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Genetics

Uno schermo soppressore per la caratterizzazione dei collegamenti genetici che regolano la durata cronologica in Saccharomyces cerevisiae

Published: September 17, 2020 doi: 10.3791/61506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, William Paterson University

Summary

Ecco un protocollo per identificare le interazioni genetiche attraverso uno schermo soppressore numero di copie aumentato in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo consente ai ricercatori di identificare, clonare e testare i soppressori in mutanti di lievito di breve durata. Testiamo l'effetto dell'aumento del numero di copie di SIR2 sulla durata della vita in un mutante nullo autofagi.

Abstract

L'invecchiamento è il deterioramento dipendente dal tempo dei normali processi biologici di un organismo che aumenta la probabilità di morte. Molti fattori genetici contribuiscono alle alterazioni nel normale processo di invecchiamento. Questi fattori si intersecano in modo complesso, come dimostra la ricchezza di collegamenti documentati identificati e conservati in molti organismi. La maggior parte di questi studi si concentra sulla perdita di funzione, mutanti nulli che consentono lo screening rapido di molti geni contemporaneamente. C'è molto meno lavoro che si concentra sulla caratterizzazione del ruolo che sovraespressione di un gene in questo processo. Nel presente lavoro, presentiamo una metodologia semplice per identificare e clonare i geni nel lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, per lo studio nella soppressione del fenotipo cronologico della durata della vita di breve durata visto in molti background genetici. Questo protocollo è progettato per essere accessibile ai ricercatori provenienti da un'ampia varietà di background e in varie fasi accademiche. Il gene SIR2, che codifica per una deacetilase istonea, è stato selezionato per la clonazione nel vettore pRS315, in quanto ci sono state relazioni contrastanti sul suo effetto sulla durata cronologica della vita. SIR2 svolge anche un ruolo nell'autofagia, che si traduce quando interrotto attraverso la cancellazione di diversi geni, tra cui il fattore di trascrizione ATG1. Come prova di principio, clonamo il gene SIR2 per eseguire uno schermo soppressore sul fenotipo abbreviato della durata della vita caratteristica del mutante atg1, un mutante carente di autofagia, e lo confrontiamo con un background genetico altrimenti isogenico di tipo selvaggio.

Introduction

L'invecchiamento è la perdita di integrità dipendente dal tempo in una miriade di processi biologici che aumenta in ultima analisi la probabilità di morte dell'organismo. L'invecchiamento è quasi inevitabile per tutte le specie. A livello cellulare ci sono diversi segni distintivi ben caratterizzati che sono associati con l'invecchiamento, tra cui: instabilità genomica, alterazioni epigenetiche, perdita di proteostasi, disfunzione mitocondriale, rilevamento dei nutrienti deregolamentato, senescenza cellulare, e logoramento telomero1,2. Negli organismi a singolo cellula, come i lieviti, questo porta ad una riduzione del potenziale replicativo e della durata cronologica3,4. Questi cambiamenti cellulari si manifestano in organismi più complessi, come gli esseri umani, come patologie che includono tumori, insufficienza cardiaca, neurodegenerazione, diabete e osteoporosi5,6,7. Nonostante le molte complessità che caratterizzano il processo di invecchiamento, c'è la conservazione di questi segni molecolari alla base di questo processo attraverso organismi ampiamente divergenti8,9,10. L'identificazione di alterazioni a questi percorsi durante l'invecchiamento ha portato alla consapevolezza che possono essere manipolati attraverso cambiamenti di stile di vita – restrizione dietetica è indicato per estendere sostanzialmente la durata della vita in moltiorganismi 11. Questi percorsi convergono e si intersecano tra loro e molti altri percorsi, in modi complessi. Il chiarimento e la caratterizzazione di queste interazioni offre il potenziale per interventi terapeutici per prolungare la durata della vita e la duratadella salute 12,13,14.

La conservazione delle basi molecolari dell'invecchiamento consente la dissezione funzionale delle interazioni genetiche alla base del processo attraverso l'uso di organismi modello più semplici – anche nel lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae15,16. Esistono due tipi consolidati di invecchiamento modellati da lieviti in erba: l'invecchiamento cronologico (la durata cronologica della vita, CLS) e l'invecchiamento replicativo (la durata replicativa, RLS)17. L'invecchiamento cronologico misura la quantità di tempo in cui una cella può sopravvivere in uno stato non diviso. Questo è analogo all'invecchiamento che si vede nelle cellule che trascorrono la maggior parte della loro vita in G0, come i neuroni4. In alternativa, la durata replicativa è il numero di volte in cui una cella può dividersi prima dell'esaurimento ed è un modello per i tipi di cellule mitoticamente attive (ad esempio, il numero di celle figlia che una cella puòavere) 18.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di presentare un protocollo che consente la dissezione funzionale della genetica dell'invecchiamento utilizzando S. cerevisiae. Mentre ci sono stati molti studi eccellenti eseguiti da molti ricercatori che hanno portato alla nostra attuale comprensione, ci sono molte opportunità disponibili per i ricercatori in erba per contribuire al campo di invecchiamento fin dall'inizio della loro carriera accademica. Vi presentiamo una metodologia chiara che permetterà ai ricercatori di far progredire ulteriormente il campo dell'invecchiamento. Questo protocollo è progettato per essere accessibile a tutti i ricercatori indipendentemente dalla fase della loro carriera accademica, fornendo gli strumenti necessari per formulare e testare le proprie nuove ipotesi. Il vantaggio del nostro approccio è che questo è un metodo conveniente facilmente accessibile a tutti i ricercatori indipendentemente dall'istituzione – e non richiede costose attrezzature specializzate necessarie per alcuni protocolli19. Ci sono diversi modi per progettare questo tipo di schermo, l'approccio delineato in questo lavoro è particolarmente sussbile per lo screening di mutanti nulli di geni non essenziali che presentano una grave riduzione della durata della vita cronologica rispetto a un ceppo isogenico di lievito di tipo selvatico.

Come prova di principio, cloniamo SIR2, una deacetilase lisina riportata come esibire sia una CLS estesa che una CLS abbreviata quando sovraespressa. Sir2 sovraespressione è stato recentemente trovato per aumentare CLS nei lieviti di vinificazione; tuttavia, diversi gruppi non hanno segnalato alcun collegamento tra SIR2 e l'estensione CLS, lasciando il suo ruolosotto la caratterizzata 20,21,22. A causa di queste relazioni contrastanti nella letteratura, abbiamo selezionato questo gene per aggiungere una ricerca indipendente per aiutare a chiarire il ruolo di SIR2 nell'invecchiamento cronologico, se presente. Inoltre, l'aumento del numero di copie di un homologue SIR2 estende la durata in un sistema di modello di worm nematode23.

L'autofagia è un sistema di degradazione intracellulare per fornire prodotti citosolici, come proteine e organelli, al lisosoma24. L'autofagia è intimamente legata alla longevità attraverso il suo ruolo nel degradare le proteine e gli organelli danneggiati per mantenere l'omeostasi cellulare25. L'induzione dell'autofagia dipende dall'orchestrazione dell'espressione di molti geni, e la cancellazione del gene ATG1 si traduce in una CLS anormalmente breve nel lievito inerba 26. Codici ATG1 per una proteina serina/treonina chinasi che è necessaria per la formazione di vescicole in autofagia e il cytoplasma-a-vacuole (l'equivalente lisosomiale fungino)percorso 27,28. Qui, presentiamo il nostro metodo per una schermata di numero di copia aumentata, testando l'effetto di una maggiore copia DI SIR2 su CLS in un tipo selvaggio e uno sfondo atg1-null. Questo metodo è particolarmente sussbile per i giovani ricercatori e gruppi di ricerca presso le istituzioni principalmente universitarie, molte delle quali servono comunità sottorappresentate nelle scienze e hanno risorse limitate.

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Protocol

1. Identificare potenziali interazioni genetiche per lo screening

  1. Identificare il background genetico(i) per la caratterizzazione, che si traduce in una durata di vita cronologica (CLS) anormalmente breve in Saccharomyces cerevisiae utilizzando il saccharomyces Genome Database (L'SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), che compila informazioni fenotipo note per questo organismo.
    1. Selezionare la scheda Funzione dalle opzioni nella parte superiore della pagina Web.
    2. Selezionare Fenotipo seguito selezionando Sfoglia tutti i fenotipi.
    3. Dalle opzioni Di ontologia del fenotipo del lievito scorrere fino al sottotitolo Sviluppo e selezionare Durata cronologica, che si trova sotto il sottotitolo Lifespan.
    4. Selezionare il qualificatore per ,che consente l'identificazione di geni che presentano un fenotipo che comporta una riduzione della durata cronologica di quando viene eliminato. Per questo proof-of-method è stato selezionato atg1, che si traduce in un fenotipo CLS di breve durata e viene interrotto per l'autofagia26.
  2. Identificare i geni bersaglio da va cercare per le interazioni genetiche che possono sopprimere il fenotipo, in base agli attributi di ontologia segnalati o previsti, del mutante identificato nella parte 1.2. Ripetere la ricerca del fenotipo come trovato nei passaggi 1.1.1-1.1.4 precedenti, interrogando i geni che si tras risultatono una CLS più lunga quando sono sovraespressi in uno sfondo di tipo selvaggio. SIR2 è stato selezionato in base al fenotipo CLS riportato e alle interazioni segnalate con l'autofagia31,32.

2. Preparare i reagenti

NOTA: Se non diversamente specificato autoclave ogni soluzione a 121 gradi centigradi per 20 min per sterilizzare prima dell'uso.

  1. Supporti liquidi YPAD: Aggiungere 1% Estratto di lievito, 2% Peptone, 2% Dextrose (glucosio) e 40 mg di adenina (come disidratare solfato di adenina) per litro di acqua doppia distillata. Mescolare bene con uno agitatore magnetico.
  2. Supporti liquidi LB: Aggiungere Il tryptone (10 g), l'estratto di lievito (5 g) e il cloruro di sodio (10 g) per litro di acqua doppia distillata. Mescolare bene con uno agitatore magnetico.
  3. Preparare 1000x (100 mg/mL) brodo di ampicillina, in acqua doppia distillata. Mescolare bene e filtrare sterilizzare.
  4. Sintetico completo – Supporti liquidi di leucina (SC-LEU): aggiungere 1,7 g di base di azoto di lievito w/o aminoacidi, 2% glucosio, 1,92 g di miscela SC-LEU Dropout, 5 g di solfato di ammonio per litro di acqua doppia distillata. Mescolare bene con uno agitatore magnetico.
  5. TE buffer: Mix Tris (concentrazione finale di 10 mM), EDTA (1 mM concentrazione finale) nella soluzione con acqua doppia distillata. Mescolare bene con uno agitatore magnetico.
  6. Preparare il 50% PEG 3350 in soluzione con acqua doppia distillata. Mescolare bene con uno agitatore magnetico.
  7. Preparare la soluzione di acetato di litio da 1 M e 100 mM con acqua doppia distillata. Mescolare bene con uno agitatore magnetico.
    NOTA: Per realizzare piastre solide di agar aggiungere 20 g di agar (per litro con acqua doppia distillata) ai supporti preparati in 2.1 e 2.2 sopra prima dell'autoclaving. Se si preparano le piastre di ampicillina aggiungere 1mL di ampicillina al supporto in 2.2 sopra dopo che si è raffreddato a circa 60 gradi centigradi. Versare in piastre sterili e lasciare impostare per 48-72 h prima dell'uso. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi per una conservazione più lunga.

3. Progettare la strategia di clonazione per clonare SIR2 nel vettore pRS315

  1. Progettare primer PCR per amplificare il gene SIR2 per la clonazione nel vettore pRS315.
    1. Progettare i primer manualmente per avere 21-22 nucleotide complementarità alle regioni intergeniche a monte e a valle del SIR2. Assicurarsi che l'intero gene, insieme alle regioni non tradotte dell'mRNA, venga clonato mappando tali funzionalità dai set di datidisponibili 33,34.
    2. Assicurarsi che il design del primer PCR si tras poco in avanti e in retromarcia con una temperatura di fusione (Tm) superiore a 53 gradi centigradi e inferiore a 60 gradi centigradi.
      NOTA: Idealmente, entrambi i primer dovrebbero avere un Tm il più vicino possibile l'uno all'altro come la sequenza permetterà, con un contenuto GC approssimativo compreso tra il 40-50%, assicurandosi di evitare ripetizioni dinucleotide e bilanciare la distribuzione GC e AT in tutta la sequenza.
    3. Dopo la progettazione dei primer PCR che permetteranno la generazione dell'amplificatore per la clonazione, aggiungere la digestione enzimatica di restrizione (R.E.D.) siti di destinazione alla fine 5' di ogni primer che sono compatibili con il vettore di clonazione plasmide. In questo metodo, un sito di digestione enzimatica di restrizione HindIII (5'-AAGCTT-3') viene aggiunto al primer a monte, in avanti e un sito di digestione enzimatica di restrizione SacII (5'-CCGCGG-3') viene aggiunto al primer inverso a valle.
      NOTA: L'uso dei siti SacII e HindIII richiede che il sito di taglio del consenso per ogni endonucleasi non sia presente nel gene bersaglio. Se uno dei due enzimi si rivolge all'interno del gene bersaglio, è necessario scegliere enzimi di restrizione alternativi. Ce ne sono molti che sono compatibili con la regione polilinker sul vettore pRS315.
    4. Infine, aggiungere uno sbalzo di quattro nucleotidi (5'-NNNN-3') alla fine 5' di ogni primer per consentire all'enzima di restrizione di legare e digerire l'amplificatore. Una volta che i primer sono stati progettati, hanno gli oligonucleotidi sintetizzati commercialmente per l'uso della clonazione del gene SIR2.
    5. Resuspensione dei primer PCR: Centrifugare i primer PCR utilizzando un microfuggio da tavolo alla massima velocità per 4 min. Aggiungere la soluzione TE per ottenere una concentrazione di magazzino di 100 M. Conservare la concentrazione dello stock a -20 gradi centigradi e diluire 1/10 per l'uso in applicazioni PCR.
      NOTA: per creare uno stock di 100 M, sciogliere i primer in un volume di buffer TE sterile pari a 10 volte la quantità di nmoles nel tubo di primer, utilizzando microlitri di TE. Ad esempio, se il tubo contiene 15,6 nmoles di primer, aggiungere 156 ÌL di buffer TE.
  2. Isolare il lievito di tipo selvatico gDNA per l'amplificazione PCR del costrutto di clonazione SIR2.
    NOTA: Diverse opzioni di alta qualità sono disponibili in modo commerciale per isolare il lievito gDNA. L'utilizzo di un kit che include la digestione della parete cellulare fungina con zymolyase si traduce in una migliore qualità gDNA (resa più alta, meno impurità). Il protocollo seguente restituisce costantemente alta concentrazione e purezza. I dettagli di un kit che consigliamo sono disponibili nella Tabella dei Materiali.
    1. Crescere 5 mL coltura di lievito di tipo selvatico per 48-72 h alla fase post-log in supporti arricchiti, come YPAD. Pellet le cellule di lievito a >800 x g per 3 min a temperatura ambiente, rimuovere i mezzi di crescita, e rispendere in 120 L di tampone di digestione zymolyase integrato con 5 L di zymolyase (2 unità enzima/ L). Mescolare il campione per vortice e incubare a 37 gradi centigradi per 40 min.
    2. Aggiungere 120 L di un tampone di lysi chaotropico (ad esempio, cloruro di guanidinio), 250 L di cloroformio e vortex il campione per 60 s.
    3. Centrifuga a >8,000 x g per 2 min e trasferire il supernatant in una colonna di purificazione in un tubo di raccolta sterile.
    4. Centrifuga a >8.000 x g per 60 s e scartare il flusso attraverso. Il gDNA verrà associato alla matrice di colonne.
    5. Lavare la colonna due volte con 300 L di un tampone di lavaggio a base di etanolo, ripetendo il passaggio di centrifugazione dall'alto (3.2.4). Scartare il flusso attraverso dopo ogni giro. Trasferire la colonna in un tubo di microfuga da 1,5 mL, aggiungere 60 L di tampone TE e incubare a temperatura ambiente per 60 s. Flash girare il campione per 30 s per elute il DNA.
      NOTA: Determinare la concentrazione del DNA nel campione (assorbimento a 260nm) e la qualità (Absorbance 260nm/280nm). Una resa tipica sarà di 100-200 ng/ L di gDNA con rapporto di assorbimento a 260nm/280nm il più vicino possibile a 1,8.
  3. Amplificare e isolare il vettore plasmid pRS315 per la clonazione.
    NOTA: Diverse opzioni di alta qualità sono disponibili in modo commerciale per la purificazione di vettori plasmidi. Per questo passaggio è consigliata una chimica di colonna basata sulla silice. I cambiamenti qui sotto hanno portato alla più alta concentrazione e purezza. I dettagli si trovano nella Tabella dei Materiali.
    1. Coltivare un 5 mL di coltura di E. coli contenente il vettore pRS315 durante la notte in supporti di ampicillina LB (80 g/mL). Pellet la coltura per centrifugazione a >8,000 x g per 2 min a RT (15-25 gradi centigradi).
    2. Sospendere nuovamente le cellule batteriche pellet in 250 L di tampone TE con RNase A (100 g/mL) e trasferitele in un tubo di microcentrifuge. Assicurarsi che non rimangano grumi di cellule.
    3. Aggiungere 250 L di tampone di lisi e mescolare invertendo il tubo 6-8 volte. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Non permettere alla lisi di procedere per più di 5 minuti – un po 'meno è preferibile.
    4. Aggiungere 350 L di buffer di neutralizzazione e mescolare immediatamente e accuratamente invertendo il tubo 10 volte. Centrifuga per 10 min a >8,000 x g.
    5. Trasferire con attenzione il supernatant dall'alto in una colonna di spin di silice mediante pipettamento. Centrifugare per 30 s e scartare il flusso-through.
    6. Aggiungere 500 L di un buffer di lavaggio ad alto contenuto di sale e centrifugazione come al punto 3.3.5. Eliminare il flusso.Discard the flow-through. Lavare la colonna di spin del DNA aggiungendo 750 L di un tampone di lavaggio a base di etanolo, per rimuovere i sali residui e la centrifuga come al punto 3.3.5.
    7. Scartare il flusso attraverso e centrifuga per un ulteriore 2 min a >8,000 x g per rimuovere il buffer di lavaggio residuo. Posizionare la colonna di rotazione in un tubo di microcentrifuge pulito, etichettato 1,5 mL. Per elutere il DNA, aggiungere 20 L di buffer TE al centro della colonna di spin, incubare per 1 min a temperatura ambiente e centrifugare per 1 min a >8,000 x g.
    8. Utilizzare uno spettrofotometro per determinare la quantità (Assorbimento a 260nm) e la qualità (Absorbance 260 nm/280 nm) di DNA. Una resa tipica sarà di 1-2 g/L.
  4. Amplificazione PCR del gene candidato, SIR2, dal DNA genomico di tipo selvaggio
    1. Per produrre un amplificatore adatto per la clonazione, utilizzare una polimerasi PCR ad alta fedeltà (HF) per evitare che la generazione involontaria di mutazioni nella sequenza venga amplificata.
      NOTA: Molte diverse opzioni PCR ad alta fedeltà sono disponibili in modo commerciale. Per facilitare l'ottimizzazione delle condizioni di reazione PCR, utilizzare una combinazione a due buffer: una che è un buffer HF standard e una ottimizzata per ampliconi GC e complessi. I dettagli sono disponibili nella Tabella dei Materiali.
    2. La PCR amplifica il costrutto SIR2 per la clonazione, come descritto nella tabella 1.
      NOTA: per massimizzare il successo nelle fasi di clonazione, è possibile impostare e concentrare più 50 L identici e concentrati da un passaggio di pulizia della colonna PCR. Assicurarsi di impostare una reazione di controllo del modello no gDNA (controllo negativo).
    3. Impostare le condizioni di ciclo PCR come descritto nella tabella 2.
      NOTA: Diverse coppie di primer variano in base alla loro temperatura annealing e diverse polimerasi funzionano a velocità diverse. Assicurarsi di ottimizzare le condizioni di amplificazione in base all'enzima selezionato e alle specifiche della combinazione primer come previsto.
    4. Verificare il successo della reazione PCR visualizzando la reazione PCR, che produrrebbe un frammento di DNA di circa 2,5 kb, su un gel TAE-agarose dell'1,0% (con 0,5 g/mL bromuro di etidio per la visualizzazione).
  5. Digestione e legatura del gene candidato, SIR2, nel vettore plasmide pRS315.
    1. Eseguire la digestione di restrizione del vettore e l'inserto: 625 ng DNA (sia il vettore o inserto), q.s. acqua per portare il volume di reazione finale a 50 L, 5 L di buffer, 1 L SacII, e 1 L HindIII. Incubare le digestione di restrizione a 37 gradi centigradi per 3 h, seguita da 80 gradi centigradi per 20 minuti per riscaldare inattivare gli enzimi. I digest possono essere conservati a 4 gradi centigradi prima di procedere al passaggio successivo.
    2. Impostare una reazione di legatura di 15 L per creare il plasmide desiderato: 6 L di acqua sterile, 2 vettori digeriti da 50 L (50 ng DNA), inserto digerito 4 L (100 ng DNA), 2 buffer di reazione T4 2 e 1 L di T4 DNA Ligase. Incubare le reazioni di legatura durante la notte a 16 gradi centigradi, seguita da 80 gradi centigradi per 20 minuti per riscaldare inattivare l'enzima.
      NOTA: Impostare un controllo senza inserto, sostituendo un ulteriore 4 L di acqua sterile (10 L totale) al posto dell'inserto.
    3. Trasformare le reazioni di legatura in E. coli.
      NOTA: Ci sono molte opzioni disponibili per le celle competenti che sono disponibili. Questo protocollo utilizza cellule chimicamente competenti che vengono conservate a -80 gradi centigradi prima dell'uso.
      1. Scongelare un tubo da 50 L di cellule E. coli congelate e competenti sul ghiaccio fino a quando non si è appena scongelato e aggiungere immediatamente 15 L della reazione di legatura. Scorrere il tubo più volte. Riportare immediatamente i tubi al ghiaccio e incubare per 30 min.
      2. Riscaldare le cellule per 20 s in un bagno d'acqua esattamente a 42 gradi centigradi, e riportare immediatamente i tubi al ghiaccio per un'incubazione di 2 minuti. Aggiungere 450 L di supporti di recupero della temperatura ambiente (ad esempio, SOC o LB) ad ogni reazione di trasformazione e incubare per 60 min a 37 gradi centigradi con agitazione.
      3. Per ogni reazione di trasformazione, effettuare una diluizione 1:10 delle cellule. Utilizzando la tecnica sterile, piastra 150 L delle cellule non diluita e le diluizioni 1:10 su LB - (80 g/mL) piastre di ampicil35. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi durante la notte.
  6. Trasformazione potenziale dello schermo per il vettore di sovraespressione.
    1. Utilizzando la tecnica sterile, inoculare i potenziali trasformatori che sono cresciuti fino a 5 mL LB - ampicillina (80 g/mL) e crescono durante la notte. Seguendo la procedura descritta nella sezione 3.3.1–3.3.7 precedente, isolare i plasmidi da ogni potenziale trasformatore e schermo per una corretta integrazione dell'inserto mediante digestione di restrizione seguita da elettroforesi gel su un gel TAE-agarose dell'1,0% (con 0,5 g/mL bromuro di etedio per la visualizzazione per la visualizzazione del bromuro di etedio per la visualizzazione).

4. Trasformare il vettore in ceppi di lievito di tipo atg1 e di tipo selvatico

NOTA: questa operazione viene eseguita utilizzando un protocollo di trasformazione dell'acetato dilitio modificato 36.

  1. Pellet 15 mL di tipo selvatico e cellule di lievito atg1-null coltivate durante la notte nei supporti YPAD fino alla fase iniziale a metà log (O.D. 600nm - 0,4-0,9) di crescita per 3 min a > 800 x g a temperatura ambiente.
  2. Decantare il supernatante, sospendere nuovamente il pellet cellulare in 1 mL di ddH2O sterile e trasferire il contenuto in un tubo di microfugia da 1,7 mL. Pellet le cellule per 3 min a > 800 x g a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente le celle in acetato di litio da 250 mL di 100 mM con pipettatura delicata. Dividere le celle in tubi di microfuga separati per ciascuna delle trasformazioni che verranno eseguite. Utilizzare 50 L del mix di acetato di cellule-litio per trasformazione.
  4. Impostare una combinazione di trasformazioni. Per ciascuna delle trasformazioni aggiungere: 240 L del 50% PEG3350, 36 L di 1,0 M acetato di litio, e 5 L di salmone sperma (o altro vettore) DNA, bollito per 5 min e su ghiaccio.
    NOTA: PEG è molto viscoso. Pipetta e misurare con attenzione. Mescolare mediante pipettatura dopo l'aggiunta di ogni componente prima di andare avanti.
  5. Aggiungere 5 L del plasmide appropriato per ogni trasformazione eseguita. Vortice ogni tubo per mescolare accuratamente. Incubare i campioni a 30 gradi centigradi per 45 minuti. Campioni d'urto termico a 42 gradi centigradi per 10 min.
  6. Cellule di pellet per 3 min a > 800 x g a temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il mix di trasformazione e sospendere nuovamente i campioni in 300 cellule di ddH2O. Pellet ripetendo lo spin sopra, rimuovere con attenzione l'acqua e ri-sospendere i campioni in 200 l di ddHsterile 2O.
  7. Impostare 1/10 e 1/100 diluizioni per ogni ceppo trasformato di lievito.
  8. Utilizzando la piastra tecnica sterile 150 L da ogni campione su piastre di leucina SC per selezionare i plasmidi. Stendere le cellule in modo uniforme e lasciare asciugare la piastra prima di invertire e incubare a 30 gradi centigradi per crescere per 48-72 h.
    NOTA: Una volta generato il ceppo appropriato, esso può essere immagazzinato a lungo termine nel 25% glicerolo a -80 gradi centigradi. La quantificazione del numero di copia presente può essere determinata da diverse metodologie, tra cui qPCR, RNA-FISH o un'altra misuraappropriata 37,38.

5. Determinare la durata cronologica da verificare per la soppressione del fenotipo CLS abbreviata

  1. Testare l'effetto della sovraespressione del soppressore putativo su CLS nel lievito di breve durata, , determinando il numero di unità di formamentosi colonia (CDU) che rimangono in funzione del tempo39.
    NOTA: è necessario impostare questa parte dell'esperimento con i controlli appropriati. Un esperimento tipico confronterà un ceppo di lievito di tipo selvaggio (WT) con il vettore vuoto, WT con il vettore soppressore, il mutante di eliminazione con il vettore vuoto e il mutante di eliminazione con il vettore soppressore.
    1. Prendere una singola colonia del ceppo per studiare e inoculare in supporti SC-LEU. Far crescere la cultura a 30 gradi centigradi per 72 h, con agitazione.
    2. Utilizzando un emocitometro, determinare la concentrazione di cellule presenti nella coltura40.
    3. Diluire un aliquot della coltura, in modo che il risultato sia un numero uniforme di cellule in un volume di acqua sterile di 150 L. Placcare la coltura con la tecnica sterile sulle piastre SC-LEU e crescere a 30 gradi centigradi per 72 h. Queste piastre sono il giorno tre time-point e l'esperimento sarà normalizzato a questo punto di tempo come 100% vitalità39.
      NOTA: il numero di celle deve essere 200-500, sufficientemente grande per l'analisi e un numero gestibile per il conteggio. In questo studio, abbiamo usato 200 cellule per la nostra quantità di placcatura.
    4. Continuare ad incubare le colture di lievito a 30 gradi centigradi, prendendo aliquots regolari e placcatura come descritto al 5.1.3. Continuare questo processo fino a quando i ceppi non sono più vitali, quindi compilare e analizzare i risultati.
      NOTA: l'elenco completo dei ceppi utilizzati in questo studio si trova nella tabella 3.

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Representative Results

Poiché ci sono rapporti contrastanti sul ruolo di SIR2 durante l'invecchiamento, abbiamo scelto questo gene per lo studio come un potenziale soppressore del fenotipo CLS26del mutante atg1 . Il ruolo di SIR2 è alquanto controverso, con rapporti contrastanti sul suo ruolo nell'estensione di CLS, tuttavia è stato chiaramente collegato ad un aumento di CLS in almeno uno sfondo di lievito, con un ruolo sia nell'autofagia che nella mitofagia22,31,32,41.

La nostra scelta di vettore plasmide è il vettore shuttle pRS315, che è stato costruito per la facilità di manipolazione genetica, propagazione, e la manutenzione sia in lievito in erba e batteri42. Questo vettore contiene il marcatore nutrizionale LEU2, i promotori T7 e T3, ed è un vettore centromerico (CEN) per il passaggio stabile durante la divisionecellulare 42. La stabilità di questo vettore tra le divisioni cellulari mitotiche era più desiderabile rispetto ai vettori isogenici che differivano dal marcatorenutrizionale 42. Il vettore pRS315 contiene anche una sequenza di replicatura autonoma, che combinata con il CEN mantiene bassi, livelli di plasmide coerenti all'interno (e attraverso) una popolazione cellulare43.

Il gene SIR2 e la corrispondente sequenza di DNA della regione genomica a monte (5' UTR) e a valle (3' UTR) sono statiottenuti 33. Per garantire che il gene trascritto contenesse i componenti necessari per la stabilità e la traduzione del prodotto proteico, la nostra finestra iniziale era di 400 bp. Questa finestra si è espansa a 500 bp in base alla composizione nucleotide all'interno di questa area, poiché la finestra iniziale non ha comportato una regione favorevole per la clonazione. Abbiamo progettato primer PCR che consentono l'amplificazione del gene e le corrispondenti regioniregolatorie,incorporando siti di digestione di restrizione e una sporgenza a quattro nucleotidi aggiunta alla fine 5' di ogni primer ( Figura 1A ). La riuscita amplificazione di questa area da PCR comporta un frammento di DNA di 2.469 kb di lunghezza (Figura 1B).

SIR2 è stato amplificato dalla PCR, e i prodotti di questa reazione sono stati visivi da elettroforesi gel agarose e confrontati con una reazione di controllo senza modello (Figura 2). L'amplificazione SIR2 è stata osservata in entrambe le corsie con il modello di DNA genomico; le due reazioni sono state in comune e concentrate. È stata eseguita la purificazione plasmida di pRS315 da E. coli, che sono stati visualizzati dall'elettroforesi gel agarose (Figura 3). I campioni sono stati quantificati dalla spettrofotometria, e la preparazione plasmide del #2 trasformatore è stata selezionata per la clonazione, che aveva una concentrazione di 256 ng/L (OD260/280 x 1,87).

Il plasmide e l'inserto sono stati digeriti con HindIII e SacII, ligati tra loro e trasformati in E. coli per l'amplificazione e lo screening. La scelta di questi siti di digestione di restrizione ha richiesto la verifica che nessuno dei due siti è presente nella regione da clonare. La presenza di uno (o di entrambi) siti richiederebbe l'uso di enzimi di restrizione alternativi per clonare il gene SIR2, e ce ne sono diversi tra cui scegliere nella regione polilinker pRS31542.

Abbiamo proiettato i trasformatori per la corretta creazione del vettore pRS315-SIR2 per escissione dell'inserto per doppia digestione con HindIII e SacII seguito dalla visualizzazione sul gel di agarose (Figura 4). Il vettore pRS315-SIR2 è stato trasformato sia in tipo selvaggio che in mutante atg1 per generare i ceppi utilizzati per la caratterizzazione CLS. Il vettore pRS315 è un vettore classico che è stato ampiamente utilizzato e caratterizzato, che è uno dei vantaggi di questo particolare sistema. Il numero di copia relativo è stato determinato da qPCR (Figura 5) come descritto inprecedenza 37. Ciò ha comportato un modesto aumento del numero di copie da una media di una copia per cella a una media di 2,5 copie per cella, coerentemente con i rapportiprecedenti 42.

La durata cronologica di atg1 -pRS315-SIR2 è stata confrontata con un ceppo isogenico di lievito contenente un vettore vuoto invece di un inserto (atg1 -pRS315). Le colture di invecchiamento sono state placcate a diluizioni coerenti ed equivalenti e sono state coltivate per 72 h a 30 gradi centigradi prima dell'imaging e della quantificazione (Figura 6A). Il numero di colonie che formano unità che sono cresciute è stato determinato e normalizzato al giorno 3 time-point (il primo preso) e tracciato (Figura 6B). Noi riferiamo che non esiste alcun effetto statisticamente significativo del nostro costrutto SIR2 sulla CLS nello sfondo atg1 . Inoltre, non è stata nota alcuna estensione di CLS in background wild-type – dove la nostra modesta sovraespressione SIR2 ha effettivamente prodotto una diminuzione di CLS rispetto al controllo vettoriale vuoto (Figura 6B).

Figure 1
Figura 1: progettazione del costrutto per clonare SIR2. La regione genomica che affianca il gene SIR2 è stata utilizzata per progettare primer PCR per l'amplificazione e la clonazione del gene. I primers contengono 21nt di complementarità alla regione 419 coppie di base a monte del gene (FP) e 351 coppie di base a valle del gene (RP), il sito di digestione di restrizione HindIII o SacII, e uno sbalzo a quattro nucleotidi (A). Lo schema dell'amplificatore creato da PCR utilizzando i primer progettati per clonare la regione genica SIR2, insieme alle dimensioni corrispondenti (B). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: amplificazione PCR del gene SIR2 visualizzata dall'elettroforesi gel. I prodotti di una reazione PCR ad alta fedeltà per amplificare il gene SIR2 sono stati visualizzati su un gel di agarose dell'1% (con bromuro di etidio). Le reazioni duplicate sono state eseguite utilizzando il lievito gDNA come modello (-) e confrontate con un controllo senza modello (-). La dimensione dell'amplificatore prevista è 2.469 kb. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Visualizzazione del vettore pRS315 per elettroforesi gel. Le reazioni plasmidi purificate duplicate sono state eseguite e visualizzate su un gel di agarose dell'1% (con bromuro di etidio). La dimensione del vettore pRS315 è 6.018 kb. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Screening per il vettore pRS315-SIR2 mediante elettroforesi gel. I potenziali trasformatori che contengono il vettore pRS315-SIR2 sono stati digeriti con HindIII e SacII, e poi visualizzati su un gel di agarose dell'1% (con bromuro di ethidio). La creazione del vettore produrrà una banda a 5,963 kb (la spina dorsale pRS315) e 2,461 kb (il gene SIR2). Due potenziali trasformatori sono stati confrontati con un controllo vettoriale vuoto. Transformant #1 mostra il modello previsto dal vettore pRS315-SIR2. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Il vettore pRS315-SIR2 aumenta il numero di copia SIR2 in uno sfondo di lievito di tipo selvaggio. Il numero di copie SIR2 presenti nel background genetico di tipo selvaggio è stato determinato dalla PCR quantitativa. I valori sono stati calcolati utilizzando ilmetodo 2 --Ct con ACT1 selezionato come controllo interno44. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Durata cronologica di atg1 -pRS315-SIR2. LA CLS è stata determinata dalla quantificazione del numero di unità formanti da colonia praticabili in funzione del tempo. Le colture di invecchiamento del lievito sono state diluite a 500 cellule/piastra e coltivate per 72 h a 30 gradi centigradi prima dell'imaging (A). I dati sono stati normalizzati al giorno tre ora e tracciati per la visualizzazione (B). EV è un vettore vuoto (pRS315 senza inserimento) e SIR2O/E contiene l'inserto (pRS315-SIR2). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componente Concentrazione finale
Acqua senza nuclease Q.S. al volume finale
Buffer 1X
dNTPs (conc: 10mM) 200uM
Primer in avanti (conc: 10M) 0,5 M
Primer inverso(conc: 10M) 0,5 M
Modello gDNA 100-200ng
Polimerasi HF PCR a 1 unità/50 L

Tabella 1: componenti di reazione PCR.

Passo Temp Ore
Denaturazione iniziale 98 gradi centigradi 2 minuti
Ciclismo 98 gradi centigradi 30s
(35 cicli) 53-60 gradi centigradi (specifico dell'primer) 30s
72 gradi centigradi 30s per kB
Estensione finale 72 gradi centigradi 5-10m
Tenere 10oC Indefinitamente

Tabella 2: condizioni di ciclismo PCR.

Ceppo: genitore: Ploidy:
MATa his3 1 leu2 0 met1 5 ura3 ura3 s0 - pRS315 (vettore LEU) DI4741 Aploide
MATa his3 1 leu2 s0 met15 ò0 ura3 0 : pRS315-SIR2 O/E (vettore LEU) DI4741 Aploide
MATa his3 1 leu2 s0 met15 ura3 ura3 s 0atg1 , pRS315 vettore vuoto (vettore LEU) DI4741 Aploide
MATa his3 1 leu2 0 met1 5 ura3 ura3 , 0atg1 , pRS315-SIR2 O/E (vettore LEU) DI4741 Aploide

Tabella 3: Ceppi utilizzati.

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Discussion

Svelare la genetica dell'invecchiamento è una sfida difficile, con molte opportunità per ulteriori studi che possono potenzialmente fornire informazioni significative sulle complesse interazioni esistenti. Ci sono molti metodi che consentono la rapida generazione di mutanti in perdita di funzione per lo studio di ceppi nulli di lievito45,46. Questo metodo presenta un approccio semplice per identificare e clonare i geni sul vettore pRS315 per gli studi di soppressori di sovraespressione. Un vantaggio di questo approccio è che questo permette una sovraespressione moderata da un vettore stabile, che può evitare eventuali sfide impreviste che potrebbero derivare dall'uso di un'integrazione cromosomica47. Questo approccio è presentato in modo da incoraggiare il reclutamento di ricercatori a vari livelli della loro carriera scientifica, con molti degli autori di questa pubblicazione che contribuiscono attraverso l'identificazione e la clonazione dei soppressori putativi come componente della loro formazione.

In questo lavoro, dimostriamo come utilizzare la ricchezza di dati disponibili raccolti nel database del genoma di Saccharomyces per identificare un fenotipo desiderato, in questo caso collegamenti genetici a una durata cronologica alterata. Abbiamo clonato SIR2 nel vettore pRS315 per testare l'effetto di sovraespressione moderata su CLS del mutante carente di autofagia di breve durata, atg1. Durante un periodo di invecchiamento di 17 giorni non si è visto alcun effetto sulla CLS nel mutante autofagia e una CLS più accelerata vista in background wild-type. Questo può essere interpretato come il modesto aumento del numero di copie in SIR2 non ha alcun effetto su CLS nello sfondo mutante atg1 . Poiché l'ATG1 è un fattore di trascrizione necessario per indurre l'autofagia, le nostre conclusioni sono limitate all'avvio del percorso dell'autofagia. Inoltre, non vediamo un aumento della CLS nel nostro background genetico di tipo selvaggio - forse suggerendo che CLS estendendo i fenotipi di aumentare il numero di copie di SIR2 può essere specifico per determinati background genetici e non sono onnipresenti.

I passaggi critici all'interno di questo protocollo includono la corretta progettazione del costrutto SIR2 da clonare e le condizioni appropriate per ottimizzare la legatura. La risoluzione di questi passaggi potrebbe essere necessaria per clonare un gene per la caratterizzazione tramite il test CLS. Una limitazione di questo approccio è che seleziona per le celle che mantengono il plasmide e che possono ri-entrare nel ciclo cellulare. Mentre questo è un marcatore di fitness, è essenziale per lo studio di follow-up utilizzando approcci complementari per sezionare il fenotipo di invecchiamento. Questo può includere la quantificazione della vitalità cellulare mediante colorazione vitale e approcci che non dipendono dalla ritenzione plasmide. Ci sono ottimi metodi disponibili che dimostrano un'ulteriore caratterizzazione della CLS attraverso la quantificazione della crescita delle cellule invecchiate o la caratterizzazione della durata replicativa48,49,50. Inoltre, il nostro approccio è limitato all'identificazione di interazioni non letali e sarebbe difficile differenziare un tentativo fallito di clonare un gene con un tentativo riuscito di clonare un gene che si traduce in un fenotipo letale.

Il nostro approccio è utile per l'identificazione delle interazioni genetiche gen-siotiche per ulteriori studi. È semplice e diretto, e finora abbiamo usato questo approccio per clonare SIR2, AIF1, UBI4e MDH1 e stiamo seguendo gli studi con ciascuno di questi costrutti. Questa tecnica può essere applicata per caratterizzare qualsiasi numero di interazioni genetiche seguendo la struttura del protocollo in questo lavoro.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

James T. Arnone desidera riconoscere il sostegno degli studenti del corso Recombinant DNA Technologies nel 2017 e 2018 presso la William Paterson University che sono stati coinvolti in questo progetto fin dalla sua nascita, ma i cui sforzi non hanno superato la soglia per la paternità: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rector, Aida Shono e Matthew So. Siete grandi scienziati e mi mancate tutti!

Gli autori vorrebbero riconoscere il prezioso supporto della tecnologia di istruzione e ricerca presso la William Paterson University per il loro aiuto: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella e Henry Heinitsh. Gli autori vorrebbero anche riconoscere l'Ufficio del Provost for ART supporto, l'Ufficio del Decano e il Centro di Ricerca nel Collegio di Scienza e Salute il loro sostegno a questo lavoro, e il Dipartimento di Biologia per sostenere questo progetto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungal/Bacterial DNA kit Zymo Research D6005
HindIIIHF enzyme New England Biolabs R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Plasmid miniprep kit Qiagen 12123
SacII enzyme New England Biolabs R0157S
Salmon sperm DNA Thermofisher AM9680
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S

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Dix, C., Sgro, S., Patel, A., Perrotta, C., Eldabagh, N., Lomauro, K. L., Miguez, F. W., Chohan, P., Jariwala, C., Arnone, J. T. A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (163), e61506, doi:10.3791/61506 (2020).

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