Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En Suppressor Screen för karakterisering av genetiska länkar reglera kronologisk livslängd i Saccharomyces cerevisiae

Published: September 17, 2020 doi: 10.3791/61506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, William Paterson University

Summary

Här är ett protokoll för att identifiera genetiska interaktioner genom en ökad kopia nummer suppressor skärm i Saccharomyces cerevisiae. Denna metod gör det möjligt för forskare att identifiera, klon, och testa suppressors i kortlivade jäst mutanter. Vi testar effekten av kopian antalet ökning av SIR2 på livslängd i en autofagi null mutant.

Abstract

Åldrande är den tidsberoende försämringen av en organisms normala biologiska processer som ökar sannolikheten för dödsfall. Många genetiska faktorer bidrar till förändringar i den normala åldrandeprocessen. Dessa faktorer skär varandra på komplexa sätt, vilket framgår av den mängd dokumenterade länkar som identifierats och bevarats i många organismer. De flesta av dessa studier fokuserar på förlust-of-funktion, null mutanter som möjliggör snabb screening av många gener samtidigt. Det finns mycket mindre arbete som fokuserar på att karakterisera den roll som överuttryck av en gen i denna process. I det nuvarande arbetet presenterar vi en okomplicerad metodik för att identifiera och klona gener i den spirande jästen, Saccharomyces cerevisiae, för studier i undertryckande av den kortlivade kronologiska lifespan fenotyp sett i många genetiska bakgrunder. Detta protokoll är utformat för att vara tillgängligt för forskare från en mängd olika bakgrunder och i olika akademiska stadier. SIR2-genen, som kodar för en histondeacetylase, valdes ut för kloning i pRS315-vektorn, eftersom det har förekommit motstridiga rapporter om dess effekt på den kronologiska livslängden. SIR2 spelar också en roll i autofagi, som resulterar när störs via radering av flera gener, inklusive transkriptionsfaktorn ATG1. Som ett bevis på princip, vi klona SIR2 genen att utföra en suppressor skärm på den förkortade livslängd fenotyp kännetecknande för autofagi bristfällig atg1Δ mutant och jämföra den med en annars isogen, vild typ genetisk bakgrund.

Introduction

Åldrandet är den tidsberoende förlusten av integritet i otaliga biologiska processer som i slutändan ökar sannolikheten för organismdöd. Åldrande är nästan oundvikligt för alla arter. På cellnivå finns flera väl karakteriserade kännetecken som är förknippade med åldrande, inklusive: genomisk instabilitet, epigenetiska förändringar, förlust-av-proteostasis, mitokondriell dysfunktion, avreglerade näringsämnen avkänning, cellulär senescence, och telomer attrition1,2. I encelliga organismer, såsom jäst, leder detta till en minskning av replikiv potential och kronologisk livslängd3,4. Dessa cellulära förändringar manifesteras i mer komplexa organismer, som människor, som patologier som inkluderar cancer, hjärtsvikt, neurodegeneration, diabetes, och benskörhet5,6,7. Trots de många komplexiteter som kännetecknar processen för åldrande, det finns bevarande av dessa molekylära kännetecken som ligger till grund för denna process över vitt skilda organismer8,9,10. Identifiering av ändringar av dessa vägar under åldrandet ledde till insikten att de kan manipuleras via livsstilsförändringar – kosten begränsning visas väsentligt förlänga livslängden i många organismer11. Dessa vägar konvergerar och skär med varandra och många andra vägar, på komplexa sätt. Elucidation och karakterisering av dessa interaktioner erbjuder potential för terapeutiska insatser för att förlänga livslängd och healthspan12,13,14.

Bevarandet av de molekylära underbyggnad av åldrande möjliggör funktionella dissekering av genetiska interaktioner som ligger till grund för processen genom användning av enklare modell organismer – bland annat i spirande jäst, Saccharomyces cerevisiae15,16. Det finns två etablerade typer av åldrande modelleras av spirande jäst: kronologiskt åldrande (den kronologiska livslängd, CLS) och replikiv åldrande (den replikiva livslängd, RLS)17. Kronologiskt åldrande mäter den tid som en cell kan överleva i ett icke-splittrande tillstånd. Detta är analogt med det åldrande som ses i celler som tillbringar majoriteten av sitt liv i G0, såsom nervceller4. Alternativt är replikiv livslängd det antal gånger som en cell kan dela sig före utmattning och är en modell för mitotiskt aktiva celltyper (t.ex. antalet dotterceller som en cell kan ha)18.

Det övergripande målet med denna metod är att presentera ett protokoll som möjliggör den funktionella dissektion av genetik åldrandet med hjälp av S. cerevisiae. Även om det har varit många utmärkta studier som utförs av många forskare som har lett till vår nuvarande förståelse, det finns fortfarande många möjligheter för spirande forskare att bidra till det åldrande området från början av sin akademiska karriär. Vi presenterar en tydlig metod som gör det möjligt för forskare att ytterligare avancera på åldrandet. Detta protokoll är utformat för att vara tillgängligt för alla forskare oavsett stadium i deras akademiska karriär genom att tillhandahålla de verktyg som krävs för att formulera och testa sina egna nya hypoteser. Fördelen med vårt tillvägagångssätt är att detta är en kostnadseffektiv metod lättillgänglig för alla forskare oavsett institution – och kräver inte dyr, specialiserad utrustning som är nödvändig för vissaprotokoll 19. Det finns flera olika sätt att utforma denna typ av skärm, det tillvägagångssätt som beskrivs i detta arbete är särskilt mottagliga för screening null mutanter av icke-väsentliga gener som uppvisar en allvarlig minskning av den kronologiska livslängden jämfört med en isogen vild-typ stam av jäst.

Som vårt bevis på princip, vi klon SIR2, en lysin deacetylase rapporteras som uppvisar både en förlängd och en förkortad CLS när overexpressed. SIR2 överuttryck konstaterades nyligen att öka CLS i vinframställning jäst; emellertid har flera grupper rapporterat någon koppling mellan SIR2 och CLS förlängning, lämnar sin roll under karakteriseras20,21,22. På grund av dessa motstridiga rapporter i litteraturen, vi valt denna gen för att lägga till oberoende forskning för att hjälpa klargöra rollen av SIR2 i kronologiskt åldrande, om någon. Dessutom ökar kopian antalet av en SIR2 homolog förlänger livslängd i en nematod mask modellsystem23.

Autofagi är ett intracellulärt nedbrytningssystem för att leverera cytosoliska produkter, såsom proteiner och organeller, till lysosomen24. Autofagi är intimt kopplad till livslängd genom sin roll i förnedrande skadade proteiner och organeller för att upprätthålla cellulär homeostas25. Induktion av autofagi beror på att iscensätta uttrycket av många gener, och strykningen av ATG1 genen resulterar i en onormalt kort CLS i spirande jäst26. ATG1-koder för ett protein serin/treoninkinas som krävs för vesikelbildning i autofagi och cytoplasman-till-vakuol (svampen lysosomekvivalent) utbildningsavsnitt27,28. Här presenterar vi vår metod för en ökad kopia nummer skärm, testa effekten av ökad SIR2 kopia på CLS i en vild typ och en atg1-null bakgrund. Denna metod är särskilt mottaglig för yngre forskare och forskargrupper vid främst grundutbildningsinstitutioner, av vilka många tjänar samhällen underrepresenterade inom vetenskap och har begränsade resurser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Identifiera potentiella genetiska interaktioner för screening

  1. Identifiera den genetiska bakgrunden(er) för karakterisering, som resulterar i en onormalt kortsluten kronologisk livslängd (CLS) i Saccharomyces cerevisiae med hjälp av Saccharomyces Genome Database (den SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), som sammanställer känd fenotypisk information för denna organism.
    1. Välj fliken Funktion från alternativen längst upp på webbsidan.
    2. Välj Fenotyp följt av att välja Bläddra bland alla fenotyper.
    3. Från alternativen jäst fenotyp Ontologi bläddra till underrubriken Utveckling och välj Kronologisk livslängd, som finns under underrubriken Livslängd. Lifespan
    4. Välj kvalificerare för minskade, som möjliggör identifiering av gener som uppvisar en fenotyp som resulterar i en minskad kronologisk livslängd fenotyp när utgå. För denna proof-of-method atg1Δ valdes, vilket resulterar i en kortlivad CLS fenotyp och störs för autofagi26.
  2. Identifiera target gene(s) till screen för genetiska interaktioner som kan undertrycka fenotypen, baserat på rapporterade eller förutsagda ontologi attribut, av mutanten som identifierats i del 1.2. Upprepa fenotyp sökningen som finns i steg 1.1.1-1.1.4 ovan, fråga efter gener som resulterar i en längre CLS när overexpressed i en vild-typ bakgrund. SIR2 valdes ut baserat på den rapporterade CLS-fenotypen och rapporterade interaktioner med autofagi31,32.

2. Preparera reagenser

OBS: Om inte annat anges autoklav varje lösning vid 121 °C i 20 min för att sterilisera före användning.

  1. YPAD flytande media: Tillsätt 1% JästExtrakt, 2% Pepton, 2% Dextros (glukos), och 40 mg adenin (som adenin sulfat dehydrate) per liter dubbeldestillerat vatten. Blanda väl med en magnetisk omrörare.
  2. LB flytande media: Tillsätt Tryptone (10 g), Jästextrakt (5 g), och Natriumklorid (10 g) per liter dubbeldestillerat vatten. Blanda väl med en magnetisk omrörare.
  3. Förbered 1000x (100 mg/mL) ampicillin lager, i dubbel destillerat vatten. Blanda väl och filtrera sterilisera.
  4. Syntetiska komplett – Leucin (SC-LEU) flytande media: Tillsätt 1,7 g jäst kväve bas w / o aminosyror, 2% Glukos, 1,92 g SC-LEU Dropout mix, 5 g Av Ammonium sulfat per liter dubbel destillerat vatten. Blanda väl med en magnetisk omrörare.
  5. TE-buffert: Blanda Tris (10 mM slutkoncentration), EDTA (1 mM slutkoncentration) i lösningen med dubbelt destillerat vatten. Blanda väl med en magnetisk omrörare.
  6. Förbered 50% PEG 3350 i lösning med dubbelt destillerat vatten. Blanda väl med en magnetisk omrörare.
  7. Förbered 1 M och 100 mM Litiumacetatlösning med dubbelt destillerat vatten. Blanda väl med en magnetisk omrörare.
    OBS: För att göra fasta agar plattor lägga 20 g agar (per liter med dubbelt destillerat vatten) till media beredd i 2,1 och 2,2 ovan före autoklavering. Om du förbereder ampicillinplattor tillsätt 1mL av ampicillin till media i 2,2 ovan efter att den har svalnat till ungefär 60 °C. Häll i sterila plattor och låt ställa in för 48–72 h före användning. Förvara plattor vid 4 °C för längre förvaring.

3. Utforma kloningsstrategin för att klona SIR2 i den pRS315-vektorn

  1. Designa PCR-primers för att förstärka SIR2-genen för kloning i pRS315-vektorn.
    1. Design primers manuellt att ha 21–22 nukleotid komplementaritet till de intergena regionerna uppströms och nedströms sir2. Se till att hela genen, tillsammans med de oöversatta regionerna i mRNA klonas genom att kartlägga dessa funktioner från de tillgängliga datamängderna33,34.
    2. Se till att PCR-primern-designen resulterar i framåt- och omvänt primers som har en smälttemperatur (Tm) över 53 °C och under 60 °C.
      OBS: Helst bör båda primers ha en Tm så nära varandra som sekvens kommer att tillåta, med en ungefärlig GC innehåll på mellan 40–50%, se till att undvika dinukleotid upprepar och balansera GC och AT fördelning hela sekvensen.
    3. Efter utformningen av PCR primers som kommer att möjliggöra generering av amplikonen för kloning, lägga begränsning enzym matsmältningen (R.E.D.) mål platser till 5'-änden av varje primer som är kompatibla med plasmid-kloning vektor. I denna metod läggs ett HindIII restriction enzyme digestion site (5'-AAGCTT-3') till uppströms, framåt primer och en SacII begränsning enzym matsmältningsställe (5'-CCGCGG-3') läggs till nedströms, omvänd primer.
      OBS: Användningen av SacII och HindIII platser kräver att konsensus skära platsen för varje endonucilas inte finns i målgenen. Om antingen enzym mål inom målgenen, bör alternativa restriktionsenzym väljas. Det finns många som är kompatibla med polylinkerregionen på pRS315-vektorn.
    4. Slutligen, lägga till en fyra nukleotid (5'-NNNN-3') sekvens överhäng till 5' slutet av varje primer att tillåta begränsningen enzymet att binda och smälta amplikonen. När primers har utformats, har oligonukleotider kommersiellt syntetiseras för användning kloning sir2 genen.
    5. Resuspension av PCR-primersna: Centrfugera PCR-primersna som använder en bordsskivamikrofugera på maximum, rusat för 4 min. Tillsätt TE-lösning för att göra en lagerkoncentration på 100 μM. Förvara lagerkoncentrationen vid -20 °C och späd 1/10 för användning i PCR-applikationer.
      OBS: För att göra en 100 μM lager, lös grundställarna i en volym av steril TE buffert som är 10x mängden nmoles i primer röret, med hjälp av mikroliter av TE. Om röret till exempel innehåller 15,6 nmoles primer, tillsätt 156 μL TE-buffert.
  2. Isolera vildtypsjäst gDNA för PCR-amplifiering av SIR2-kloningskonstruktionen.
    OBS: Flera högkvalitativa alternativ är kommersiellt tillgängliga för att isolera jäst gDNA. Utnyttjande av ett kit som inkluderar matsmältningen av svampcellväggen med zymolyas resulterar i bättre kvalitet gDNA (högre avkastning, mindre föroreningar). Protokollet nedan returnerar konsekvent hög koncentration och renhet. Detaljer om ett kit vi rekommenderar finns i tabellen över material.
    1. Odla 5 mL kultur av vild-typ jäst för 48-72 h till post-log fas i berikade medier, såsom YPAD. Pellet jästcellerna vid >800 x g i 3 min vid rumstemperatur, avlägsna tillväxtmediet och resuspend i 120 μL zymolyase digestionsbuffert kompletterat med 5 μL zymolyas (2 enheter enzym/μL). Blanda provet genom att virvelning och inkubera vid 37 °C i 40 min.
    2. Tillsätt 120 μL av en chaotropisk lysbuffert (t.ex. guanidiniumklorid), 250 μL kloroform, och vortexa provet för 60 s.
    3. Centrifugera vid >8 000 x g i 2 min och överför supernatanten till en reningskolumn i ett sterilt uppsamlingsrör.
    4. Centrifugera vid >8 000 x g i 60 s och kassera flödet genom. GDNA kommer att bindas till kolonnmatrisen.
    5. Tvätta kolonnen två gånger med 300 μL av en etanolbaserad tvättbuffert, som upprepar centrifugeringssteget ovanifrån (3.2.4). Kasta flödet genom efter varje spinn. Överför kolonnen i ett 1,5 mL mikrofugeringsrör, tillsätt 60 μL TE-buffert och inkubera vid rumstemperatur i 60 s. Flash snurra provet för 30 s för att elera DNA.
      OBS: Bestäm koncentrationen av DNA i provet (Absorbans vid 260nm) och kvaliteten (Absorbans 260nm/280nm). En typisk avkastning kommer att vara 100–200 ng/ μL gDNA med absorbansförhållande vid 260nm/280nm så nära 1,8 som möjligt.
  3. Förstärka och isolera pRS315 plasmidvektorn för kloning.
    OBS: Flera högkvalitativa alternativ är kommersiellt tillgängliga för rening av plasmidvektorer. En kiselbaserad kolonnkemi rekommenderas för detta steg. De nedan noterade förändringarna har lett till den högsta koncentrationen och renheten. Närmare upplysningar finns i tabellen över material.
    1. Odla en 5 mL av kultur av E. coli som innehåller den pRS315 vektorn över natten i LB+ ampicillin (80 μg/mL) media. Pellet kulturen genom centrifugering vid >8 000 x g i 2 min vid RT (15–25 °C).
    2. Åter upphäva pelleterade bakterieceller i 250 μL TE-buffert med RNase A (100 μg/mL) och överför till ett mikrocentrifugrör. Se till att inga klumpar av celler finns kvar.
    3. Tillsätt 250 μL lysbuffert och blanda genom att invertera röret 6–8 gånger. Inkubera i 5 min i rumstemperatur. Låt inte lysen fortsätta mer än 5 min – lite mindre är att föredra.
    4. Tillsätt 350 μL neutraliseringsbuffert och blanda omedelbart och noggrant genom att invertera röret 10 gånger. Centrifugera i 10 min vid >8 000 x g.
    5. Överför supernatanten försiktigt ovanifrån till en silicaspinnkolonn genom pipettering. Centrifugera i 30 s och kassera genomflödet.
    6. Tillsätt 500 μL av en hög salttvättbuffert och centrifug som i steg 3.3.5. Kassera genomflödet. Tvätta DNA-bindningspinnkolonnen genom att tillsätta 750 μL av en etanolbaserad tvättbuffert, för att avlägsna restsalter, och centrifug som i steg 3.3.5.
    7. Kassera flödet genom och centrifugera i ytterligare 2 min vid >8 000 x g för att avlägsna resttvättbuffert. Placera spinnkolonnen i ett rent, märkt 1,5 mL mikrocentrifugrör. För att elera DNA, tillsätt 20 μL TE-buffert till mitten av spinnkolonnen, inkubera i 1 min vid rumstemperatur och centrifug i 1 min vid >8 000 x g.
    8. Använd en spektrofotometer för att bestämma mängden (Absorbans vid 260nm) och kvaliteten (Absorbans 260 nm/280 nm) av DNA. En typisk avkastning kommer att vara 1–2 μg/μL.
  4. PCR-förstärkning av kandidatgenen, SIR2, från genomiskt DNA av vildtyp
    1. För att producera en amplikon som är lämplig för kloning, utnyttja en high-fidelity (HF) PCR polymeras för att undvika oavsiktliga generationen av mutationer i sekvensen som förstärks.
      OBS: Många olika high-fidelity PCR alternativ är kommersiellt tillgängliga. För att underlätta optimering av PCR-reaktionsförhållandena, använd två-buffertkombination: en som är en standard-HF-buffert och en optimerad för höga GC och komplexa amplikoner. Detaljer finns i tabellen över material.
    2. PCR förstärker SIR2-konstruktionen för kloning enligt beskrivningen i tabell 1.
      OBS: För att maximera framgången i kloningsstegen kan flera identiska 50 μL ställas in och koncentreras genom en PCR-kolonn rensa upp steg. Var noga med att ställa in en ingen gDNA-mallkontroll reaktion (negativ kontroll).
    3. Ställ in PCR-cykelförhållandena enligt beskrivningen i tabell 2.
      OBS: Olika primerpar varierar på deras glödgningstemperatur och olika polymeraser fungerar vid olika hastigheter. Se till att optimera förstärkningsförhållandena baserat på enzymet som valts och specifikationerna för primerkombinationen enligt design.
    4. Verifiera framgången med PCR-reaktionen genom att visualisera PCR-reaktionen, som skulle producera en cirka 2,5 kb DNA-fragment, på en 1,0% TAE-agarose gel (med 0,5 μg/mL ethidiumbromid för visualisering).
  5. Matsmältning och ligation av kandidatgenen, SIR2, in i den plasmidiska bedragers vektorn för PRS315.
    1. Utför begränsningss digestion av vektorn och insatsen: 625 ng DNA (antingen vektorn eller skäret), q.s. vatten för att få den slutliga reaktionsvolymen till 50 μL, 5 μL buffert, 1 μL SacII, och 1 μL HindIII. Inkubera begränsningssmältningarna vid 37 °C i 3 h, följt av 80 °C i 20 min för att värma inaktivering av enzymerna. Smälter kan förvaras vid 4 °C innan du fortsätter till nästa steg.
    2. Ställ in en 15 μL ligationsreaktion för att skapa önskad plasmid: 6 μL sterilt vatten, 2 μL röt vektor (50 ng DNA), 4 μL smält instängt (100 ng DNA), 2 μL T4 reaktionsbuffert, och 1 μL T4 DNA Ligase. Inkubera ligeringsreaktionerna över natten vid 16 °C, följt av 80 °C i 20 min för att värma inaktivering av enzymet.
      OBS: Ställ in en ingen skärkontroll, som ersätter ytterligare 4 μL sterilt vatten (10 μL totalt) i stället för skäret.
    3. Omvandla ligeringsreaktionerna till E. coli.
      OBS: Det finns många alternativ tillgängliga för kompetenta celler som finns tillgängliga. I detta protokoll används kemiskt kompetenta celler som förvaras vid -80 °C före användning.
      1. Tina ett 50 μL-rör av frysta, kompetenta E. coli-celler på is tills bara tinat och omedelbart tillsätt 15 μL av ligeringsreaktionen. Snärta röret flera gånger. Omedelbart tillbaka rören till is och inkubera i 30 min.
      2. Värm-chock cellerna i 20 s i ett vattenbad vid exakt 42 °C, och omedelbart tillbaka rören till is för en 2 min inkubation. Tillsätt 450 μL av luftrumstemperaturåtervinningsmedia (t.ex. SOC eller LB) till varje omvandlingsreaktion och inkubera i 60 min vid 37 °C med skakningar.
      3. För varje omvandlingsreaktion, gör en 1:10 utspädning av celler. Med steril teknik, plåt 150 μL av de outspädda cellerna och 1:10-spädningarna på LB + (80 μg/mL) ampicillinplattorna35. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten.
  6. Skärm blivande transformants för överuttryck vektor.
    1. Med steril teknik, inokulera de potentiella transformanter som växte till 5 mL LB + (80 μg/mL) ampicillin och växa över natten. Efter det förfarande som beskrivs i avsnitt 3.3.1–3.3.7 ovan, isolera plasmiderna från varje potentiell transformant och skärm för framgångsrik integrering av insatsen genom begränsningsrötning följt av gelelektrofores på en 1,0% TAE-agarose gel (med 0,5 μg/mL ethidiumbromid för visualisering).

4. Omvandla vektorn till atg1Δ och vild typ jäst stammar

OBS: Detta utförs med hjälp av ett modifierat litiumacetatomvandlingsprotokoll36.

  1. Pellet 15 mL av vildtyp och atg1-null jästceller som odlas över natten i YPAD-media till tidig till mitten av log-fas (O.D. 600nm = 0,4-0,9) av tillväxt under 3 min vid > 800 x g vid rumstemperatur.
  2. Dekantera supernatanten, återuppstäng cellpelletsen i 1 mL steril ddH2O och överför innehållet till ett 1,7 mL mikrofuktrör. Pellet cellerna i 3 min vid > 800 x g vid rumstemperatur.
  3. Ta bort supernatanten och återuppstäng cellerna i 250 μL av 100 mM litiumacetat med skonsam pipettering. Dela upp cellerna i separata mikrofugerör för var och en av de transformationer som du kommer att utföra. Använd 50 μL av cell-litiumacetatblandningen per omvandling.
  4. Ställ in en omvandlingsmix. Till var och en av transformationerna tillsätt: 240 μL av 50% PEG3350, 36 μL av 1,0 M Litiumacetat, och 5 μL lax spermier (eller annan bärare) DNA, kokt i 5 min och på is.
    OBS: PEG är mycket trögflytande. Pipett och mät noggrant. Blanda genom pipettering efter tillsats av varje komponent innan du går vidare.
  5. Tillsätt 5 μL av lämplig plasmid för varje utförd omvandling. Vortexa varje rör för att blanda ordentligt. Inkubera proverna vid 30 °C i 45 min. Värmestötprover vid 42 °C i 10 min.
  6. Pelletsceller i 3 min vid > 800 x g vid rumstemperatur, ta försiktigt bort omvandlingsmixen, och åter upphäva prover i 300 μL sterila ddH2O. Pelletceller genom att upprepa snurran ovan, försiktigt ta bort vatten, och åter upphäva dina prover i 200 μL steril ddH2O.
  7. Ställ in 1/10 och 1/100 utspädningar för varje transformerad jäststam.
  8. Använda steril teknikplatta 150 μL från varje prov på SC-leucin plattor för att välja för plasmiderna. Bred ut cellerna enhetligt och jämnt och låt plattan torka innan du inverterar och inkuberar i 30 °C för att växa i 48–72 h.
    OBS: När lämplig stam genereras kan den lagras på lång sikt i 25% glycerol vid -80 °C. Kvantifieringen av exemplar nummer närvarande kan bestämmas genom flera metoder, inklusive qPCR, RNA-FISH, eller en annan lämplig åtgärd37,38.

5. Bestäm den kronologiska livslängden för att testa för förkortad CLS-fenotypsdämpning

  1. Testa effekten av överuttryck av den putativa suppressorn på CLS i den kortlivade jästen, atg1Δ mutant, genom att bestämma antalet kolonikonderingsenheter (CFUs) som kvarstår som en funktion av tid39.
    OBS: Det är nödvändigt att ställa in denna del av experimentet med lämpliga kontroller. Ett typiskt experiment kommer att jämföra en vild typ (WT) stam av jäst med den tomma vektorn, WT med suppressor vektorn, borttagningen mutant med den tomma vektorn, och borttagningen mutant med suppressor vektor.
    1. Ta en enda koloni av stammen att studera och inokulera den i SC-LEU media. Odla kulturen vid 30 °C i 72 h, med skakningar.
    2. Med hjälp av en hemocytometer, bestämma koncentrationen av celler som finns i kulturen40.
    3. Späd en alikvot av kulturen, så att resultatet blir ett enhetligt antal celler i en 150 μL-volym sterilt vatten. Platta kulturen med steril teknik på SC-LEU-plattor och odla vid 30 °C i 72 h. Dessa plattor är dagen tre tid-punkt och experimentet kommer att normaliseras till denna tid-punkt som 100% lönsamhet39.
      OBS: Antalet celler ska vara 200–500, tillräckligt stort för analysen och ett hanterbart tal för räkning. I denna studie använde vi 200 celler för vår pläteringsmängd.
    4. Fortsätt att ruva jästkulturerna vid 30 °C, med regelbundna alikvoter och plätering som beskrivs i 5.1.3. Fortsätt denna process tills stammarna inte längre är livskraftiga, sedan sammanställa och analysera resultaten.
      OBS: Den kompletta listan över stammar som används i denna studie finns i tabell 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eftersom det finns motstridiga rapporter om rollen som SIR2 under åldrandet, valde vi denna gen för studier som en potentiell suppressor av atg1 mutantenΔs förkorta CLS fenotyp26. Roll SIR2 är något kontroversiellt, med motstridiga rapporter om dess roll i att utvidga CLS, men det har tydligt kopplats till ökad CLS i minst en jäst bakgrund, med en roll i både autofagi och mitofagi22,31,32,41.

Vårt val av plasmid vektor är pRS315 shuttle vektor, som konstruerades för att underlätta genetisk manipulation, förökning, och underhåll i både spirande jäst och bakterier42. Denna vektor innehåller LEU2 näringsmarkör, T7 och T3 initiativtagare, och är en centromeric (CEN) vektor för stabil passage under celldivision 42. Stabiliteten hos denna vektor över mitotiska celldelningar var mer önskvärda vid jämförelse med isogena vektorer som skilde sig genom näringsmässig markör42. PRS315-vektorn innehåller också en autonomt replikerande sekvens, som i kombination med CEN upprätthåller låga, konsekventa plasmidnivåer inom (och tvärs över) en cellpopulation43.

SIR2-genen och motsvarande uppströms (5' UTR) och nedströms (3' UTR) genomiska regionens DNA-sekvens erhölls33. För att säkerställa att den transkriberade genen innehöll de nödvändiga komponenterna UTRs för stabilitet och översättning av proteinprodukten, var vårt första fönster +/- 400 bp. Detta fönster expanderat till +/- 500bp baserat på nukleotidsammansättningen inom denna region, eftersom vårt inledande fönster inte resulterade i en region som främjar kloning. Vi utformade PCR primers som möjliggör förstärkning av genen och motsvarande reglerande regioner, som innehåller begränsningsrötningsställen och ett fyra-nukleotidöverhäng som läggs till 5' änden av varje primer (Figur 1A). Den framgångsrika förstärkningen av denna region genom PCR resulterar i ett DNA-fragment 2.469 kb i längd (Figur 1B).

SIR2 förstärktes av PCR, och produkterna av denna reaktion visualiserades genom agarosgelelektrofores och jämfördes med en ingen mallkontrollreaktion (Figur 2). SIR2 förstärkning sågs i båda körfält med arvsmassan DNA mall; de två reaktionerna poolades och koncentrerades. Plasmid rening av pRS315 från E. coli utfördes, som visualiserades genom agarosgelelektrofores (Figur 3). Proverna kvantifierades av spektrofotometri, och plasmid prep från transformant #2 valdes för kloning, som hade en koncentration på 256 ng/μL (OD260/280 = 1,87).

Plasmid och skäret var rötas med HindIII och SacII, ligerade tillsammans, och omvandlas till E. coli för förstärkning och screening. Valet av dessa begränsningsrötningsplatser krävde verifieringen av att ingen av platserna finns i regionen som ska klonas. Förekomsten av en (eller båda) platser skulle kräva användning av alternativa restriktionsenzymer för att klona SIR2 genen, och det finns flera att välja från i den pRS315 polylinker regionen42.

Vi screenade transformants för framgångsrikt skapande av pRS315-SIR2 vektor genom excision av insatsen genom dubbel matsmältning med HindIII och SacII följt av visualiseringen på agaros gel (Figur 4). pRS315-SIR2 vektor förvandlades till både vild-typ och atg1Δ mutant att generera de stammar som används för CLS karakterisering. Den pRS315 vektor är en klassisk vektor som har använts i stor utsträckning och kännetecknas, vilket är en av fördelarna med just detta system. Det relativa kopieringsnumret bestämdes av qPCR( figur 5) som tidigare beskrivits37. Detta resulterade i en blygsam ökning av antalet exemplar från i genomsnitt en kopia per cell till i genomsnitt 2,5 kopior per cell, i överensstämmelse med tidigarerapporter 42.

Den kronologiska livslängden för atg1Δ+pRS315-SIR2 jämfördes med en isogen stam av jäst som innehöll en tom vektor istället för ett skär (atg1Δ+pRS315). De åldrande kulturerna var pläterade vid konsekventa, likvärdiga utspädningar och odlades i 72 h vid 30 °C före avbildning och kvantifiering (Figur 6A). Antalet kolonier som bildar enheter som växte bestämdes och normaliserades till dag 3 tid-punkt (den första som tas) och plottas (Figur 6B). Vi rapporterar att det inte finns någon statistiskt signifikant effekt av vår SIR2-konstruktion på CLS i atg1Δ-bakgrunden. Dessutom såg vi inte någon förlängning av CLS i vild-typ bakgrund - där vår blygsamma SIR2 överuttryck faktiskt produceras en minskning av CLS jämfört med den tomma vektorn kontroll (Figur 6B).

Figure 1
Bild 1: Konstruktion av konstruktionen för att klona SIR2. Genomisk regionen flankerar SIR2 genen utnyttjades för att utforma PCR primers för förstärkning och kloning av genen. Primers innehåller 21nt av komplementaritet till regionen 419 baspar uppströms av genen (FP) och 351 baspar nedströms genen (RP), antingen hindiII eller SacII begränsning matsmältningsstället, och en fyra-nukleotid överhäng (A). Schemat för amplikonen som skapats av PCR med hjälp av primers som utformats för kloning av SIR2 genic region, tillsammans med motsvarande storlekar (B). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: PCR-förstärkning av SIR2-genen som visualiseras genom gelelektrofores. Produkterna av en high-fidelity PCR-reaktion för att förstärka SIR2-genen visualiserades på en 1% agarose gel (med ethidiumbromid). Duplicerade reaktioner utfördes med hjälp av jäst gDNA som mall (+) och jämfört med en ingen mall kontroll (-). Den förväntade amplikonstorleken är 2,469 kb. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Visualisering av pRS315-vektorn genom gelelektrofores. Duplicerade renade plasmid reaktioner utfördes och visualiseras på en 1% agaros gel (med ethidium bromid). Storleken på pRS315-vektorn är 6,018 kb. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Screening för pRS315-SIR2-vektorn genom gelelektrofores. Potentiella transformanter som innehåller pRS315-SIR2 vektorn var smält med HindIII och SacII, och sedan visualiseras på en 1% agaros gel (med ethidium bromid). Framgångsrik skapande av vektorn kommer att ge ett band på 5,963 kb (den pRS315 ryggraden) och 2,461 kb (sir2 genen). Två potentiella transformants jämfördes med en tom vektor kontroll. Transformant #1 uppvisar det mönster som förväntas av pRS315-SIR2-vektorn. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: PRS315-SIR2-vektorn ökar SIR2-kopieringsnumret i en vild typjästbakgrund. Antalet SIR2-kopior som förekommer i den genetiska bakgrunden av vildtyp fastställdes av kvantitativ PCR. Värden beräknades med 2-ΔΔCt-metoden med ACT1 som valts som en intern kontroll44. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Den kronologiska livslängden för atg1Δ+pRS315-SIR2. CLS fastställdes genom kvantifiering av antalet livskraftiga kolonibildande enheter som en funktion av tiden. Åldrande kulturer av jäst späddes till 500 celler/ platta och odlas för 72 h vid 30 °C före bildbehandling (A). Data normaliserades till dag tre tid-punkt och plottas för visualisering (B). EV är tom vektor (pRS315 utan insats) och SIR2O/E innehåller insatsen (pRS315-SIR2). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Komponent Slutlig koncentration
Nukleasfritt vatten Q.S. till slutlig volym
Buffert 1X
dNTPs (conc: 10mM) 200uM
Framåt Primer (conc: 10μM) 0,5μM
Omvänd Primer(conc: 10μM) 0,5μM
Mall gDNA 100-200ng
HF-polymeras 1 enhet/50μL PCR

Tabell 1: PCR-reaktionskomponenter.

Steg Temp Tid
Inledande Denaturering 98°C 2mins
Cykling 98°C 30s
(35 cykler) 53-60°C (primer specifik) 30s
72°C 30-talet per kB
Slutlig förlängning 72°C 5-10m
Hålla 10°C Oändliga

Tabell 2: PCR-cykelförhållanden.

Stam: Överordnade: Ploidy:
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315 (LEU-vektor) AV4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315-SIR2 O/E (LEU-vektor) AV4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315 tom vektor (LEU-vektor) AV4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315-SIR2 O/E (LEU-vektor) AV4741 Haploid

Tabell 3: Använda stammar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Att reda ut åldrandets genetik är en svår utmaning, med många möjligheter till ytterligare studier som potentiellt kan ge betydande insikter i de komplexa interaktioner som finns. Det finns många metoder som möjliggör en snabb generering av förlust-of-funktion mutanter för studier av null stammar av jäst45,46. Denna metod presenterar en enkel metod för att identifiera och klona gener på pRS315 vektorn för overexpression suppressor studier. En fördel med detta tillvägagångssätt är att detta möjliggör en måttlig överuttryck från en stabil vektor, som kan undvika eventuella oförutsedda utmaningar som skulle kunna uppstå vid användning av en kromosomal integration47. Detta tillvägagångssätt presenteras på ett sätt som kommer att uppmuntra rekrytering av forskare på olika nivåer av deras vetenskapliga karriär, med många av författarna om denna publikation bidrar genom identifiering och kloning av förmodade suppressors som en del av sin utbildning.

I detta arbete visar vi hur man använder den mängd tillgängliga data som sammanställts i databasen saccharomyces genom för att identifiera en önskad fenotyp, i detta fall genetiska länkar till en förändrad kronologisk livslängd. Vi klonade SIR2 i pRS315-vektorn för att testa effekten av måttlig överuttryck på CLS av den kortlivade autofagisbristanten, atg1Δ. Under en 17-dagars åldrande tid-kurs fanns det ingen effekt sett på CLS i autofagi mutant och en mer accelererad CLS sett i vild-typ bakgrunden. Detta kan tolkas som den blygsamma kopia nummerökningen i SIR2 inte har en effekt på CLS i atg1Δ mutant bakgrund. Som ATG1 är en transkription faktor som är nödvändiga för att inducera autofagi, våra slutsatser är begränsade till inledande av autofagi utbildningsavsnitt. Dessutom ser vi inte en ökning på CLS i vår vilda typ genetisk bakgrund – kanske tyder på att CLS utvidga fenotyper av att öka kopian antalet SIR2 kan vara specifika för vissa genetiska bakgrunder och är inte allestädes närvarande.

De kritiska stegen inom detta protokoll inkluderar korrekt utformning av SIR2 konstruera för att klona, och de rätta förutsättningarna för att optimera ligering. Felsökning dessa steg kan vara nödvändigt att klona en gen för karakterisering via CLS analysen. En begränsning av detta tillvägagångssätt är att det väljer för celler som behåller plasmiden och som kan komma in i cellcykeln igen. Medan detta är en markör för fitness, Det är viktigt för uppföljning studie med hjälp av kompletterande metoder för att dissekera åldrande fenotyp. Detta kan inkludera kvantifiering av cellens livskraft genom vital färgning färgning samt tillvägagångssätt som inte är beroende av plasmid retention. Det finns utmärkta metoder tillgängliga visar ytterligare karakterisering av CLS genom kvantifiering av utväxten av åldern celler eller karakterisering av den replikivalivslängden 48,49,50. Dessutom är vår strategi begränsad till identifiering av interaktioner som är icke-dödliga, och det skulle vara utmanande att skilja ett misslyckat försök att klona en gen med ett framgångsrikt försök att klona en gen som resulterar i en dödlig fenotyp.

Vårt tillvägagångssätt är användbart för identifiering av gen putativa genetiska interaktioner för vidare studier. Det är enkelt och okomplicerat, och hittills har vi använt detta tillvägagångssätt för att klona SIR2, AIF1, UBI4, och MDH1 och är i färd med att följa upp studier med var och en av dessa konstruktioner. Denna teknik kan tillämpas för att karakterisera valfritt antal genetiska interaktioner genom att följa protokollet kontur i detta arbete.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.

Acknowledgments

James T. Arnone vill ge sitt erkännande till stödet från studenterna i kursen Rekombinant DNA Technologies under 2017 och 2018 vid William Paterson University som var involverade i detta projekt från starten, men vars insatser inte gick över tröskeln för författarskap: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin gamarra, Precious Isbori , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rektor, Aida Shono, och Matthew So. Ni är stora vetenskapsmän och jag saknar er alla!

Författarna vill erkänna ovärderligt stöd för instruktion och forskningsteknik vid William Paterson University för deras hjälp: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella och Henry Heinitsh. Författarna vill också erkänna kontoret för Provost för ART stöd, office of the Dean och Centrum för forskning vid College of Science and Health sitt stöd för detta arbete, och Institutionen för biologi för att stödja detta projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungal/Bacterial DNA kit Zymo Research D6005
HindIIIHF enzyme New England Biolabs R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Plasmid miniprep kit Qiagen 12123
SacII enzyme New England Biolabs R0157S
Salmon sperm DNA Thermofisher AM9680
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).

Tags

Genetik kronologiskt åldrande autofagi SIR2 lysin deacetylase suppressor skärm Saccharomyces cerevisiae kopia nummer skärm
En Suppressor Screen för karakterisering av genetiska länkar reglera kronologisk livslängd i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dix, C., Sgro, S., Patel, A.,… More

Dix, C., Sgro, S., Patel, A., Perrotta, C., Eldabagh, N., Lomauro, K. L., Miguez, F. W., Chohan, P., Jariwala, C., Arnone, J. T. A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (163), e61506, doi:10.3791/61506 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter