Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hele dyrets avbildning av Drosophila melanogaster ved hjelp av mikrocomputert tomografi

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61515
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

Summary

En protokoll presenteres som gjør det mulig å visualisere intakt Drosophila melanogaster når som helst i utviklingen ved hjelp av mikrocomputert tomografi.

Abstract

Biomedisinske bildeverktøy tillater undersøkelse av molekylære mekanismer på tvers av romlige skalaer, fra gener til organismer. Drosophila melanogaster, en godt karakterisert modellorganisme, har hatt nytte av bruk av lys og elektronmikroskopi for å forstå genfunksjonen på nivå med celler og vev. Anvendelsen av bildeplattformer som muliggjør forståelse av genfunksjon på nivået av hele den intakte organismen, vil ytterligere forbedre vår kunnskap om genetiske mekanismer. Her presenteres en hel dyreavbildningsmetode som skisserer trinnene som trengs for å visualisere Drosophila på et hvilket som helst utviklingsstadium ved hjelp av mikrocomputert tomografi (μ-CT). Fordelene med μ-CT inkluderer kommersielt tilgjengelig instrumentering og minimal praktisk tid til å produsere nøyaktig 3D-informasjon ved mikronnivåoppløsning uten behov for vevsavhandling eller ryddingsmetoder. Sammen med programvare som akselererer bildeanalyse og 3D-gjengivelse, kan detaljert morfometrisk analyse av ethvert vev eller organsystem utføres for å bedre forstå mekanismer for utvikling, fysiologi og anatomi for både beskrivende og hypotesetestingsstudier. Ved å bruke en bildearbeidsflyt som omfatter bruk av elektronmikroskopi, lysmikroskopi og μ-CT, kan det utføres en grundig evaluering av genfunksjonen, og dermed øke nytten av denne kraftige modellorganismen.

Introduction

Imaging metoder som tillater detaljert undersøkelse av indre strukturer av et objekt uten å ødelegge sin generelle 3D-arkitektur har vist seg å være allment gunstig for en rekke forskjellige disipliner, inkludert fysikk, engineering, materialvitenskap, arkeologi, paleontologi, geologi og biologi1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Blant disse ikke-ødeleggende avbildningsmetodene er røntgenbaserte plattformer spesielt nyttige på grunn av røntgenstrålenes evne til å trenge inn i mange forskjellige prøvetyper og materialer med minimal spredning sammenlignet med synlige lysbølger. Beregnet tomografi (CT), mikrocomputert tomografi (μ-CT), nanocomputert tomografi (Nano-CT) og Synkrotronmikrotomografi har derfor dukket opp som den primære teknologien for røntgenbasert bildebehandling av prøver fra meter til mikron, med millimeter til submikronoppløsningsfunksjoner10,11,12,13,14.

Selv om disse plattformene er forskjellige i design, røntgengeometri og komponenter for å balansere prøvestørrelse og oppløsning, er de alle avhengige av det samme grunnleggende prinsippet for bildeopptak: en kilde til røntgenstråler som beveger seg gjennom objektet og fanges opp av en detektor. Differensial demping av røntgenstrålen når den passerer gjennom varierende tettheter i objektet genererer bildekontrast. 3D-data oppnås ved å rotere enten prøven eller detektoren, og samler inn en serie 2D-projeksjonsbilder som deretter rekonstrueres ved hjelp av algoritmer til tomogrammer som inneholder 3D-informasjon hvis oppløsning er isotropisk i x,y,z15. For mange benktop-μ-CT-skannere som bruker en røntgengeometri med kjeglestråle for å projisere røntgenbilder på objektet som blir avbildet, brukes Feldkamp-algoritmen til å rekonstruere objektet nøyaktig med minimale feil16.

Oppløsningen til en gitt plattform bestemmes hovedsakelig av systemparametere som størrelsen på røntgenstrålen (spotstørrelse), skannergeometri (avstand fra objekt til røntgenkilde), størrelsen på pikslene på detektoren og rekonstruksjonsalgoritmen som brukes. Andre faktorer, for eksempel skannervibrasjoner, røntgenstrålesvingninger, prøvebevegelse og materialtype eller kjemisk flekk som brukes til å visualisere objektet, kan også påvirke romlig oppløsning betydelig under virkelige bildebehandlingskondidasjoner15.

For biomedisinske anvendelser har CT og μ-CT spilt en nøkkelrolle i å fremme vår forståelse av anatomi, fysiologi, utvikling og sykdomsmekanismer, som fungerer som et verktøy for både menneskelige pasientdiagnoser og som en preklinisk bildeplattform for modellorganismer17,18. For eksempel bruker Mouse International Phenotyping Consortium, hvis mål er å identifisere funksjonen til hvert gen i musegenomet, μ-CT som en del av deres fenotyping rørledning19. Resultatene deres har vært avgjørende for å forstå gener involvert i utvikling og sykdomsprosesser, samtidig som de fungerer som et atlas for museanatomi og utvikling20. Andre modellorganismer, som sebrafisk og rotter, har også fullt ut omfavnet bruken av μ-CT for å utføre hele dyr fenotyping av en rekke genmutanter17,21,22,23.

Fordelen med å kombinere hele dyreavbildning med modellorganismer er at en mekanistisk forståelse av genfunksjon for en gitt biologisk prosess kan utforskes fullt ut. Dette er mulig på grunn av de godt karakteriserte genomene og mange genetiske verktøy som er tilgjengelige i modellorganismer som muliggjør presis manipulering av genfunksjon ved distinkte utviklingstidspunkter, spesifikke vev, individuelle celler og til og med subcellulære organeller. Disse inkluderer binære uttrykkssystemer som UAS / GAL4-systemet (og dets mange derivater), CRISPR / Cas9 og RNAi24,25,26. Når disse genetiske verktøyene brukes sammen med en kraftig bilderørledning bestående av elektronmikroskopi, lysmikroskopi (fluorescerende og ikke-fluorescerende), og hele dyreavbildninger som μ-CT, kan en grundig evaluering av molekyler, celler, vev, organer og hele organismen oppnås, noe som gir en mye dypere forståelse av genfunksjonen.

Denne protokollen fokuserer på bruk av μ-CT i den ikke-pattedyrmodellorganismen Drosophila melanogaster, hvis utallige genetiske verktøy har bidratt til å belyse mange molekylæremekanismer 26,27. Det ble vedtatt fra tidligere protokoller i ikke-modellinsekter1,28,29,30,31,32, og bygger av tidligere μ-CT-studier i Drosophila for å etablere en standardisert protokoll for bruk i dette dyret33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Trinnene for vellykket prøvepreparering, avbildning og analyse av fly μ-CT-datasett ved hjelp av kommersielt tilgjengelige skannere er skissert. Med denne protokollen kan alle utviklingsstadier av fluen visualiseres med høy oppløsning for både beskrivende og hypotesetestingsstudier, inkludert taksonomi, anatomi, utvikling, fysiologi og sykdom27. Denne protokollen vil også være nyttig for avbildning nesten alle insekt og til og med ikke-levende materialer som krever kjemisk farging for bildekontrast for å forbedre visualiseringen ved å μ-CT.

Protocol

1. Prøvevalg og neglebåndforberedelse

  1. Velg riktig utviklingstidspunkt (embryo, larve, pupa eller voksen) for avbildning.
    1. For embryonale stadier, burhunner på druejuice agarplater smurt med gjærpasta og samle egg hver 30-60 min. La disse embryoene utvikle seg ved 25 °C til riktig stadium er nådd.
    2. For larvestadier, samle første og andre instars fra tidsinntatte embryosamlingsforsøk. Velg direkte vandrende 3rd instars fra siden av mat hetteglasset under ikke-trengsel forhold.
    3. For pupal timing, samle hvite pre-pupper (inverterte spirakler) og noter deg tiden da kutiklet begynner å brune. Dyr vil utvikle seg gjennom 15 stadier av pupal utvikling på definerte tidspunkter etter kutikal og kan samles tilsvarende42.
    4. Samle voksne som jomfruer etter eklosjon og la det alder i et hetteglass med mat i en nødvendig tidsperiode (f.eks. 5 dager for fullstendig tarmutvikling).
  2. Overfør 5-50 dyr til et 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml 0,5% Triton X-100 i 1x fosfat bufret saltvann (0,5% PBST). Mens du banker på røret med jevne mellomrom på benken, inkuberer du i 5 minutter ved romtemperatur (RT) for å hjelpe til med å fjerne det hydrofobe belegget og la dyrene bli helt nedsenket.
    1. For embryonale, larv- og puppestadier, arrester videre utvikling ved å plassere røret i en varmeblokk satt til 100 °C i 20 s etterfulgt av kjøling ved RT i 5 minutter.
      MERK: Dyr kan også blinke frosset i flytende nitrogen37.

2. Fiksering og farging

  1. Fjern 0,5 % PBST og tilsett 1 ml av Bouins løsning. Trykk på røret for å sikre at dyrene er helt nedsenket.
    FORSIKTIG: Bouins løsning inneholder formaldehyd. Det kan forårsake akutt toksisitet for hud og øyne hvis de søles og kan være dødelig hvis de svelges. Bruk hansker, vernebriller og labfrakk ved håndtering.
    MERK: Ytterligere fikseringsteknikker kan også brukes, for eksempel bruk av etanol. Fordelene ved andre fikseringer er beskrevet i detalj i ref.1,30.
    1. For embryo- og voksenprøver, inkuber på benken i 16-20 timer ved RT.
    2. For larv- og puppeprøver, fest dyr i 2 timer ved RT. Kast Bouins løsning og vask med 1x PBS i 5 min tre ganger. Overfør til en multi-brønn dissekering parabolen som inneholder 1x PBS og bruk en liten minutien pinne festet til en holder for å stikke et hull i fremre og bakre kutikalle være forsiktig med å ikke forstyrre noen underliggende bløtvev.
    3. Overfør larval- og pupalprøver tilbake til et mikrofugerør og tilsett 1 ml fersk Bouins løsning. Inkuber på benken i 24 timer ved RT.
  2. Fjern Bouins løsnings- og vaskeprøve i 30 min med 1 ml μ-CT vaskebuffer (0,1 M na2HPO4,1,8 % sukrose) eller 1x PBS tre ganger.
  3. Tilsett 1 ml av riktig fargeløsning og inkuber på benken i 2-7 dager.
    MERK: Flekkvalg vil avhenge av mange faktorer, men er generelt en balanse mellom penetrasjon, inkubasjonstid og oppløsning. Generelt gir fosfotungstisk syre (PTA) overlegen kontrast og oppløsning av bløtvev, men krever mekanisk forstyrrelse av kutiklet og lengre inkubasjonstider. Fordelene ved ulike flekktyper er beskrevet i detalj i ref.1.
    1. For jodfarging, bruk 1 ml 0,1 N I2KI (Lugol Solution). Inkuber i 2 dager. Ingen ytterligere forstyrrelse av den voksne kutiklen er nødvendig.
    2. Ved farging av fosfotungstisk syre (PTA) brukes 1 ml av en oppløsning på 0,5 % (m/v) fortynnet i vann. Forstyrre den voksne kutiklen, enten ved å fjerne munnstykkene eller stikke hull i thorax eller abdominal kutikalle med en liten minutienpinne festet til en holder. Inkuber i 5-7 dager, eller lenger hvis vevsfarging virker ikke-homogen.
  4. Vask med 1 ml ultrarent vann eller 1x PBS i 30 min. Gjenta vasketrinnet. Oppbevar dyr på RT i ultrarent vann eller 1x PBS i opptil en måned.
  5. Hvis dyr skal skannes mens de er hydrert, går du direkte til avsnitt 4. Hvis det er behov for lengre bevaring av prøven, går du videre til paragraf 3 i protokollen.

3. Kritisk punkttørking (valgfritt)

  1. Utfør en dehydreringsserie av etanol (EtOH) på prøven: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Tilsett 1 ml etOH-oppløsning og inkuber på benken i 1 time for hver konsentrasjon i den angitte rekkefølgen.
  2. Etter den siste 100% EtOH suge, erstatte med frisk 100% EtOH og la prøve inkubere på benken over natten.
  3. Utfør kritisk punkttørking av prøver i henhold til produsentens instruksjoner.
    MERK: Elektronmikroskopianlegg har generelt en kritisk tørkemaskin (se Materialfortegnelse) som vil utføre tørking av prøven etter EtOH-dehydrering.

4. Prøvemontering

  1. For kritisk punkttørkede prøver, varme limprøver til en insektpinne eller annen holder designet for å passe inn i chucken på det roterende stadiet eller plassere det i et plast- eller glasskapillært rør (~ 1,0-1,25 mm indre diameter).
  2. For hydrerte prøver, fyll en P10 pipettespiss med vann og fest den smale enden ved enten varmeforsegling eller parafinfilm for å forhindre lekkasje.
    FORSIKTIG: Pass på at du vikler eventuelle tilkoblinger tett slik at vann ikke lekker ut i skanneren og forårsaker skade.
    1. Overfør en enkelt prøve til pipettespissen ved hjelp av tang. Bruk en lang, slank gjenstand, for eksempel en kjedelig 20 G nål eller en annen pipettespiss, skyv prøven forsiktig ned spissen til den bare kommer i kontakt med veggen på pipetspissen for å holde den på plass.
    2. Dekk åpningen av pipettespissen med parafinfilm for å forhindre fordampning av vann under lange skanninger.
    3. Monter P10-pipetten med en holder som er utformet for å passe inn i chucken på det roterende stadiet (Figur 1A-C).

5. Skanning

  1. Utfør eventuelle nødvendige kalibreringer av maskinen før bildebehandling for dagen.
    MERK: Disse vil variere fra produsent til produsent, og det anbefales å rådføre seg med en applikasjonsspesialist for å finne de riktige trinnene. Se materiallisten hvis du vil ha spesifikk informasjon om oppsettet og programvaren som brukes i denne protokollen. Vanligvis gir kalibreringer som en sceneaksejustering for å fjerne enhver "wobble" knyttet til chucken utenfor aksen i forhold til det roterende stadiet og utføre flatfeltkorrigeringer for å sikre ensartede bakgrunnspikselintensiteter på kameraet optimale bildeforhold for den beste oppløsningen og datasettene som kan sammenlignes på tvers av flere skanninger.
  2. Åpne skannerdøren for å få tilgang til den roterende scenechucken ved å klikke på'Åpnedør'-ikonet øverst til venstre i programvaren. Fest prøven ved å stramme kragen rundt bunnen av prøveholderen.
    MERK: Bruk skånsomt trykk når du fester prøven til den roterende chucken for å opprettholde skannerjusteringen.
  3. Angi skanneparametere i programvaren som kontrollerer skanneren for optimal oppløsning og kontrast.
    MERK: Disse må bestemmes empirisk ettersom røntgenkilden, kameraet/detektoren og geometrien til hver skanner vil variere fra produsent til produsent. Tilleggsinformasjon for å velge de beste parametrene finner du også her43, samt fra produsentens applikasjonsspesialist.
    1. Åpne strømkontrollen for røntgenkilde (Alternativer | Røntgenkilde). Bruk glidebryterne til å stille inn røntgenspenning til 30-40 kV og strøm til 100-110 μA for å produsere en røntgenstråle med 3-4 W strøm og en liten spotstørrelse for forbedret oppløsning.
    2. Bruke dialogboksen Anskaffelsesmodi (Alternativer | Anskaffelsesmodus )for å stille inn kameraets eksponeringstid til 500-800 ms.
    3. Bruk glidebryteren ved siden av forstørrelsesglassikonet nederst i programvaren for å angi ønsket bildepikselstørrelse (~700 nm til 4 μm), avhengig av kamerainnstillinger og posisjon. Dette bestemmer hvor mange projeksjonsbilder som hentes under skanningen, med flere projeksjoner som fører til forbedret oppløsning, men lengre skannetider (se Representative resultater).
    4. Klikk og dra glidebryteren ved siden av den roterende pilen nederst i programvaren for å flytte prøven langs rotasjonsbanen på 360°. Kontroller at eksemplet forblir innenfor synsfeltet.
  4. Klikk på ikonet 'Start anskaffelse' (blått sirkelpilikon) øverst i programvaren. Det vises en dialogboks som gjør det mulig å angi flere skanneparametere, og filen og utdatamappen der skanningen skal lagres, kan navngis.
    1. Sett den tilfeldige bevegelsen til 10 og gjennomsnittlig 4-6 bilder. Rotasjonstrinnet beregnes automatisk avhengig av kamerainnstillingene som brukes.
  5. Start skanningen ved å klikkeOKi dialogboksen Anskaffelse . Det vises en annen dialogboks for fremdriftslinjen som viser skannetiden. Skanneren vil nå hente en serie projeksjonsbilder (figur 1D) av prøven langs rotasjonsbanen og trenger ikke overvåkes.

6. Rekonstruksjon

  1. Hvis du vil generere tomogrammer, utfører du bilderekonstruksjon ved hjelp av projeksjonsbildene.
    MERK: Mens nesten all rekonstruksjon av bilder fra kjeglestrålegeometriskannere er avhengige av Feldkamp-algoritmen16, vil individuelle parametere variere avhengig av programvareimplementeringen og bør bestemmes empirisk. Følgende innstillinger, som er spesifikke for en kommersielt tilgjengelig programvare (se Tabell over materialer), kan brukes som en veiledning. Parametere som feiljusteringskompensasjon, reduksjon av ringartefakter og stråleherdingskorrigering (0 % for de fleste flueprøver) utføres på en iterativ måte for å velge de beste verdiene for den endelige rekonstruksjonen. For avanserte brukere som ønsker mer kontroll over rekonstruksjonsprosessen, se MATLAB-grensesnittet her44.
  2. Utføre en innledende bildejustering ved å bruke en skiftkorrigeringsalgoritme basert på referanseskanning45 (Handlinger | X/Y-justering med en referanseskanning).
  3. Finjuster hver rekonstruksjonsparameter (Start | Finjustering). Dette aktiverer dialogboksen Parameter finjustering.
    1. Finjuster justeringen ved å klikkeNestetilEtterjustering. Sett antall gjentakelser til fem og parametertrinnet til 1,0. Klikk Start for å generere en serie forhåndsvisninger. Merk bildet som er riktig justert.
      MERK: Et riktig justert bilde vil ikke være uskarpt eller vise "skjærende" artefakter der en ellers kontinuerlig struktur (for eksempel neglebåndet) ser ut til å være delt.
    2. Finjuster reduksjonen av ringeartefakten ved å klikke ved siden av den. Sett antall gjentakelser til fem og parametertrinnet til 1,0. Klikk Start for å generere en serie forhåndsvisninger. Velg bildet som inneholder færrest ringeringer.
  4. Når parameterne ovenfor er optimalisert for å gi det beste bildet, må du sørge for at de valgte verdiene er riktig representert i kategorien Innstillinger (Innstillinger).
  5. Juster eventuelle endelige lysstyrke- og kontrastverdier ved hjelp av histogrammet, filparametere som bitdybde og -type, og bruk en region av interesse (ROI) som bare omfatter strukturene av interesse (f.eks. bare hele fly eller hode) for å redusere beregningstiden (Output).
  6. Start rekonstruksjonen (Start | Start). Hvis det kreves flere rekonstruksjoner, legger du til gjeldende bilde i den satsvise behandling (Start | Legg til i bunke) og gjenta trinn 6.2-6.5 for de gjenværende bildene.

7. Bildeanalyse

  1. Visualiser tomogrammer i to og tre dimensjoner og utfør ytterligere morfometrisk analyse med freeware eller kommersiell programvare.
    MERK: Detaljer om programvaren som brukes i denne protokollen, er tilgjengelig i materiallisten. Andre programvarepakker som er i stand til å evaluere μ-CT-datasett inkluderer freeware-alternativer som FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47og ITK-SNAP48, pluss kommersiell programvare (f.eks. Andre programmer som bruker maskinlæringsbaserte algoritmer for å halvautomatere segmenteringsprosessen, kan bidra til åøke hastigheten på arbeidsflytene og redusere menneskelig skjevhet (f.eks.
  2. Importer tomogramfilen til programvaren (Fil | Importere bildefiler). Metadataene som er knyttet til filen, skal automatisk lastes inn i vinduet, men kan også angis manuelt slik at de samsvarer med bildeegenskapene.
  3. Hvis du vil segmentere en interessestruktur, klikker du på fanebladet Segment til venstre på skjermen. Opprett et nytt område av interesse (ROI) (Grunnleggende | Ny), gi den et navn og velg en passende farge.
  4. Definer terskelområdet som omfatter rentestrukturen (Område | Definer område) ved hjelp av glidebryteren.
  5. Velg en passende 2D- eller 3D ROI-malerverktøymodus (ROI Painter | Paintbrush-alternativet).
  6. Å male et område definert av terskelen; trykk og hold nede CTRL-tasten mens du holder nede venstre musetast. Hvis du vil fjerne et område, trykker og holder du nede SKIFT-tasten mens du holder nede venstre musetast.
    MERK: Hvis du vil endre størrelsen på sirkulær eller firkantet pensel, ruller du ganske enkelt musehjulet mens du holder nede enten Ctrl- eller Skift-tastene.
  7. Fortsett å male strukturen av interesse gjennom hele Z-volumet.
  8. Konvertere avkastningen til et nett (Eksporter | Til et mesh-| Normal).
  9. nettingoverlegget ved å klikke på det i Dataegenskaper og Innstillinger-panelet øverst til høyre.
  10. Jevne ut nettet med et passende antall gjentakelser (Glatt netting | gjentakelser).
    MERK: Bruk samme maskeringsutjevningsverdi for alle bilder som skal sammenlignes.
  11. Kontroller at målingene av netting-ROI (Overflateområde, Volum og Feret diameter) vises i informasjonspanelet til høyre på skjermen for grunnleggende morfometrisk analyse. Ytterligere analyse kan utføres ved hjelp av Objektanalysemodul.
  12. Gjengi nettobjekt og hele tomogrambildet og visualiser i 3D. Bruk den innebygde Movie Maker til å generere en video av objektet (Høyreklikk | Vis Movie Maker) ved hjelp av individuelle rammer fra fremviseren (Legg til nøkkel).
    MERK: Flere visuelle forbedringer kan også brukes på filmen ved hjelp av den visuelle effektfanen i høyre panel for å markere visse funksjoner, etc.
  13. Eksporter videoen for visning ved hjelp av Knappen Eksporter animasjon i Movie Maker.

Representative Results

Figur 2 viser bilder av et embryo, 3rd instar larver, pupper på pharate voksen scene (P7), og en voksen kvinne flyr farget med jod og avbildet hydrert i vann ved hjelp av en kommersiell stasjonær skanner. Utmerket bevaring og til og med farging av delikat vev er tydelig, slik at alle store organer lett kan identifiseres og brukes til morfometrisk analyse og 3D-visualisering.

Vanligvis gir skanninger som får færre projeksjonsbilder av prøven, lavere oppløsning enn skanninger som får flere projeksjonsbilder, og avveiningen er tid brukt på skanning. Selv om skannetidene vil variere etter instrument og andre skanneparametere, tar skanninger som får noen hundre projeksjoner (~ 3 μm bildepikselstørrelse) omtrent 30 minutter per prøve, mens skanninger som består av tusenvis av projeksjonsbilder (700 nm-1,25 μm bildepikselstørrelse) kan ta 8-16 timer. En sammenligning av samme voksen fly hodeplagg tatt i både 'sakte' (tusenvis av projeksjoner) og 'rask' (hundrevis av projeksjoner) skannemodus vises i figur 3. Det er viktig at morfometriske analyser ikke varierer mellom "langsomme" og "raske" skanninger (figur 3C)40. Bilderørledningen vår bruker derfor raske skanninger for å generere en tilstrekkelig stor prøvestørrelse for morfometrisk analyse, og langsomme skanninger for å visualisere eventuelle morfologiske eller anatomiske feil ved høyere oppløsning. Ved hjelp av programvaren (trinn 7) kan ethvert vev eller organsystem av interesse segmenteres og brukes til morfometrisk analyse og visualiseres i 3D ved hjelp av filmskaperen (Movie 1).

Figur 4 viser et eksempel på fluelivet som er farget med PTA og avbildet hydrert (vann) eller etter kritisk punkttørking (CPD) på et røntgenmikroskop (Materialtabell). Detaljene som gis av en kombinasjon av PTA og mulighetene til denne plattformen er lett tydelige i disse bildene, slik at individuelle epitheliaceller i midgut- og sædbuntene i testiklene lett løses. Mens CPD-bildet viser marginalt økt oppløsning sammenlignet med den hydrerte prøven, oppnås bedre bevaring av ultrastruktur av delikat vev (som fettcellene nær neglebåndet) med hydrerte prøver (Film 2).

Figure 1
Figur 1: Oversikt over skannerdesign og prøvemontering for μ-CT. (A) En kommersiell stasjonær μ-CT-skanner. (B) Vis inne i skanneren. Røntgenkilden (til høyre) avgir røntgenbilder som passerer gjennom prøven som er plassert på et roterende stadium (gul pil). Demping av disse røntgenbildene genererer bildekontrast når de passerer gjennom prøven og inn på detektoren, som består av en scintillasjonsskjerm som konverterer røntgenbilder til fotoner og et standard CCD-kamera (venstre). (C) Montering av en voksen fruktflue for hydrert avbildning i vann. Koblingspunktene mellom pipettespissen og messingholderen er pakket inn i parafinfilm for å forhindre lekkasje og potensiell skade på skanneren. Scenechucken er også uthevet. Vær oppmerksom på at pipettespissen ble plassert litt utenfor aksen, noe som førte til lengre skannetid og redusert oppløsning i den endelige rekonstruksjonen. (D) Et enkelt 2D-projeksjonsbilde av en voksen kvinnelig flue; hundrevis til tusenvis av disse projeksjonene er anskaffet under en skanning langs rotasjonsaksen og brukes til rekonstruksjon for å generere tomogrammer som inneholder isotropisk oppløsning og nøyaktig 3D-informasjon. Skalastenger (C) = 2 mm. P, bakre; V, Ventral. Denne figuren er endret fra Schoborg et al.40. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Alle Drosophila melanogaster livssyklusstadier, avbildet av μ-CT. Prøver farget med jod og avbildet hydrert i vann. Vist er et enkelt 2D-stykke. (A) Et embryo som har fullført de tidlige stadiene av gastrulation (stjerne). (B) En tredje instar larve. (C) En P7-pharate voksen under metamorfose. (D) En voksen kvinne. Ulike organer er uthevet: BWM, kroppsveggmuskler; Br, hjerne; Cd, cardia; Cr, beskjære; DLC-er, dorsale langsgående muskler; DVM, dorsale ventrale muskler; E-AD, øye-antenne plate; Em, embryo; FB, fete kropper; FBCer, fete kroppsceller; H, hjerte; Hg, bakgut; La, lamina; L, bein; Mg, midgut; OL, hjerneoptisk lobe; Ov, ovipositor; PC, pupal kutikal; SG, spyttkjertler; VNC, ventral nerve ledning; W, vinge; WD, vingeskive. Skalastenger (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsal; A, Fremre; L, venstre. Skanneparametere: Kilde til prøveavstand (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Kilde til kameraavstand (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Kameraets pikselstørrelse (μm): (A-D) 11,6. Bildepikselstørrelse (μm): (A, D) 1,2, (B) 1,9, (C) 1,7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skanneparametere og bildeoppløsning endrer ikke morfometriske analyser. Et voksenhode skannet ved hjelp av både (A, A') "raske" skannerinnstillinger (hundrevis av projeksjoner) og (B, B') "langsomme" skannerinnstillinger (tusenvis av projeksjoner). Hjernen er skissert i gult. (C) Måling av hjernevolum fra langsomme og raske skanninger. Uthevede strukturer: AL; antenne lobe; CB, sentral hjerne; FB, vifteformet kropp; FCs, fettceller; La, lamina; Lo, lobula; LoP, lobula plate; Jeg, medulla; Re, netthinne. n = 5, Welchs t-test. ns = ikke signifikant. Skalastenger = 100 μm. Skanneparametere: Kilde til prøveavstand (mm): (A) 44,4, (B) 36,5. Kilde til kameraavstand (mm): (A) 348 (B) 350. Kameraets pikselstørrelse (μm): (A-B) 11,6. Bildepikselstørrelse (μm): (A) 2,95, (B) 1,2. Denne figuren er endret fra Schoborg et al.40. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Drosophila melanogaster mage avbildet av røntgenmikroskopi. Magene ble farget med 0,5% PTA og avbildet hydrert (vann) eller etter kritisk punkttørking (CPD). (A) Kritisk punkt Tørket mage, vist fra YZ-perspektivet og (A') XZ-perspektivet. (B) Hydrert mage, vist fra YZ-perspektivet og (B') XZ-perspektivet. Ulike organer er uthevet: FC, fettceller; Hg, bakgut; Mg, Midgut; SP, sædpumpe; Te, Testikler. Skalastenger (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Fremre; L, venstre. Skanneparametere: Kilde til prøveavstand (mm): (A) 6,7, (B) 7. Kilde til kameraavstand (mm): (A) 28 (B) 29,5. Målsetting: (A-B) 4X. Bildepikselstørrelse (μm): (A-B) 0,65. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Film 1: En tredje instar larve, gjengitt i 3D ved hjelp av Movie Maker i Dragonfly. Uthevede organer inkluderer hjernen (gul), øyeantenne imaginale plater (rød), fettlegeme (blå) og kroppsveggmuskulaturen (grønn). Klikk her for å laste ned denne filmen.

Film 2: Sammenligning av prøver avbildet i vann eller følg kritisk punkttørking. Abdomener farget med 0,5% PTA er vist. Begge magene ble skannet med identiske innstillinger for bildepikselstørrelse (0,65 μm). En serie 2D-skiver vises i et "Z-stack" -format (YZ) som starter ved dorsaloverflaten og slutter ved den ventrale overflaten av magen. Organer uthevet: FC, fettceller; Mg, Midgut; SP, sædpumpe; Te, Testikler. Skanneparametere: Kilde til prøveavstand (mm): (A) 6,7, (B) 7. Kilde til kameraavstand (mm): (A) 28 (B) 29,5. Målsetting: (A-B) 4X. Bildepikselstørrelse (μm): (A-B) 0,65. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Discussion

Visualisering av intakt Drosophila melanogaster i alle utviklingsstadier har forblitt en utfordring, hovedsakelig på grunn av inkompatibiliteten til lysmikroskopi med den tykke, pigmenterte kutiklen som finnes i dette dyret. Mens andre avbildningsmetoder for hele dyr, for eksempel Magnetic Resonance Imaging (MRI), Optical Coherence Tomography (OCT) og ultramikroskopi kombinert med vevsrydding, har blitt brukt med suksess i fluer50,51,52,53,54, μ-CT presenterer en rekke fordeler som gjør den ideell for hele dyreavbildning av denne organismen13,15,30 . Røntgenstråler trenger lett inn i den pigmenterte kutiklen, og deres lille bølgelengde gir mulighet for submikronavbildning. Merking krever minimal investering i allment tilgjengelige kjemikalier og ingen spesialiserte benkferdigheter13. μ-CT-skannere er også kommersielt tilgjengelige, og kostnadene kan sammenlignes med lette mikroskopiplattformer, samtidig som de er mer attraktive for et bredere spekter av disipliner (geologi, paleontologi, ingeniørfag, etc.) som også kan dra nytte av tilgjengeligheten ved en institusjon. Synchrotron røntgenkilder kan også brukes til høyoppløselig μ-CT-avbildning av faste og levende insekter31,55,56, men er mindre tilgjengelige enn kommersielle benkeplateskannere.

Denne protokollen gir en effektiv måte å skaffe μ-CT-bilder av flue voksne, pupa, larve og cellulære embryoer. Legg merke til at for mange av trinnene som er beskrevet ovenfor, kan alternative metoder også brukes til å forberede prøver for avbildning. Andre studier har gitt en detaljert sammenligning av forskjellige fikserings-, merkings- og tørketrinn for bruk i insekter, og de som er interessert i å vedta denne teknikken, oppfordres til å evaluere fordelene ved hver tilnærming1,4,13,29,30,57. Selv om denne protokollen er relativt grei, presenteres noen nyttige forslag.

For det første bør det tas hensyn til når du forstyrrer kutikol av intakte prøver slik at underliggende bløtvev ikke blir betydelig forstyrret. Det er viktig å la larval og tidlige puppestadier gjennomgå fiksering i 2 timer i Bouins løsning før du stikker. Dette vil stivne vevet og begrense mengden hemolymfe som vil ooze ut av kutikalhullene, noe som kan endre organarkitekturen. Individuelle kroppssegmenter (hode, thorax og mage) av voksen kan skilles hvis strukturen (e) av interesse ligger der. Det anbefales å bruke en skalpell for å skjære rent gjennom disse segmentene i stedet for å trekke dem fra hverandre med tang, noe som kan forstyrre 3D-arkitekturen i tarmen eller sentralnervesystemet, for eksempel. Når det gjelder timing, trenger voksne generelt bare 16 timer. for fullstendig fiksering, mens larve- og puppetrinnene trenger 24 timer. Også, hvis jod eller PTA-farging virker ujevn, kan prøven plasseres tilbake i løsning for å inkubere lenger til jevn farging oppnås. Til slutt bør hydrerte prøver ikke plasseres ved 4 °C, da dette ser ut til å indusere dannelsen av luftbobler i kroppshulen etter oppvarming til romtemperatur.

For det andre vil prøvemontering variere etter instrument, scenetype og om prøven må forbli hydrert eller har vært kritisk punkttørket. Hvis den er hydrert, må du forsikre deg om at prøven ikke lekker og muligens ødelegger skanneren. Når du monterer prøven inne i en pipettespiss, må du skyve forsiktig med en kjedelig gjenstand til prøvene støter på liten motstand og ikke kan bevege seg. Å presse for hardt kan føre til kutikuladeformasjon og underliggende strukturelle feil. Pass også på at prøven er justert i holderen så nær rotasjonsaksen som mulig. Enhver wobble vil øke skannetidene på grunn av det større synsfeltet og redusere oppløsningen til det endelige tomogrammet etter rekonstruksjon.

For det tredje vil skannerinnstillingene for henting av projeksjonsbilder også variere fra instrument til instrument. For å maksimere oppløsningsmulighetene til skanneren, bør spotstørrelsen for røntgenstrålen være så liten som mulig (5-10 μm). Dette kan oppnås ved å balansere røntgenspenning og strøminnstillinger slik at den totale effekten er 3-4 W. Med disse innstillingene og riktig eksponeringstid på kameraet kan riktig røntgenstråledemping av prøven og optimal bildekontrast oppnås. Bruken av aluminiums- eller kobberfiltre mellom objektet og røntgenkilden kan brukes til å finjustere de optimale røntgenenergiinnstillingene for best mulig bildekontrast eller dempe strålen tilstrekkelig til at høyere drevne kilder kan brukes. Når det gjelder bildeoppløsning, vil dette avhenge av mange forskjellige variabler, inkludert flekktype, antall projeksjonsbilder, bildepikselstørrelse, kameraposisjon, prøvebevegelse, skannervibrasjoner og rekonstruksjonsparametere. Et fantom for stolpemønster (QRM GmbH) som inneholder kjente størrelsesmarkører, kan bidra til å evaluere romlig oppløsning for en gitt skanner- og kamerainnstilling.

Det er også verdt å evaluere fordelene ved å avbilde kritiske punkter tørket eller hydrert prøver. Sombke et al. utførte en komparativ vurdering av de to metodene og fant kritisk punkttørking å være overlegen for μ-CT-applikasjoner som involverer leddyr30. Fordelene med hydrerte prøver er imidlertid at dyr utsettes for mindre kjemisk og mekanisk eksponering som kan føre til både kvantitative og morfologiske artefakter. Dette har også en tendens til å bevare delikat vev bedre enn CPD. Imidlertid har hydrerte prøver en mye kortere holdbarhet og bør avbildes senest en måned etter fiksering siden vevsforringelse og redusert bildekvalitet blir åpenbar på det tidspunktet. Også oppløsningen av hydrerte prøver vil være litt mindre enn en kritisk punkttørket prøve, fordi røntgenstråler også må trenge gjennom både en plastpipettespiss og den omkringliggende væsken (vann eller buffer). Kritisk punkt Tørkede prøver kan bevares i mye lengre perioder, spesielt når de holdes på Drierite. De kan også plasseres direkte i røntgenstrålebanen ved ganske enkelt å lime vingene eller bena til en insektpinne og plassere den i scenechucken, noe som forenkler monteringsprosessen. Imidlertid kan den omfattende etanoldehydreringen av disse prøvene føre til vevskrymping og tap av delikat vevsarkitektur, og derfor er det viktig å utføre en rekke økende EtOH-konsentrasjoner for å minimere disse effektene. Likevel bør det bemerkes at alle former for kjemisk behandling, inkludert paraformaldehydfiksering og til og med jodfarging, kan forårsake vevskrymping58,59. Selv om ingen av metodene vil gi målinger av 'faktisk organstørrelse' i en levende flue, er morfometriske målinger fortsatt gyldige når man sammenligner mutant- og wildtype-dyr så lenge fikserings-, fargings- og tørketrinnene utføres identisk for begge settene med prøver - helst parallelt.

Avslutningsvis gir μ-CT et nyttig verktøy for hele dyreavbildning for Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Mange andre studier har vist kraften i denne teknologien for å forstå ulike aspekter av insekt taksonomi, økologi, fysiologi, utvikling og anatomi som kan bidra til å informere fremtidige studier i fluer1,28,30,31,32,55,56,57 . Kombinert med de genetiske og lette mikroskopiverktøyene som allerede er mye brukt i denne organismen, kan μ-CT posisjonere seg i en eksperimentell rørledning som gir en dypere forståelse mellom genotype og fenotype.

Disclosures

Forfatteren erklærer ingen konkurrerende eller økonomiske interesser.

Acknowledgments

Ingenting av dette ville vært mulig uten støtte fra Nasser Rusan. Jeg vil takke H. Doug Morris, Danielle Donahue og Brenda Klaunberg fra NIH Mouse Imaging Facility og Ben Ache fra Micro Photonics for trening og nyttig diskusjon. Jeg takker også Mansoureh Norouzi Rad fra Zeiss for skanning av mageprøver på Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith og Rachel Ng hjalp også til med skanning. Mike Marsh fra Object Research Systems ga Dragonfly teknisk støtte. Jeg er også takknemlig for støtten fra National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) og Start Up Funds fra University of Wyoming. Jeg takker også de anonyme anmelderne for deres nyttige forslag og kommentarer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  2. Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
  3. Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
  4. Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
  5. Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
  6. Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
  7. Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
  8. Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
  9. Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
  10. Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
  11. Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
  12. Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
  13. Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
  14. Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
  15. Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , Springer. 2 (2019).
  16. Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
  17. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
  18. Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
  19. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), International Mouse Knockout Consortium 9-13 (2007).
  20. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  21. Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  22. Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
  23. Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
  24. Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
  25. Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
  26. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  27. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  28. Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
  29. Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
  30. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
  31. Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, Pt 1 51-71 (2007).
  32. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
  33. Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
  34. Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
  35. Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
  36. Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
  37. Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
  38. Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
  39. Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, Pt 4 374-377 (2008).
  40. Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
  41. Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
  42. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  43. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
  44. Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
  45. Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. CIBC Seg3D: Volumetric Image Segmentation and Visualization. Scientific Computing and Imaging Institute (SCI). , Available from: http://www.seg3d.org (2016).
  48. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  49. Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
  50. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
  51. Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
  52. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
  53. Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
  54. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  55. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
  56. Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
  57. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  58. Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
  59. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 163 Drosophila melanogaster mikrocomputert tomografi preklinisk avbildning bildeanalyse modellering av menneskelig sykdom fenotyping
Hele dyrets avbildning av <em>Drosophila melanogaster</em> ved hjelp av mikrocomputert tomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging … More

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter