Summary
Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).
Abstract
Autosomaal dominante Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD) wordt veroorzaakt door mutaties in het LMNA-gen, dat codeert de A-type nucleaire lamines, tussenliggende filamenteiwitten die de nucleaire envelop en de componenten van het nucleoplasma ondersteunen. We hebben onlangs gemeld dat spier verspillen in EDMD kan worden toegeschreven aan intrinsieke epigenetische disfuncties die spier (satelliet) stamcellen regeneratieve capaciteit. Isolatie en cultuur van enkele myofibers is een van de meest fysiologische ex-vivo benaderingen om het gedrag van satellietcellen in hun niche te monitoren, omdat ze tussen de basale lamina blijven rond de vezel en het sarcolemma. Daarom is het een waardevol experimenteel paradigma om satellietcellen te bestuderen van een verscheidenheid aan murinemodellen. Hier beschrijven we een opnieuw aangepaste methode om intacte en levensvatbare single myofibers te isoleren van postnatale achterpootspieren(Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius en Soleus). Volgens dit protocol konden we satellietcellen van Lamin Δ8-11 -/- muizen, een ernstig EDMD murine model, bestuderen op slechts 19 dagen na de geboorte.
We beschrijven de isolatieprocedure, evenals de cultuuromstandigheden voor het verkrijgen van een goede hoeveelheid myofibers en hun bijbehorende satelliet-cellen-afgeleide nakomelingen. Wanneer gekweekt in groei-factoren rijk medium, satellietcellen afgeleid van wilde type muizen activeren, vermenigvuldigen, en uiteindelijk onderscheiden of ondergaan zelfvernieuwing. Bij homozygoot Lamin Δ8-11 -/- mutantmuizen zijn deze vermogens ernstig aangetast.
Deze techniek, indien strikt gevolgd, maakt het mogelijk om alle processen die verband houden met de myofiber-geassocieerde satellietcel te bestuderen, zelfs in vroege postnatale ontwikkelingsstadia en in fragiele spieren.
Introduction
Skeletspier is een gedifferentieerd weefsel met een van de meest uitgebreide vermogen om te regenereren na oefening of trauma1. Dit kenmerk is voornamelijk te wijten aan de aanwezigheid van stamcellen, satellietcellen genoemd vanwege hun perifere positie tussen de basale lamina en de plasmalemma van de myofiber2. Tijdens de postnatale ontwikkeling vermenigvuldigen satellietcellen zich en onderscheiden geleidelijk, waardoor ze bijdragen aan de groei van de skeletspier. Eenmaal in de volwassenheid, satellietcellen in een omkeerbare rustige toestand, en op fysiologische of pathologische trauma, ze activeren, vermenigvuldigen en differentiëren om de beschadigde spieren te herstellen3. Gebreken in het vermogen van satellietcellen om goed door deze verschillende regeneratieve fasen te gaan en zelfvernieuwing te ondergaan, zijn stevig verbonden met spierverspilling, hetzij tijdens fysiologische veroudering4,5,6 of bij spierdegeneratieve ziekten, zoals spierdystrofieën7,8,9,10.
Er bestaan twee belangrijke cultuurbenaderingen om satellietcellen ex-vivo te bestuderen: primaire myogene culturen uit mononucleated cellen, mechanisch en chemisch gescheiden van hele spier11,12; of cultuur van geïsoleerde myofibers13,14,15,16,17,18,19,20. In het eerste geval omvat het proces van satellietcellenisolatie de trituratie van hele spieren uit de muis, een chemische spijsvertering, filtratie en fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS)21. Deze procedure, hoewel effectief in het isoleren van satellietcellen van verschillende modellen , houdt verschillende variabelen in die satellietcellen blootstellen aan stress en hun fysiologische niche22,23verstoren . Daarentegen, myofiber isolatie omvat een zachtere vertering van spierweefsel met matrix vernederende enzymen en een mechanische versnipperen die minder trauma veroorzaakt om stamcellen20. Deze tweede benadering maakt een veel efficiëntere terugwinning van levensvatbare satellietcellen mogelijk, die fysiek verbonden blijven aan hun myofiber tussen de basale lamina en de sarcolemma, waardoor analyse binnen hun fysiologische niche19,20mogelijk wordt .
Veel verschillende protocollen zijn voorgesteld in de afgelopen jaren om goed en efficiënt te isoleren enkele myofibers van skeletspieren. Al in 1986 stelde Bischoff een protocol voor om vezels te isoleren van de Flexor Digitorum Brevis13 en later, in 1995, wijzigden Rosenblatt et al. het protocol om een efficiëntere scheiding van myofibers te verkrijgen14. Sindsdien stelden veel andere auteurs aangepaste procedures voor op andere spieren, zoals Extensor Digitorum Longus (EDL) en Tibialis Anterior (TA)15,16,17,18,19,20, die langer zijn, zelfs als kwetsbaarder, spieren14. Geïsoleerde myofibers kunnen vervolgens zowel in hechting worden gekweekt, om de uitbreiding van door satellietcellen afgeleide myoblasten mogelijk te maken, of in zwevende omstandigheden, tot 96 uur, om het nageslacht afgeleid van enkele satellietcellen19 (figuur 1) te volgen. Variabele concentraties serum binnen het kweekmedium worden gebruikt om activering, proliferatie en/of differentiatie van satellietcellen te activeren, om hun vermogen om goed door deze verschillende fasen te doorlopen te bestuderen1.
We hebben onlangs beschreven het epigenetische mechanisme achter de uitputting van de satelliet stamcel pool in het muismodel van EDMD, de Lamin Δ8-11 -/- muis7. Aangezien deze muizen meestal sterven tussen 4-8 weken oud24, als gevolg van ernstig spierverlies, werd een poging gedaan om de moleculaire defecten die ten grondslag liggen aan het vroege begin van de ziekte vast te leggen door onze analyse te richten op postnatale spierontwikkeling. Zwevende single myofibers werden geïsoleerd en gekweekt van wilde type en Lamin Δ8-11 -/- mutant7 19 dagen oude muizen. In dit stadium zijn spierafwijkingen al duidelijk, maar muizen zijn nog steeds levensvatbaar. Echter, omdat alle bovengenoemde protocollen voor enkele myofibers extractie werden geoptimaliseerd voor skeletspieren van volwassen muizen, moesten we ze aanpassen aan onze doeleinden: zeer kleine muizen in termen van leeftijd en grootte, en zeer fragiele myofibers. Zo beschrijven we hier onze heraanpassing van het protocol voorgesteld door het Rudnicki laboratorium19 om een aanzienlijk aantal enkele levensvatbare myofibers van muizen te verkrijgen tijdens de postnatale ontwikkeling en van ernstige dystrofische spieren, zoals die afkomstig zijn van Lamin Δ8-11 -/- muizen24. Het uiteindelijke doel van deze aanpak is om een gestandaardiseerde procedure te bieden voor de studie van myofibers-geassocieerde spierstamcellen in een ander muismodel wanneer de vroege stadia van postnatale ontwikkeling van belang zijn, of in het geval van muismodellen die een specifieke ziekte dragen die myofibers vatbaarder maakt voor mechanische stress.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd onder de ethische goedkeuring van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid en de Institutional Animal Care and Use Committee (vergunning n. 83/2019-PR). De dieren werden gehouden in een erkende faciliteit in het San Raffaele Ziekenhuis in Milaan, Italië (vergunning n. N. 127/2012-A).
1. Spierdissectie en myofibercultuur
- Voorbereiding van de apparatuur.
- Bereid voordat u begint alle benodigde oplossingen voor zoals beschreven in tabel 1. Deze oplossingen moeten vers worden bereid.
- Reinig alle oppervlakken en gereedschappen die tijdens de procedure worden gebruikt met 70% ethanol.
- Voordat u begint met muizenofferen, voert u coatings uit van 100 mm en 35 mm petrischaaltjes met Horse Serum (HS). Coat alle gerechten om te voorkomen dat myofibers hechten aan het plastic. Overweeg het gebruik van een 100 mm schotel en vier 35 mm gerechten per muis.
- Na het verwijderen van het overschot aan GS, bewaar gecoate gerechten in een couveuse op 37 °C gedurende 30 min. Vul het vervolgens met wasoplossing of kweekmedium (twee gerechten van 35 mm per muis).
OPMERKING: Als alternatief kan een oplossing van 10% GS in dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) worden gebruikt om gerechten te coaten. Gebruik altijd gecoate gerechten. Het is mogelijk om cultuurgerechten van verschillende grootte te gebruiken, maar kleine afmeting Petri gerechten worden aanbevolen. - Voor vezels isolatie, bereiden steriele Pasteur pipetten zoals weergegeven in figuur 2. Voor elke muis bereiden een groot gat boring pipet voor spierbehandeling en mechanische disaggregatie (Figuur 2A) en een klein gaatpipet voor vezels selectie (Figuur 2B). Snijd elke glazen pipet, eventueel met behulp van een diamantpen, tot de gewenste lengte en gladde pipet randen op een vlam.
- Coat elke pipet door het kort nat te maken met GS voor gebruik.
- Muisoffer en spierdissectie
- Verwarm de spijsverteringsoplossing 10 minuten voor op kamertemperatuur voordat u met de ontledingsprocedure begint. Polypropyleen FACS ronde bodem buizen zijn de meest geschikte containers voor het doel.
- Onmiddellijk voor het begin van het ophalen van de spier, offer de muis volgens de juiste nationale IACUC aanbeveling.
- Nat zijn onderlichaam met 70% ethanol voor het snijden van de huid om de verwijdering van het haar gemakkelijker te maken.
- Zet de muis in een gevoelige positie op een steun van polystyreen bedekt met aluminium papier en snijd de huid vanaf het midden van de rug in de lengterichting en in de richting van de benen.
- Verwijder de huid voorzichtig zonder de spieren en pezen aan te raken. Het is mogelijk om alle huid af te trekken.
- Snijd de twee poten van de muis en ga snel verder met de dissectie.
OPMERKING: Als het comfortabeler is, is het mogelijk om de dissectie op de hele muis voort te zetten, maar werken aan het been zorgt voor meer mobiliteit en precisie in de latere sneden. - Bevestig het been op de steun op het niveau van de voet met behulp van een pin en beginnen met het isoleren van skeletspieren van belang in deze volgorde: TA, EDL, Gastrocnemius en Soleus.
- Til de onderste pees van TA met een scherpe pincet op enkelhoogte en snijd het, dan gesneden met fijne schaar rondom de TA spier naar de andere pees op het niveau van de knieschijf(Figuur 3A). Breng over in de spijsverteringsoplossing.
- Til de onderste pees van EDL op en scheid deze van andere spieren door deze voorzichtig omhoog te trekken naar de andere pees. Snijd en plaats het in de spijsverteringsoplossing.
OPMERKING: Aangezien EDL extreem klein kan zijn om afzonderlijk van TA te worden gesneden, kunnen ze samen worden ontleed(figuur 3B). Dan, als de hele spier is te groot, snijd het in 2-3 stukken vanaf de pees en na de vezels in een longitudinale richting(Figuur 3C). - Draai het been met de rugspieren en bevestig de voet met behulp van de pin. Til de pees van de Achille op, Gastrocnemius zal automatisch scheiden van andere spieren. De bovenste pees zit achterin de knieschijf. Snijd het en voeg de spier aan de spijsvertering.
- Til de uitwendige pees van het been (ten opzichte van het lichaam) op en verkrijg de Soleus. Voorzichtig scheiden van de andere spieren door te scrollen onder met de pincet.
- Doe hetzelfde voor de andere etappe (stappen van 1.2.7. tot 1.2.11.).
- Spiervertering
- Broed de spijsverteringsoplossing met alle spieren in een waterbad bij 37 °C gedurende ongeveer 45-50 min. Controleer tijdens de spijsverteringstijd regelmatig de spier om oververtering te voorkomen. Om de 10 minuten omkeren de spijsvertering buizen 10x met een energetische beweging (vermijd vortexing).
- Stop de spijsvertering wanneer de spieren beginnen los te komen en myofibers zichtbaar zijn.
- Helemaal aan het einde van de spijsvertering schudden de monsters.
- Om de spijsvertering te stoppen, breng je de spijsverteringssuspensie voorzichtig over op een voorverwarmde petrischaal van 100 mm met een wasoplossing van 10 mL.
OPMERKING: Vermijd spierovertering, omdat dit onvermijdelijk zal resulteren in de isolatie van hyper-gecontracteerde myofibers. Meestal met dit protocol, spieren van homozygoot mutant muizen nemen 45 min te worden verteerd, terwijl de spieren van wilde type muizen nemen 50-55 min. Spijsvertering tijd moet experimenteel worden gevalideerd.
- Single myofibers isolatie
- Eerst isoleren van de vezels al gescheiden onder een ontleden microscoop door ze individueel te plukken met een gecoate P200 pipet of klein gaatje Pasteur en breng ze van de 100 mm Petri in een nieuwe 35 mm Petri schotel met 5 mL van voorverwarmde wasoplossing.
- Om verder myofibers vrij te geven, pipette de spier op en neer gebruikend een groot gat boring glaspipet met warm middel, tot de vezels mechanisch worden vrijgegeven. Wees niet te persistent, want dit zal leiden tot schadelijke vezels.
- Doorgaan met het vrijgeven van myofibers uit de spier totdat het gerecht bevat een wenselijke hoeveelheid. Als de petrischaal langer dan 8 min op kamertemperatuur wordt gehouden, stop en voer dan minimaal 5 min incubatie uit bij 37 °C, 5% CO2 om het medium opnieuw te equiliberen.
- Voordat u de single myofibers naar het kweekmedium overzet, laat u ze op 37 °C, 5% CO2 in wasschaal gedurende ten minste 1 uur. Dit helpt myofibers aan te passen aan de in vitro conditie.
LET OP: Volwassen myofibers zijn minder gevoelig voor stress en kunnen worden gewassen ~ 2-3x. Echter, in deze toestand (op 19 dagen postnatale leeftijd) is het beter om slechts een wasstap uit te voeren om myofiberschade te voorkomen. Let daarom altijd op om geselecteerde myofibers voldoende schoon te houden door geen vuil of hypercontracted vezels te dragen.
- Single myofiber cultuur
- Breng individuele myofibers over naar een nieuwe voorverwarmde schotel met het juiste kweekmedium (hoog serummedium om activering van satellietcellen mogelijk te maken, zie figuur 1).
- Verander het medium in de geïsoleerde myofibers, door ze over te dragen aan een nieuw gecoate gerecht met nieuw cultuurmedium, pas na 48-72 uur cultuur om stress te voorkomen die zal leiden tot myofibers hypercontractie en verstoring.
2. Downstream toepassingen: Myofibers crosslinking en immunofluorescentie
OPMERKING: De aan myofibers geassocieerde satellietcellen kunnen worden gevisualiseerd door immunofluorescentie (IF) op het moment van belang. Aangezien de meeste gepubliceerde protocollen zijn geoptimaliseerd om IF uit te voeren op volwassen myofibers, wordt hier een gedetailleerd protocol gepresenteerd om betrouwbare resultaten te verkrijgen, ook op myofibers geïsoleerd van postnatale spieren.
- Myofiber crosslinking
- Bereid voordat u begint alle benodigde oplossingen voor zoals beschreven in tabel 2.
- Precoat met GS maar liefst 1,5 mL microcentrifugebuizen als het aantal monsters. Zorg ervoor dat u alle GS verwijdert voordat u verdergaat. Aangezien crosslinked vezels zijn harder dan de levende en moeilijker te pipette, zorg ervoor dat crosslink ongeveer 200-300 vezels afzonderlijk per buis.
- Onder een ontleden microscoop, verzamel alle vezels die kunnen worden beschouwd als gezond, breng ze naar de microcentrifuge buis en laat de buis verticaal gedurende 5 minuten in de incubator om vezels te vestigen.
- Verwijder de supernatant heel langzaam uit de buis.
- Crosslink vezels door het toevoegen van 1 mL van 4% paraformaldehyde (PFA) bij RT aan de buis. Doe het voorzichtig om vezels nood te voorkomen.
- Om te voorkomen dat vezels verweven tijdens de crosslinking, houd de buis in zeer zachte agitatie gedurende 10 min.
- Houd de buis in een verticale positie gedurende 5 minuten op RT om vezels te vestigen, gooi dan de supernatant ervoor te zorgen dat de meerderheid van het PFA-volume te verwijderen.
- Voeg 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en houd de buizen 5 minuten verticaal bij RT om de vezels aan sediment te laten.
- Verwijder de supernatant en herhaal de wasprocedure (stap 2.1.8.) twee maal opnieuw.
- Houd gekruiste monsters op 4 °C.
LET OP: Het is mogelijk om crosslinked myofibers een week op 4 °C te houden. Als de vezels blijven meer dan een week in deze toestand, zal dit onvermijdelijk resulteren in myofibers verstrengeling.
- Immunofluorescentie
- Houd de buizen met de vezels staan op RT voor ten minste 5 minuten om voor vezel sedimentatie.
- Verwijder de supernatant, waardoor slechts een klein volume om zeker te zijn geen vezels te verwijderen.
- Voeg 1 mL van 0,5% Triton X-100 toe in PBS en broed gedurende 5 minuten met zachte agitatie.
- Zet buizen in verticale positie gedurende 5 min, verwijder dan supernatant.
- Voeg 1,5 mL PBS toe en broed gedurende 5 minuten met zachte agitatie.
- Houd buizen in verticale positie gedurende 5 minuten, verwijder dan de supernatant.
- Voeg 1 mL blokkeeroplossing toe en incubeer 1 uur bij RT met zachte agitatie.
- Houd buizen 5 min in verticale positie, verwijder dan de supernatant.
- Verdun primaire antilichamen bij blokkeeroplossing, voeg ze toe aan de buizen en broed ze 's nachts uit bij 4 °C bij zachte agitatie (voor voorgestelde concentraties zie Tabel van Materialen).
OPMERKING: Als alternatief kan het primaire antilichaam 3 uur worden geïncubeerd bij RT. Echter, 's nachts incubatie gaf optimale kleuring. Het incubatievolume voor zowel primaire als secundaire antilichamen moet 300 μL zijn wanneer sedimenteerde vezels de 100 μL-inkeping van de 1,5 mL microcentrifugebuis bereiken. Wanneer vezels minder overvloedig zijn, wordt een volume van 100-200 μL aanbevolen. - Laat de buizen 5 minuten in verticale positie staan en verwijder vervolgens de supernatant.
- Voer 3 wasbeurten uit in 1 mL van 0,25% Tween-20 in PBS, broed gedurende 5 minuten in zachte agitatie en laat de buizen telkens 5 minuten staan.
OPMERKING: Vanaf hier voer u alle stappen in het donker uit om fluorchromes bleken te voorkomen. - Verdun secundaire antilichamen in blokkeeroplossing, voeg ze toe aan de buizen en broed ze 1 uur bij RT uit met zachte agitatie (voor concentraties zie Tabel van Materialen).
- Was twee maal in 1 mL van 0,1% Tween-20 in PBS, uitbroeden gedurende 5 min met zachte agitatie en laat de buizen vervolgens in staande positie voor 5 min.
- Verwijder de supernatant, voeg 1 mL DAPI-oplossing toe en broed gedurende 5 minuten in met zachte agitatie.
- Laat de buizen 5 minuten verticaal in een rek staan en verwijder vervolgens de supernatant.
- Was met 1 mL PBS, uitbroed gedurende 5 minuten met zachte agitatie en laat de buizen vervolgens 5 minuten in een rek staan.
- Verwijder de supernatant, waardoor een volume van ongeveer 50 μL.
- Montage van fluorescerend gelabeld myofibers op microscoopdia's
- Snijd een P200 pipet tip en coat het met blokkeren oplossing
LET OP: Om de tip te coaten, pipet de oplossing op en neer meerdere malen voor het plukken van de vezels, zal dit voorkomen dat vezels te houden aan de tip muur. - Verzamel de vezels van de buis en verspreid ze op een microscoop glas dia.
- Gebruik onder een ontledenmicroscoop, met alleen het natuurlijke licht dat door de spiegel wordt gereflecteerd, een nieuwe (niet gesneden) P200 pipettip om de vezels te verspreiden en de overtollige vloeistofoplossing te verwijderen.
- Laat de glijbanen in het donker ongeveer 10-15 minuten drogen, totdat er een zeer lage hoeveelheid oplossing overblijft.
- Voeg het montagemedium op de glijbaan toe (de juiste hoeveelheid montagemedium moet worden gekalibreerd op de afmeting van de coverslip: voor een coverslip van 24 x 40 mm is 20 μL voldoende) en leg dan langzaam een afdekglas op het gebied met de vezels. Let erop dat er geen bubbels tussen de glazen ontstaan.
- Druk op de coverslip, zodat de vezels zal leggen op een enkel horizontaal plan.
- Bevestig de coverslip met nagellak.
- Bewaar de monsters maximaal 4 weken op 4 °C.
- Verwerf de gewenste beelden van fluorescerend gelabeld myofibers met een confocale microscoop.
- Snijd een P200 pipet tip en coat het met blokkeren oplossing
Representative Results
We meestal verteren vier verschillende spieren (TA, EDL, Soleus en Gastrocnemius) om een goede hoeveelheid lange en levensvatbare vezels die 96 uur in groei-factoren rijk medium(Figuur 4A,B)zou kunnen overleven ophalen. Alleen de meest intacte vezels moeten worden overgedragen in cultuurmedium, omdat ze zullen overleven; alle anderen, die gemakkelijk te discrimineren en te selecteren, moeten worden weggegooid.
Wanneer myofibers worden onderhouden in een groeifactoren rijke middelgrote satellietcellen afgeleid van wilde type muizen beginnen te activeren en vermenigvuldigen, zie figuur 1. Na 48 uur cultuur, in gezonde conditie(Lamin Δ8-11 +/+), satellietcellen upregulate MyoD en ondergaan hun eerste divisie. Geactiveerde Pax7+/MyoD+ satellietcellen vermenigvuldigen zich en met 72 uur in cultuur genereren ze celaggregaten gebonden aan de myofiber, die nog beter zichtbaar zijn bij 96 uur(figuur 5). Tijdens deze divisies, sommigen van hen kunnen onderdrukken MyoD expressie, het ondergaan van zelfvernieuwing om de stamcellen zwembad opnieuw te bevolken, terwijl degenen die MyoD te handhaven worden toegewijd aan differentiatie door downregulating Pax7 expressie. Na 96 uur bevatten satellietcellenclusters duidelijk zichtbare MyoG+ geëngageerde cellen, die zich kunnen onderscheiden in nieuwe myofibers(figuur 1 en figuur 6). Met name met dit experiment beschreven we een vertraagde dynamiek van satellietceldifferentiatie bij homozygoot gemuteerde Lamin Δ8-11 muizen (-/-) in vergelijking met hun tegenhangers van het wilde type (+/+), zie figuur 6.
Het uiteindelijke resultaat van elk experiment laten we denken dat het protocol ontwikkeld voor enkele myofibers isolatie en cultuur van dit model van ernstige spierdystrofie zorgt voor een goede kwaliteit myofibers voor alle verdere toepassingen.
Figuur 1: Grafische weergave van de regeneratieve fasen van satellietcellen gemodelleerd naar zwevende myofibers. Na 48 uur cultuur in groeifactoren rijk medium, Pax7 + cellen krijgen geactiveerd en ondergaan de eerste divisie, waardoor een doublet van Pax7 +/MyoD + cellen. MyoD positieve cellen dan vermenigvuldigen en uit te breiden, waardoor, in 72 uur van de cultuur, tot een cluster van verschillende cellen die het nageslacht van een enkele satellietcel. Na 96 uur cultuur worden Pax7+/MyoD+ cellen onderscheidend Pax7-/MyoG+ cellen. Tijdens de expansiefase, een subset van Pax7 +/MyoD + cellen downregulate MyoD expressie ondergaan zelfvernieuwing in rusting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Bereiding van boring pasteurpipetten. (A) Longitudinale en frontale weergave van hoe het grote gat boor pipet moet verschijnen. (B) Longitudinale en frontale weergave van hoe het kleine gat boor pipet moet eindelijk verschijnen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve foto's van enkele spierdissectie. (A) Isolatie van de TA-spier. Het vermijden van het verwijderen van de dunne laag die de spier bedekt, beschermt de myofibers binnenin. (B) TA- en EDL-spieren geïsoleerd aan elkaar nog steeds verbonden aan hun bovenste pees op het niveau van de knieschijf. cC) Afdeling TA en EDL na isolatie door ze langs de lengteas te snijden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van gezonde en levensvatbare myofibers. Representatieve fase contrast beelden van levensvatbare myofibers in schorsing. (A) De rode pijl geeft een myofiber aan met zichtbare sarcomereorganisatie en een satellietcel op zijn kant; de oranje pijlen geven een aantal stukken van gebroken myofibers, en wat puin aanwezig in de eerste schotel voor de definitieve selectie voor cultuur. Schaalbalk 100 μm. (B) Meer volledige weergave van andere myofibers onder een kleinere vergroting. Schaalbalk 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Verschil in de afmeting van stamcelclusters in wt en mutantmuizen. Immunofluorescentie kleuring van myofibers gewonnen uit 19 dagen Lamin Δ8-11 muizen (+/+ en -/-) na 96 uur cultuur. Pax7+ satellietcellen worden getoond. De dimensie van het celcluster was in de meeste gevallen aanzienlijk groter in Lamin Δ8-11 +/+ dan in Lamin Δ8-11 -/- in termen van aantal cellen. Schaalbalk 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Representatief immunofluorescentie-experiment. Immunofluorescentie-experiment uitgevoerd, na 96 uur cultuur, op myofibers gewonnen uit 19 dagen Lamin Δ8-11 muizen (+/+ en -/-). Pax7+/MyoG- (rood) en Pax7-/MyoG+ (groen) cellen werden waargenomen. Beelden verkregen met een confocale microscoop. Schaalbalk 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam van de oplossing in de tekst | Component | Percentage | voorgesteld eindvolume/monster | Notities | |
| wasoplossing | DMEM hoge glucose | 90% | 4 mL | Houd steriel, houd op 4°C tot het gebruik | |
| Paardenserum (GS) | 10% | ||||
| spijsverteringsoplossing | DMEM hoge glucose | 9.80% | 20 mL | Extreem schadelijk poeder. Filter oplossing met 0.22μm filter en houd dan steriel. Houd op 4°C tot het gebruik | |
| Collagenase I | 0.20% | ||||
| cultuurmedium | DMEM hoge glucose | 78% | 10 mL | Houd steriel, houd op 4°C tot het gebruik | |
| Foetaal runderserum (FBS) | 20% | ||||
| Kippenembryo-extract (CEE) | 1% | ||||
| Penicilline-Streptomycine (P/S) | 1% | ||||
Tabel 1: Recepten voor oplossingen die in punt 1 worden gebruikt.
| Naam van de oplossing in de tekst | Component | Percentage | voorgesteld eindvolume/monster | Notities | |
| 4% PFA | Paraformaldehyde (PFA) | 4% | 2-3 mL | Poeder en dan oplossing zijn uiterst schadelijk | |
| Pbs | 96% | ||||
| 0,5% Triton X-100 | Triton X-100 | 0.50% | 2-3 mL | Triton X-100 is zeer stroperig, bij voorkeur snijd de punt van de pipet om aliquot het | |
| Pbs | 99.50% | ||||
| 0,25% Tween-20 | Tween-20 | 0.25% | 10 mL | Tween-20 is zeer stroperig, bij voorkeur snijd de punt van de pipet om aliquot het | |
| Pbs | 99.75% | ||||
| 0,1% Tween-20 | Tween-20 | 0.10% | 10 mL | Tween-20 is zeer stroperig, bij voorkeur snijd de punt van de pipet om aliquot het | |
| Pbs | 99.90% | ||||
| blokkerende oplossing | Foetaal runderserum (FBS) | 10% | 10 mL | Bereid verse oplossing en bewaar op 4°C voor niet langer dan 3 weken (controleer altijd de duidelijkheid voor gebruik) | |
| Pbs | 90% | ||||
| DAPI (DAPI) | DAPI (DAPI) | 0.10% | 2-3 mL | Houd in het donker | |
| Pbs | 99.90% | ||||
Tabel 2: Recepten voor oplossingen die in punt 2 worden gebruikt.
Discussion
Isolatie van intacte single myofibers is een essentiële methode op het gebied van myogenese wanneer het belangrijkste doel is om cel-autonome regeneratieve capaciteiten van spierstamcellen in hun niche te karakteriseren, in gezonde en pathologische omstandigheden. Echter, wanneer biochemische of genomische studies van belang zijn, FACS-geïsoleerde satellietcellen misschien wel de beste optie.
Single myofibers isolatie maakt het mogelijk om ex-vivo te volgen, maar op de meest fysiologische manier, de dynamiek van alle stappen enkele satellietcellen ondergaan tijdens spierregeneratie, dat zijn: activering, celdeling (asymmetrisch en symmetrisch), differentiatie en terugkeer naar rust door zelfvernieuwing. Zodra myofibers worden gekweekt in zwevende omstandigheden, activeren en breiden de enkele satellietcellen de vorming van een cluster van cellen uit, allemaal afkomstig uit dezelfde satellietcel. Immunofluorescentieanalyse voor proliferatie, differentiatie, activering of stamheidsmarkers is dan optimaal om het aandeel tussen celstadia te kwantificeren.
De belangrijkste stap in ons protocol om levensvatbare en intacte myofibers te verkrijgen kan worden beschouwd als de snelle maar zachte spierdissectie, door pees-tot-peeisolatie, om spierschade te voorkomen. Ons advies is om alleen scherpe scharen en kleine scherpe pincet te gebruiken en de hele spierontledingsprocedure te beperken tot tien minuten. Wanneer het moeilijk is om zeer kleine spieren te isoleren (d.w.z. EDL en TA), is het mogelijk om ze samen te snijden en ze later te verdelen door fijne scharen te gebruiken die langs het longitudinale plan na de vezels snijdt. Deze strategie zal uiteindelijk minder intacte myofibers geven, maar de levensvatbaarheid zal niet in het gedrang komen. Hetzelfde moet worden uitgevoerd op grote spieren zoals Gastrocnemius om de spijsvertering te vergemakkelijken. Optimalisatie van de spijsverteringstijd, die empirisch moet worden gevalideerd, en minimale manipulatie van geïsoleerde vezels zijn ook twee cruciale aspecten voor de positieve uitkomst van de daaropvolgende analyse.
Het voordeel van het hier gemelde protocol is dat het kan worden toegepast op zeer kleine muizen (in leeftijd en dimensie), zelfs wanneer hun spieren extreem kwetsbaar zijn. Zelfs als niet hierboven vermeld, is het mogelijk om dit protocol van dissectie te volgen om dan cultuur levensvatbare myofibers voor langere periode met behulp van kelder membraan-gecoate gerechten18,19. Het is belangrijk om te overwegen dat deze situatie volledig verschilt van drijvende toestand, waar hechtingsstimuli en nabijheidsstimuli afwezig zijn.
Disclosures
Geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Wij danken Andrea Bianchi, het Italiaanse netwerk van laminopathieën en de leden van het laboratorium voor de steun en alle constructieve opmerkingen. We zijn Chiara Cordiglieri dankbaar voor de kostbare hulp bij confocale microscoop. De auteurs bedanken Dr Beatrice Biferali voor haar hulp bij het nemen van foto's voor cijfers. Het werk dat hier werd gepresenteerd werd ondersteund door My First AIRC Grant n. 18535, AFM-Telethon n. 21030, de Italiaanse minister van Volksgezondheid n. GR-2013-02355413 en Cariplo 2017-0649 naar C.L. C.M. wordt ondersteund door My First AIRC grant n.18993 en AFM-Tele nthon n. 22489.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma | D9542 | |
| Chicken embryo extract | Seralab | CE650-DL | |
| Collagenase type I | SIGMA | C0130-500MG | |
| Donkey anti-Rabbit 488 antibody | Thermofisher | R37118 | to be used 1:200 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | |
| MyoG antibody | Millipore | 219998 | to be used 1:100 |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Pax7 antibody | Developmental studies Hybridoma bank |
to be used 1:20 | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Phosphate saline buffer | Euroclone | ECB4004L | |
| Prolong gold antifade mountant | Thermofisher | P36930 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Tween-20 | SIGMA | P1379 | |
| Lab equipment | Manufacturer | ||
| Bunsen burner | |||
| Confocal microscope | Leica | ||
| Diamond pen | bio-optica | ||
| Dissection pins | |||
| FACS polypropylene tubes | Falcon | ||
| Falcon tubes (50 and 15 mL) | Falcon | ||
| Glass coverslips | Thermofisher | ||
| Glass Pasteur pipettes (22cm) | VWR | ||
| Glass slides | Thermofisher | ||
| Micro dissecting scissors | |||
| Micropipette (1 mL and 200 µL) | Gilson | ||
| Micropipette tips | Corning | ||
| Petri dishes (100 and 35 mm diameter) | Thermofisher | ||
| Plastic pipettes (5 and 10 mL) | VWR | ||
| Rubber pipette bulbs | VWR | ||
| Sharp tweezers | |||
| Stereo dissection microscope with transmission illumination | Leica | ||
| Tissue culture hood or lamina flow cabinet | |||
| Tissue culture incubator (humidified, 37°C, 5% CO2) | |||
| Water bath at 37°C | VWR |
References
- Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Muscle stem cells at a glance. Journal of Cell Science. 127 (21), 4543-4548 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 19 (6), 628-633 (2007).
- Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The Skeletal Muscle Satellite Cell: The Stem Cell That Came in From the Cold. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (11), 1177-1191 (2006).
- Franco, I., et al. Somatic mutagenesis in satellite cells associates with human skeletal muscle aging. Nature Communications. 9 (1), 800 (2018).
- Cosgrove, B. D., et al. Rejuvenation of the muscle stem cell population restores strength to injured aged muscles. Nature Medicine. 20 (3), 255-264 (2014).
- Bernet, J. D., et al. p38 MAPK signaling underlies a cell-autonomous loss of stem cell self-renewal in aged skeletal muscle. Nature Medicine. 20 (3), 265-271 (2014).
- Bianchi, A., et al. Dysfunctional polycomb transcriptional repression contributes to lamin A/C-dependent muscular dystrophy. Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 2408-2421 (2020).
- Blau, H. M., Webster, C., Pavlath, G. K. Defective myoblasts identified in Duchenne muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 80 (15), 4856-4860 (1983).
- Jiang, C., et al. Notch signaling deficiency underlies age-dependent depletion of satellite cells in muscular dystrophy. Disease Models & Mechanisms. 7 (8), 997-1004 (2014).
- Vallejo, D., et al. PITX2 Enhances the Regenerative Potential of Dystrophic Skeletal Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (4), 1398-1411 (2018).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal Muscle Satellite Cells: Background and Methods for Isolation and Analysis in a Primary Culture System. Methods in Molecular Biology. (798), 21-52 (2012).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Developmental Biology. 115 (1), 129-139 (1986).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. (290), 281-304 (2005).
- Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single Muscle-Fiber Isolation and Culture for Cellular, Molecular, Pharmacological, and Evolutionary Studies. Methods in Molecular Biology. 798, 85-102 (2012).
- Verma, M., Asakura, A. Efficient Single Muscle Fiber Isolation from Alcohol-Fixed Adult Muscle following β-Galactosidase Staining for Satellite Cell Detection. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 60-67 (2011).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells. Methods in Molecular Biology. 946 (206), 431-468 (2013).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Gallot, Y., Hindi, S., Mann, A., Kumar, A. Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers. Bio-Protocol. 6 (19), 1942 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Machado, L., et al. In Situ Fixation Redefines Quiescence and Early Activation of Skeletal Muscle Stem Cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Lucini, F., Bianchi, A., Lanzuolo, C. Formaldehyde-mediated snapshot of nuclear architecture. Methods in Molecular Biology. , (2020).
- Sullivan, T., et al. Loss of a-Type Lamin Expression Compromises Nuclear Envelope Integrity Leading to Muscular Dystrophy. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 913-920 (1999).
