH1 क्लोन करने के लिए किया और इनमें से प्रत्येक निर्माण के साथ अध्ययन का पालन करने की प्रक्रिया में हैं। इस तकनीक को इस काम में प्रोटोकॉल रूपरेखा का पालन करके आनुवंशिक बातचीत के किसी भी संख्या की विशेषता के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

जेम्स टी। अर्नोन विलियम पैटरसन विश्वविद्यालय में २०१७ और २०१८ में Recombinant डीएनए टेक्नोलॉजीज कोर्स में छात्रों के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं, जो अपनी स्थापना से इस परियोजना में शामिल थे, लेकिन जिनके प्रयासों ने लेखक के लिए दहलीज पार नहीं की: क्रिस्टोफर एंडिनो, जुआन बोटेरो, जोसेफिन बोजान, ब्रेंडा कैलाल्पा, ब्रेंडा क्यूबास, हेडटलव एस्सेल डैडी, इरविन गैमर, Preciousgi , वेन को, नेल्सन मेजिया, हेक्टर मोटोला, राब्या नाज, अब्दुल्ला ओदेह, पर्ल पगंटलन, डेनियल रजाई, गैब्रिएला रेक्टर, ऐदा शोनो और मैथ्यू सो । तुम महान वैज्ञानिक हो और मैं तुम सब याद आती है!

लेखक विलियम पैटरसन विश्वविद्यालय में उनकी मदद के लिए अनुदेश और अनुसंधान प्रौद्योगिकी के अमूल्य समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं: ग्रेग मैटिसन, पीटर कैनरोज़ी, रोब मेयेर, डांटे पोर्टेला और हेनरी हेनिश। लेखकों को भी कला समर्थन के लिए प्रोवोस्ट के कार्यालय को स्वीकार करना चाहते हैं, डीन के कार्यालय और विज्ञान और स्वास्थ्य के कॉलेज में अनुसंधान के लिए केंद्र इस काम के अपने समर्थन, और इस परियोजना का समर्थन करने के लिए जीव विज्ञान विभाग ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungal/Bacterial DNA kit Zymo Research D6005
HindIIIHF enzyme New England Biolabs R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Plasmid miniprep kit Qiagen 12123
SacII enzyme New England Biolabs R0157S
Salmon sperm DNA Thermofisher AM9680
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S

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References

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