Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En Suppressor Skærm til karakterisering af genetiske links regulering kronologisk levetid i Saccharomyces cerevisiae

Published: September 17, 2020 doi: 10.3791/61506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, William Paterson University

Summary

Her er en protokol til at identificere genetiske interaktioner gennem en øget kopi nummer suppressor skærm i Saccharomyces cerevisiae. Denne metode gør det muligt for forskere at identificere, klone og testsup suppressorer i kortlivede gærmutanter. Vi tester effekten af kopinummerets stigning af SIR2 på levetiden i en autofagi null mutant.

Abstract

Aldring er den tidsafhængige forringelse af en organisme normale biologiske processer, der øger sandsynligheden for død. Mange genetiske faktorer bidrager til ændringer i den normale aldringsproces. Disse faktorer skærer i komplekse måder, som det fremgår af den rigdom af dokumenterede links identificeret og bevaret i mange organismer. De fleste af disse undersøgelser fokuserer på tab af funktion, null mutanter, der giver mulighed for hurtig screening af mange gener samtidigt. Der er langt mindre arbejde, der fokuserer på at karakterisere den rolle, der overekspression af et gen i denne proces. I dette arbejde præsenterer vi en enkel metode til at identificere og klone gener i den spirende gær, Saccharomyces cerevisiae, til undersøgelse i undertrykkelse af den kortlivede kronologiske levetid fænotype set i mange genetiske baggrunde. Denne protokol er designet til at være tilgængelig for forskere fra en bred vifte af baggrunde og på forskellige akademiske stadier. SIR2-genet, som koder for en histone deacetylase, blev udvalgt til kloning i pRS315-vektoren, da der har været modstridende rapporter om dets virkning på den kronologiske levetid. SIR2 spiller også en rolle i autofagi, som resulterer, når forstyrret via sletning af flere gener, herunder transskriptionsfaktoren ATG1. Som et bevis på princippet kloner vi SIR2-genet for at udføre en suppressorskærm på den forkortede levetidsfæstype, der er karakteristisk for den autofagideucistiske atg1Δ mutant, og sammenligner det med en ellers isogen, vild genetisk baggrund.

Introduction

Aldring er den tidsafhængige tab af integritet i utallige biologiske processer, der i sidste ende øger sandsynligheden for organismedød. Aldring er næsten uundgåelig for alle arter. På et cellulært niveau er der flere vel karakteriseret kendetegnende, der er forbundet med aldring, herunder: genomisk ustabilitet, epigenetiske ændringer, tab-of-proteostase, mitokondriel dysfunktion, dereguleret næringsstof sensing, cellulære senescens, og telomere nedslidning1,2. I enkeltcelleorganismer, såsom gær, fører dette til en reduktion i replikerende potentiale og kronologisk levetid3,4. Disse cellulære ændringer åbenbart i mere komplekse organismer, som mennesker, som patologier, der omfatter kræft, hjertesvigt, neurodegeneration, diabetes, og osteoporose5,6,7. På trods af de mange kompleksiteter, der karakteriserer aldringsprocessen, er der bevarelse af disse molekylære kendetegn, der ligger til grund for denne proces på tværs af vidt forskellige organismer8,9,10. Identifikation af ændringer i disse veje under aldring førte til erkendelsen af, at de kan manipuleres via livsstilsændringer – kosten begrænsning har vist sig at væsentligt forlænge levetiden i mange organismer11. Disse veje konvergerer og skærer med hinanden og mange andre veje, på komplekse måder. Belysning og karakterisering af disse interaktioner giver mulighed for terapeutiske indgreb for at forlænge levetiden og sundheden12,13,14.

Bevarelsen af de molekylære fundamenter af aldring giver mulighed for funktionel dissektion af genetiske interaktioner, der ligger til grund for processen ved hjælp af enklere model organismer - herunder i den spirende gær, Saccharomyces cerevisiae15,16. Der er to etablerede typer af aldring modelleret af spirende gær: kronologisk aldring (den kronologiske levetid, CLS) og replikeret aldring (den replikerende levetid, RLS)17. Kronologisk aldring måler den tid, en celle kan overleve i en ikke-dividere tilstand. Dette svarer til den aldring, der ses i celler, der tilbringer størstedelen af deres liv i G0, såsom neuroner4. Alternativt er replikativ levetid det antal gange, en celle kan opdele før udmattelse og er en model for mitotisk aktive celletyper (f.eks. det antal datterceller, som en celle kan have)18.

Det overordnede mål med denne metode er at præsentere en protokol, der giver mulighed for funktionel dissektion af genetik af aldring ved hjælp af S. cerevisiae. Mens der har været mange fremragende undersøgelser udført af mange forskere, der har ført til vores nuværende forståelse, der er stadig mange muligheder for spirende forskere til at bidrage til det aldrende område fra tidligt i deres akademiske karriere. Vi præsenterer en klar metode, der vil gøre det muligt for forskere at fremme området for aldring yderligere. Denne protokol er designet til at være tilgængelig for alle forskere uanset scenen i deres akademiske karriere ved at give de nødvendige redskaber til at formulere og teste deres egen nye hypoteser. Fordelen ved vores tilgang er, at dette er en omkostningseffektiv metode let tilgængelig for alle forskere uanset institution - og kræver ikke dyrt, specialiseret udstyr er nødvendige for nogle protokoller19. Der er flere forskellige måder at designe denne type skærm, den tilgang, der er skitseret i dette arbejde er særlig modtagelig for screening null mutanter af ikke-væsentlige gener, der udviser en alvorlig reduktion i den kronologiske levetid i forhold til en isogen vild-type stamme af gær.

Som vores bevis på princippet, vi klone SIR2, en lysin deacetylase rapporteret som udviser både en udvidet og en forkortet CLS når overudtrykt. SIR2 overekspression blev for nylig fundet at øge CLS i vinfremstilling gær; flere grupper har imidlertid ikke rapporteret om nogen forbindelse mellem SIR2 og CLS-forlængelsen , hvilket efterlader sin rolle underkarakteriseret 20,21,22. På grund af disse modstridende rapporter i litteraturen valgte vi dette gen for at tilføje uafhængig forskning for at hjælpe med at afklare SIR2's rolle i kronologisk aldring, hvis nogen. Desuden forlænger en forøgelse af kopinummeret på en SIR2-homolog levetiden i et nematode ormmodelsystem23.

Autofagi er et intracellulært nedbrydningssystem til at levere cykliske produkter, såsom proteiner og organeller, til lysosom24. Autofagi er tæt forbundet med lang levetid gennem sin rolle i nedværdigende beskadigede proteiner og organeller til at opretholde cellulære homøostase25. Induktion af autofagi afhænger af orkestrering udtryk for mange gener, og sletning af ATG1 genet resulterer i en unormalt kort CLS i spirende gær26. ATG1 koder for et protein serin/threonin kinase, der er nødvendig for vesicle dannelse i autofagi og cytoplasma-til-vakuol (svampelyosomal ækvivalent) vej27,28. Her præsenterer vi vores metode til en øget kopi nummer skærm, teste effekten af øget SIR2 kopi på CLS i en vild type og en atg1-nullbaggrund. Denne metode er især modtagelig for yngre forskere og forskergrupper på primært bachelorinstitutioner, hvoraf mange tjener samfund underrepræsenteret inden for videnskab og har begrænsede ressourcer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Identificere potentielle genetiske interaktioner til screening

  1. Identificere den genetiske baggrund (er) for karakterisering, der resulterer i en unormalt kort kronologisk levetid (CLS) i Saccharomyces cerevisiae ved hjælp af Saccharomyces Genome Database (SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), som samler kendte fænotopypiske oplysninger for denne organisme.
    1. Vælg fanen Funktion under indstillingerne øverst på websiden.
    2. Vælg Fænotype efterfulgt af at vælge Gennemse alle fænotyper.
    3. Fra indstillingerne Gærfætningsbaseret ontologi skal du rulle til underpositionen Udvikling, og vælg Kronologisk levetid, der findes under underpositionen Levetid.
    4. Vælg kvalifikatoren for formindsket, som gør det muligt at identificere gener, der udviser en fænotype, der resulterer i en nedsat kronologisk levetid fænotype, når de slettes. Til denne bevis-of-metode atg1Δ blev valgt, hvilket resulterer i en kortvarig CLS fænotype og afbrydes for autofagi26.
  2. Identificere målgen(er) til skærm for genetiske interaktioner, der kan undertrykke fænotypen, baseret på rapporterede eller forudsagte ontologi attributter, af mutanten identificeret i del 1.2. Gentag fænotypesøgningen som fundet i trin 1.1.1-1.1.4 ovenfor, og forespørge på gener, der resulterer i en længere CLS, når de er overudtrykt i en vild-type baggrund. SIR2 blev valgt på grundlag af den rapporterede CLS fænotype og rapporterede interaktioner med autofagi31,32.

2. Forbered reagenser

BEMÆRK: Medmindre andet er angivet autoklave hver opløsning ved 121 °C i 20 min. til sterilisering før brug.

  1. YPAD flydende medier: Tilføj 1% Gær Ekstrakt, 2% Peptone, 2% Dextrose (glukose), og 40 mg adenin (som adenin sulfat dehydrere) per liter dobbelt destilleret vand. Bland godt med en magnetisk omrører.
  2. LB flydende medier: Tilsæt Tryptone (10 g), Gær ekstrakt (5 g), og Natriumchlorid (10 g) per liter dobbelt destilleret vand. Bland godt med en magnetisk omrører.
  3. Forbered 1000x (100 mg/ ml) ampicillin bestand, i dobbelt destilleret vand. Bland godt og filtrer sterilisere.
  4. Syntetisk komplet - Leucin (SC-LEU) flydende medier: Tilføj 1,7 g Gær nitrogen base w / o aminosyrer, 2% glukose, 1,92 g SC-LEU Dropout mix, 5 g Ammonium sulfat per liter dobbelt destilleret vand. Bland godt med en magnetisk omrører.
  5. TE buffer: Bland Tris (10 mM endelig koncentration), EDTA (1 mM endelig koncentration) i opløsningen med dobbelt destilleret vand. Bland godt med en magnetisk omrører.
  6. Forbered 50% PEG 3350 i opløsning med dobbelt destilleret vand. Bland godt med en magnetisk omrører.
  7. Forbered 1 M og 100 mM lithiumacetatopløsning med dobbelt destilleret vand. Bland godt med en magnetisk omrører.
    BEMÆRK: For at gøre fast agar plader tilsættes 20 g agar (per liter med dobbelt destilleret vand) til medierne forberedt i 2,1 og 2,2 ovenfor før autoclaving. Hvis der tilberedning ampicillin plader tilføje 1 ml af ampicillin til medierne i 2,2 ovenfor, efter at det er afkølet til omkring 60 °C. Hæld i sterile plader og lad det indstille til 48-72 timer før brug. Pladerne opbevares ved 4 °C for længere opbevaring.

3. Design kloningsstrategien for at klone SIR2 i pRS315-vektoren

  1. Design PCR-primere for at forstærke SIR2-genet til kloning i pRS315-vektoren.
    1. Design primere manuelt at have 21-22 nukleotid komplementaritet til de intergene regioner opstrøms og nedstrøms for SIR2. Sørg for, at hele genet sammen med de uoversatte områder af mRNA klones ved at kortlægge disse funktioner fra de tilgængelige datasæt33,34.
    2. Sørg for, at PCR-primerdesignet resulterer i forreste og omvendte primere, der har en smeltetemperatur (Tm) over 53 °C og under 60 °C.
      BEMÆRK: Ideelt set bør begge primere have en Tm så tæt på hinanden som sekvens vil tillade, med en omtrentlig GC indhold på mellem 40-50%, og sørg for at undgå dinucleotid gentagelser og afvejning GC og AT fordeling i hele sekvensen.
    3. Efter udformningen af PCR primere, der vil give mulighed for generering af amplicon til kloning, tilføje begrænsning enzym fordøjelse (R.E.D.) mål steder til 5 'ende af hver primer, der er kompatible med plasmid-kloning vektor. I denne metode tilsættes et hindiii-begrænsningsenzymfordringssted (5'-AAGCTT-3') til nedstrøms, fremadprimer og et SacII-restriktionsenzyzydegraveringssted (5'-CCGCGG-3') til nedstrøms, omvendt primer.
      BEMÆRK: Brugen af SacII- og HindIII-stederne kræver, at konsensusafskæringsstedet for hver endonuclease ikke er til stede i målgenet. Hvis et enzym mål inden for målgenet, bør der vælges alternative restriktionsenzymer. Der er mange, der er kompatible med polylinker regionen på pRS315 vektor.
    4. Til sidst tilsættes en fire nukleotid (5'-NNNN-3') sekvens udhæng til 5 'enden af hver primer at tillade begrænsningenzymet at binde og fordøje amplicon. Når primerne er designet, skal oligonukleosiderne syntetiseres kommercielt til brug til kloning af SIR2-genet.
    5. Resuspension af PCR-primere: Centrifuge pcr-primere ved hjælp af et mikrobrændstof ved bordplade ved maksimal hastighed i 4 min. Der tilsættes TE-opløsning for at foretage en lagerkoncentration på 100 μM. Lagerkoncentrationen opbevares ved -20 °C og fortyndes 1/10 til brug i PCR-applikationer.
      BEMÆRK: For at lave en 100 μM-bestand skal primere opløses i et volumen af steril TE-buffer, der er 10x mængden af nmoles i primerrøret ved hjælp af mikroliter af TE. Hvis røret for eksempel indeholder 15,6 nmoles primer, tilsættes 156 μL TE-buffer.
  2. Isoler vildærgrædna til PCR-forstærkning af SIR2-kloningskonstruktionen.
    BEMÆRK: Flere muligheder af høj kvalitet er kommercielt tilgængelige for isolering af gærgDNA. Udnyttelse af et kit, der omfatter fordøjelsen af svampecellevæggen med zymolyase resulterer i bedre kvalitet gDNA (højere udbytte, mindre urenheder). Nedenstående protokol returnerer konsekvent høj koncentration og renhed. Nærmere oplysninger om et sæt, vi anbefaler, findes i materialetabellen.
    1. Grow 5 ml kultur af vilde-type gær for 48-72 h til post-log fase i berigede medier, såsom YPAD. Pellet gærcellerne ved >800 x g i 3 min ved stuetemperatur, fjern vækstmediet og opsprænt i 120 μL zymolyase fordøjelsesbuffer suppleret med 5 μL zymolyase (2 enheder enzym/μL). Prøven blandes ved vortexing og inkuberes ved 37 °C i 40 min.
    2. Der tilsættes 120 μL chaotropic lysis-buffer (f.eks. guanidiniumchlorid), 250 μL chloroform og vortex prøven i 60 s.
    3. Centrifuge ved >8.000 x g i 2 min. og overfør supernatanten til en rensekolonne i et sterilt opsamlingsrør.
    4. Centrifuge ved >8.000 x g for 60 s og kassér strømmen igennem. GDNA vil være bundet til kolonnematrixen.
    5. Kolonnen vaskes to gange med 300 μL ethanolbaseret vaskebuffer, hvor centrifugeringstrinnet gentages ovenfra (3.2.4). Kassér strømmen igennem efter hvert spin. Kolonnen overføres til et 1,5 ml mikrofugerør, der tilsættes 60 μL TE-buffer, og inkuberes ved stuetemperatur i 60 s. Flash spin prøven i 30 s at elute DNA.
      BEMÆRK: Koncentrationen af DNA'et i prøven (Absorbans ved 260nm) og kvaliteten (Absorbans 260nm/280nm). Et typisk udbytte vil være 100-200 ng/ μL gDNA med absorbansforhold ved 260nm/280nm så tæt på 1,8 som muligt.
  3. Forstærke og isolere pRS315 plasmid vektor til kloning.
    BEMÆRK: Flere muligheder af høj kvalitet er kommercielt tilgængelige til rensning af plasmidvektorer. En silica-baseret kolonne kemi anbefales til dette trin. Nedenstående ændringer har ført til den højeste koncentration og renhed. Nærmere oplysninger findes i materialetabellen.
    1. Dyrk en 5 ml kultur af E. coli, der indeholder pRS315 vektor natten over i LB + ampicillin (80 μg/ ml) medier. Pellet kulturen ved centrifugering ved >8.000 x g i 2 min. ved RT (15-25 °C).
    2. Pelleteret bakterieceller igen i 250 μL TE-buffer med RNase A (100 μg/ml) og overfør til et mikrocentrifugerør. Sørg for, at der ikke er klumper af celler tilbage.
    3. Der tilsættes 250 μL lysisbuffer, og der blandes ved at vende røret 6-8 gange. Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Lad ikke lysis fortsætte i mere end 5 min – lidt mindre er at foretrække.
    4. Der tilsættes 350 μL neutraliseringsbuffer, og der blandes straks og grundigt ved at vende røret 10 gange. Centrifuge i 10 min. ved >8.000 x g.
    5. Overfør forsigtigt supernatanten ovenfra til en silicaspinskolonne ved pipettering. Centrifuge for 30 s og kassér flow-through.
    6. Der tilsættes 500 μL høj saltvaskebuffer og centrifuge som i trin 3.3.5. Kassér gennemstrømningen. Dna-bindingssøjlen vaskes ved at tilsætte 750 μL af en ethanolbaseret vaskebuffer for at fjerne restsalt og centrifugeres som i trin 3.3.5.
    7. Kassér strømmen gennem og centrifuge i yderligere 2 min ved >8.000 x g for at fjerne restvaskebufferen. Drejsøjlen anbringes i et rent, mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør. For at elute DNA, tilføje 20 μL TE buffer til midten af spin kolonne, inkubere i 1 min ved stuetemperatur, og centrifuge i 1 min ved > 8.000 x g.
    8. Brug et spektrofotometer til at bestemme mængden (Absorbans ved 260nm) og kvaliteten (Absorbans 260 nm/280 nm) af DNA. Et typisk udbytte vil være 1-2 μg/μL.
  4. PCR-forstærkning af kandidatgenet, SIR2, fra vildtypegengen-DNA
    1. For at producere en amplicon, der er egnet til kloning, udnytte en high-fidelity (HF) PCR polymerase for at undgå utilsigtet generation af mutationer i sekvensen bliver forstærket.
      BEMÆRK: Mange forskellige high-fidelity PCR muligheder er kommercielt tilgængelige. For at lette optimeringen af PCR-reaktionsforholdene skal du bruge to-bufferkombination: en, der er en standard HF-buffer og en, der er optimeret til høje GC- og komplekse ampliconer. Nærmere oplysninger kan findes i tabellen over materialer.
    2. PCR forstærker SIR2-konstruktionen til kloning som beskrevet i tabel 1.
      BEMÆRK: For at maksimere succesen med kloningstrinnene kan flere identiske 50 μL sættes op og koncentreres af et PCR-kolonneopredet trin. Sørg for at konfigurere en ingen gDNA skabelon kontrol reaktion (negativ kontrol).
    3. Konfigurer PCR-cykelforholdene som beskrevet i tabel 2.
      BEMÆRK: Forskellige primer par varierer på deres glødende temperatur og forskellige polymeraser funktion ved forskellige hastigheder. Sørg for at optimere forstærkningsbetingelserne baseret på det valgte enzym og specifikationerne for primerkombinationen som designet.
    4. Kontroller, om PCR-reaktionen er vellykket ved at visualisere PCR-reaktionen, som ville producere et ca. 2,5 kb DNA-fragment på en 1,0% TAE-agarosegel (med 0,5 μg/ml ethidiumbromid til visualisering).
  5. Fordøjelse og ligation af kandidatgen, SIR2, i pRS315 plasmid vektor.
    1. Der udføres begrænsningsfordybelse af vektoren og indsatsen: 625 ng-DNA (enten vektor eller indsats), q.s. vand for at bringe det endelige reaktionsvolumen op på 50 μL, 5 μL buffer, 1 μL SacII og 1 μL HindIII. Der inkuberes restriktionsfordyberne ved 37 °C i 3 timer efterfulgt af 80 °C i 20 min. for at inaktivere enzymerne. Fordøjer kan opbevares ved 4 °C, før de går videre til næste trin.
    2. Der opstilles en 15 μL ligationsreaktion for at skabe det ønskede plasmid: 6 μL sterilt vand, 2 μL fordøjet vektor (50 ng DNA), 4 μL fordøjet skær (100 ng DNA), 2 μL T4 reaktionsbuffer og 1 μL T4 DNA Ligase. Der inkuberes ligationsreaktionerne natten over ved 16 °C efterfulgt af 80 °C i 20 min. for at opvarme enzymet inaktiveres.
      BEMÆRK: Der skal være en ingen skærkontrol, der erstatter yderligere 4 μL sterilt vand (10 μL i alt) i stedet for indsatsen.
    3. Omdan ligationsreaktionerne til E. coli.
      BEMÆRK: Der er mange muligheder for kompetente celler, der er tilgængelige. Denne protokol bruger kemisk kompetente celler, der opbevares ved -80 °C før brug.
      1. Optø et 50 μL rør frosne, kompetente E. coli-celler på is, indtil de lige er optøet, og tilsæt straks 15 μL ligationsreaktion. Svirp røret flere gange. Straks returnere rørene til is og inkubere i 30 min.
      2. Varmning af cellerne i 20 s i et vandbad ved nøjagtig 42 °C, og rørene skal straks hældes i is i 2 minutter. Der tilsættes 450 μL lufttemperaturgendannelsesmedier (f.eks.
      3. For hver transformationsreaktion foretages en 1:10 fortynding af celler. Ved hjælp af steril teknik plade 150 μL af de ufortyndede celler og 1:10 fortyndinger på LB + (80 μg/ml) ampicillin plader35. Indkube pladerne ved 37 °C natten over.
  6. Screen potentielle transformanter for overekspressionsvektoren.
    1. Ved hjælp af steril teknik, inokulere de potentielle transformanter, der voksede til 5 ml LB + (80 μg/ mL) ampicillin og vokse natten over. Efter proceduren i punkt 3.3.1-3.3.7 ovenfor skal plasmiderne isoleres fra enhver potentiel transformant og skærm for vellykket integration af indsatsen ved begrænsningsfordybet efterfulgt af gelelektrophoretse på en 1,0% TAE-agarosegel (med 0,5 μg/mL ethidiumbromid til visualisering).

4. Omdan vektoren til atg1Δ og vilde type gærstammer

BEMÆRK: Dette udføres ved hjælp af en modificeret lithium acetat transformation protokol36.

  1. Pellet 15 ml af vild type og atg1-null gærceller dyrket natten over i YPAD medier til tidlig til midten af log fase (OD 600nm = 0,4-0,9) af vækst i 3 min ved > 800 x g ved stuetemperatur.
  2. Dekanter supernatanten, genspjælg cellepellet i 1 ml steril ddH2O, og indholdet overføres til et 1,7 ml mikrofugerør. Pellet cellerne i 3 min ved > 800 x g ved stuetemperatur.
  3. Fjern supernatanten, og ophæng cellerne igen i 250 μL lithiumacetat med skånsom pipettering. Opdel cellerne i separate mikrofugerør for hver af de transformationer, som du vil udføre. Brug 50 μL af celle-lithium acetatblandingen pr. transformation.
  4. Opret en transformationsblanding. Til hver af omdannelserne tilføjes: 240 μL af 50% PEG3350, 36 μL 1,0 M Lithiumacetat og 5 μL laksepind (eller anden bærer) DNA, kogt i 5 min og på is.
    BEMÆRK: PEG er meget tyktflydende. Pipette og måle omhyggeligt. Bland ved pipettering efter tilsætning af hver komponent, før du går videre.
  5. Der tilsættes 5 μL af den relevante plasmid for hver udført transformation. Vortex hvert rør til at blande grundigt. Prøverne inkuberes ved 30 °C i 45 min. Varmestødprøver ved 42 °C i 10 min.
  6. Pellet celler i 3 min ved > 800 x g ved stuetemperatur, fjern forsigtigt transformationsblandingen, og re-suspension prøver i 300 μL steril ddH2O. Pellet celler ved at gentage rygsøjlen ovenfor, forsigtigt fjerne vand, og re-suspendere dine prøver i 200 μL steril ddH2O.
  7. Opsætning 1/10 og 1/100 fortyndinger for hver transformeret stamme af gær.
  8. Ved hjælp af steril teknik plade 150 μL fra hver prøve på SC-leucin plader til at vælge for plasmider. Fordel cellerne jævnt og jævnt og lad pladen tørre, før den vendes og inkuberes ved 30 °C, så den vokser i 48-72 timer.
    BEMÆRK: Når den relevante stamme er genereret, kan den opbevares på lang sigt i 25% glycerol ved -80 °C. Kvantificeringen af det tilstedeværende kopinummer kan bestemmes ved hjælp af flere metoder, herunder qPCR, RNA-FISH eller en anden passendeforanstaltning 37,38.

5. Bestem den kronologiske levetid for at teste for forkortet CLS fænotype undertrykkelse

  1. Test effekten af overekspression af den formodede suppressor på CLS i den kortlivede gær, atg1Δ mutant, ved at bestemme antallet af kolonidannende enheder (CFUs), der forbliver som en funktion af tid39.
    BEMÆRK: Det er nødvendigt at opsætte denne del af eksperimentet med de relevante kontroller. Et typisk eksperiment vil sammenligne en vild type (WT) stamme af gær med den tomme vektor, WT med suppressor vektor, sletning mutant med den tomme vektor, og sletning mutant med suppressor vektor.
    1. Tag en enkelt koloni af stammen til at studere og vaccinere det i SC-LEU medier. Dyrk kulturen ved 30 °C i 72 timer med omrystning.
    2. Ved hjælp af et hæmocytometer bestemmes koncentrationen af celler, der er til stede ikulturen 40.
    3. En aliquot af kulturen fortyndes, således at resultatet er et ensartet antal celler i en 150 μL volumen af sterilt vand. Plade kulturen ved hjælp af steril teknik på SC-LEU plader og vokse ved 30 °C i 72 timer. Disse plader er dag tre tid-punkt, og forsøget vil blive normaliseret til dette tidspunkt som 100% levedygtighed39.
      BEMÆRK: Antallet af celler skal være 200-500, tilstrækkeligt stort til analysen og et håndterbart tal til optælling. I denne undersøgelse brugte vi 200 celler til vores plating mængde.
    4. Fortsætte med at inkubere gærkulturerne ved 30 °C og tage regelmæssige aliquots og plating som beskrevet i 5.1.3. Fortsæt denne proces, indtil stammerne ikke længere er levedygtige, derefter kompilere og analysere resultaterne.
      BEMÆRK: Den fuldstændige liste over stammer, der anvendes i denne undersøgelse, findes i tabel 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Da der er modstridende rapporter om SIR2's rolle under aldringen, valgte vi dette gen til undersøgelse som en potentiel suppressor af atg1Δ mutantens forkorte CLS fænotype26. SIR2's rolle er noget kontroversiel, med modstridende rapporter om sin rolle i at udvide CLS, men det har været klart knyttet til øget CLS i mindst én gær baggrund, med en rolle i både autofagi og mitophagy22,31,32,41.

Vores valg af plasmid vektor er pRS315 shuttle vektor, som blev bygget for at lette genetisk manipulation, formering og vedligeholdelse i både spirende gær og bakterier42. Denne vektor indeholder LEU2-næringsmarkøren, T7- og T3-initiativtagerne og er en centromerisk (CEN)vektor for stabil passage under celledeling42. Stabiliteten af denne vektor på tværs af mitotiske celledelinger var mere ønskeligt i forhold til isogeniske vektorer, der afveg ved ernæringsmæssigmarkør 42. PRS315-vektoren indeholder også en autonom replikerende sekvens, som kombineret med CEN opretholder lave, konsistente plasmidniveauer inden for (og på tværs af) en cellepopulation43.

SIR2-genet og den tilsvarende upstream (5' UTR) og downstream (3' UTR) genomiske regions DNA-sekvens blevopnået 33. For at sikre, at det transskriberede gen indeholdt de nødvendige komponenter UTR'er til stabilitet og oversættelse af proteinproduktet, var vores første vindue +/- 400 bp. Dette vindue udvidet til +/- 500bp baseret på nukleotidsammensætningen inden for denne region, da vores første vindue ikke resulterede i en region, der var befordrende for kloning. Vi har designet PCR primere, der giver mulighed for forstærkning af genet og tilsvarende lovgivningsmæssige regioner, der omfatter begrænsning fordøjelse steder og en fire-nukleotid udhæng tilføjet til 5 'ende af hver primer (Figur 1A). Den vellykkede forstærkning af denne region ved PCR resulterer i et DNA-fragment 2.469 kb i længden (Figur 1B).

SIR2 blev forstærket af PCR, og produkterne fra denne reaktion blev visualiseret ved agarosegelelektroforese og sammenlignet med en ingen skabelonkontrolreaktion (Figur 2). SIR2 forstærkning blev set i begge baner med den genomiske DNA-skabelon; de to reaktioner blev samlet og koncentreret. Plasmid rensning af pRS315 fra E. coli blev udført, som blev visualiseret af agarose gel elektroforese (Figur 3). Prøverne blev kvantificeret ved spektrofotometri, og plasmid prep fra transformant #2 blev udvalgt til kloning, som havde en koncentration på 256 ng/μL (OD260/280 = 1,87).

Plasmid og indsatsen blev fordøjet med HindIII og SacII, ligtet sammen, og omdannet til E. coli for forstærkning og screening. Valget af disse restriktionssteder krævede, at verifikationen af, at ingen af webstederne er til stede i regionen, blev klonet. Tilstedeværelsen af et (eller begge) steder ville kræve brug af alternative restriktionsenzymer til at klone SIR2-genet, og der er flere at vælge imellem i pRS315 polylinker region42.

Vi screenet transformanter for en vellykket oprettelse af pRS315-SIR2 vektor ved excision af indsætte ved dobbelt fordøjelse med HindIII og SacII efterfulgt af visualisering på agarose gel (Figur 4). pRS315-SIR2 vektor blev omdannet til både vild-type og atg1Δ mutant til at generere de stammer, der anvendes til CLS karakterisering. PRS315 vektor er en klassisk vektor, der har været meget udbredt og karakteriseret, hvilket er en af fordelene ved dette særlige system. Det relative kopinummer blev bestemt af qPCR (Figur 5) som tidligere beskrevet37. Dette resulterede i en beskeden stigning i antallet af kopier fra et gennemsnit på en kopi pr. celle til et gennemsnit på 2,5 kopier pr. celle, hvilket er i overensstemmelse medtidligere rapporter 42.

Den kronologiske levetid for atg1Δ+pRS315-SIR2 blev sammenlignet med en isogen gærstamme, der indeholdt en tom vektor i stedet for et skær (atg1Δ+pRS315). De aldrende kulturer blev belagt ved konsistente, ækvivalente fortyndinger og blev dyrket i 72 timer ved 30 °C før billeddannelse og kvantificering (figur 6A). Antallet af kolonier, der danner enheder, der voksede blev bestemt og normaliseret til dag 3 tid-punkt (den første taget) og plottet (Figur 6B). Vi rapporterer, at der ikke er nogen statistisk signifikant effekt af vores SIR2 konstruktion på CLS i atg1Δ baggrund. Derudover så vi ikke nogen udvidelse af CLS i vild-type baggrund - hvor vores beskedne SIR2 overexpression faktisk produceret et fald i CLS i forhold til den tomme vektor kontrol (Figur 6B).

Figure 1
Figur 1: Konstruktionens design til kloning SIR2. Den genomiske region, der flankerer SIR2-genet, blev brugt til at designe PCR-primere til forstærkning og kloning af genet. Primere indeholder 21nt komplementaritet til regionen 419 base par opstrøms for genet (FP) og 351 base par nedstrøms for genet (RP), enten HindIII eller SacII begrænsning fordøjelse site, og en fire-nukleotid udhæng (A). Den skematiske af amplicon skabt af PCR ved hjælp af primere designet til kloning af SIR2 genic regionen, sammen med de tilsvarende størrelser (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: PCR-forstærkning af SIR2-genet visualiseret ved gelelektrophorsis. Produkterne fra en high-fidelity PCR reaktion til at forstærke SIR2 genet blev visualiseret på en 1% agarose gel (med ethidium bromid). Dublerede reaktioner blev udført ved hjælp af gær gDNA som en skabelon (+) og sammenlignet med en ingen skabelon kontrol (-). Den forventede ampliconstørrelse er 2,469 kb. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Visualisering af pRS315-vektoren ved gelelektrophorsis. Duplikerede rensede plasmidreaktioner blev udført og visualiseret på en 1% agarosegel (med ethidiumbromid). Størrelsen af pRS315-vektoren er 6,018 kb. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Screening for pRS315-SIR2-vektoren ved gelelektroforese. Potentielle transformanter, der indeholder pRS315-SIR2 vektor blev fordøjet med HindIII og SacII, og derefter visualiseret på en 1% agarose gel (med ethidium bromid). Vellykket oprettelse af vektoren vil give et bånd på 5.963 kb (pRS315 rygraden) og 2.461 kb (SIR2 genet). To potentielle transformanter blev sammenlignet med en tom vektorkontrol. Transformant #1 udviser det mønster, der forventes af pRS315-SIR2 vektor. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: PRS315-SIR2-vektoren øger SIR2-kopinummeret i en vild gærbaggrund. Antallet af SIR2-kopier i den vilde genetiske baggrund blev bestemt ved kvantitativ PCR. Værdierne blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCt-metoden med ACT1 valgt som et interntkontrolelement 44. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Den kronologiske levetid for atg1Δ+pRS315-SIR2. CLS blev bestemt ved kvantificering af antallet af levedygtige kolonidannende enheder som en funktion af tiden. Aging kulturer gær blev fortyndet til 500 celler / plade og dyrkes i 72 timer ved 30 °C før billeddannelse (A). Data blev normaliseret til dag tre tidspunktet og afbildet til visualisering (B). EV er tom vektor (pRS315 uden indsats) og SIR2O/E indeholder indsatsen (pRS315-SIR2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Komponent Endelig koncentration
Nuclease-frit vand Q.S. til det endelige volumen
Buffer 1x
dNTPs (conc: 10mM) 200uM
Forward Primer (conc: 10μM) 0,5 μM
Omvendt primer(conc: 10μM) 0,5 μM
Skabelon gDNA 100-200ng
HF polymerase 1 enhed/50μL PCR

Tabel 1: PCR-reaktionskomponenter.

Trin Temp Tidspunkt
Indledende denaturering 98°C 2mins
Cykling 98°C 30s
(35 cyklusser) 53-60°C (primerspecifik) 30s
72°C 30s pr kB
Endelig forlængelse 72°C 5-10 m
Holde 10°C Uendeligt

Tabel 2: PCR-cykelforhold.

Stamme: Overordnede: Ploidy:
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315 (LEU vektor) AF4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315-SIR2 O/E (LEU vektor) AF4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315 tom vektor (LEU vektor) AF4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315-SIR2 O/E (LEU vektor) AF4741 Haploid

Tabel 3: Anvendte stammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optrævling genetik af aldring er en vanskelig udfordring, med mange muligheder for yderligere undersøgelse, der potentielt kan give betydelig indsigt i de komplekse interaktioner, der findes. Der er mange metoder , der giver mulighed for hurtig generering af tab af funktion mutanter til undersøgelse af null stammer af gær45,46. Denne metode præsenterer en enkel tilgang til at identificere og klone gener på pRS315 vektor for overekspression suppressor undersøgelser. En fordel ved denne tilgang er, at dette giver mulighed for en moderat overekspression fra en stabil vektor, som kan undgå uforudsete udfordringer, der kan opstå som følge af brugen af en kromosomintegration47. Denne tilgang præsenteres på en måde, der vil tilskynde til rekruttering af forskere på forskellige niveauer af deres videnskabelige karriere, hvor mange af forfatterne på denne publikation bidrager gennem identifikation og kloning af formodede undertrykkere som en del af deres uddannelse.

I dette arbejde demonstrerer vi, hvordan vi bruger det væld af data, der er tilgængelige i Saccharomyces-genomdatabasen, til at identificere en ønsket fænotype, i dette tilfælde genetiske links til en ændret kronologisk levetid. Vi klonede SIR2 i pRS315 vektoren for at teste effekten af moderat overekspression på CLS af den kortlivede autofagidelevantaler, atg1Δ. Gennem en 17-dages aldringstidsforløb sås der ingen effekt på CLS i autofagi mutanten og en mere accelereret CLS set i vildtypebaggrunden. Dette kan fortolkes som den beskedne stigning i antallet af kopier i SIR2 ikke har nogen effekt på CLS i atg1Δ mutant baggrund. Da ATG1 er en transskriptionsfaktor, der er nødvendig for at fremkalde autofagi, er vores konklusioner begrænset til indledningen af den autofagivej. Derudover ser vi ikke en stigning på CLS i vores vilde type genetisk baggrund - måske tyder på, at CLS udvide fænotyper for at øge kopi antallet af SIR2 kan være specifikke for visse genetiske baggrunde og er ikke allestedsnærværende.

De kritiske trin i denne protokol omfatter den korrekte udformning af SIR2 konstruktionen til klon, og de korrekte betingelser for at optimere ligation. Fejlfinding af disse trin kan være nødvendigt at klone et gen til karakterisering via CLS-analysen. En begrænsning af denne fremgangsmåde er, at den vælger for celler, der bevarer plasmid, og som kan komme ind i cellecyklussen igen. Mens dette er en markør for fitness, er det vigtigt for opfølgning undersøgelse ved hjælp af komplementære tilgange til at dissekere den aldrende fænotype. Dette kan omfatte kvantificering af celle levedygtighed ved vitale farvning af farvestoffer samt tilgange, der ikke er afhængige af plasmid fastholdelse. Der findes fremragende metoder, der viser yderligere karakterisering af CLS gennem kvantificering af udvæksten af gamle celler eller karakterisering af den replikerende levetid48,49,50. Derudover er vores tilgang begrænset til identifikation af interaktioner, der ikke er dødelige, og det ville være udfordrende at skelne et mislykket forsøg på at klone et gen med et vellykket forsøg på at klone et gen, der resulterer i en dødelig fænotype.

Vores tilgang er nyttig til identifikation af gen-formodede genetiske interaktioner til yderligere undersøgelse. Det er enkelt og ligetil, og indtil videre har vi brugt denne tilgang til klon SIR2, AIF1, UBI4, og MDH1 og er i færd med at følge op undersøgelser med hver af disse konstruktioner. Denne teknik kan anvendes til at karakterisere et vilkårligt antal genetiske interaktioner ved at følge protokollen skitse i dette arbejde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

James T. Arnone vil gerne anerkende støtten fra de studerende i Recombinant DNA Technologies kursus i 2017 og 2018 på William Paterson University, der var involveret i dette projekt fra starten, men hvis indsats ikke krydsede tærsklen for forfatterskab: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin Gamgift, Precious Isibor , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rektor, Aida Shono, og Matthew So. I er store videnskabsmænd, og jeg savner jer alle!

Forfatterne vil gerne anerkende den uvurderlige støtte instruktion og forskningsteknologi på William Paterson University for deres hjælp: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella, og Henry Heinitsh. Forfatterne vil også gerne anerkende Kontoret for Provost for ART støtte, Kontoret for Dekan og Center for Forskning i College of Science and Health deres støtte til dette arbejde, og Institut for Biologi for at støtte dette projekt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungal/Bacterial DNA kit Zymo Research D6005
HindIIIHF enzyme New England Biolabs R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Plasmid miniprep kit Qiagen 12123
SacII enzyme New England Biolabs R0157S
Salmon sperm DNA Thermofisher AM9680
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).

Tags

Genetik kronologisk aldring autofagi SIR2 lysin deacetylase suppressor skærm Saccharomyces cerevisiae kopi nummer skærm
En Suppressor Skærm til karakterisering af genetiske links regulering kronologisk levetid i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dix, C., Sgro, S., Patel, A.,… More

Dix, C., Sgro, S., Patel, A., Perrotta, C., Eldabagh, N., Lomauro, K. L., Miguez, F. W., Chohan, P., Jariwala, C., Arnone, J. T. A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (163), e61506, doi:10.3791/61506 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter