Summary
Detta protokoll beskriver en tillämpning av enmolekylfluorescens in situ-hybridisering (smFISH) för att mäta in vivo-kinetiken av mRNA-syntes och nedbrytning.
Abstract
Enmolekylfluorescens in situ-hybridisering (smFISH) möjliggör räkning av absoluta antalet mRNAs i enskilda celler. Här beskriver vi en tillämpning av smFISH att mäta andelen transkription och mRNA nedbrytning i Escherichia coli. Som smFISH bygger på fasta celler, utför vi smFISH vid flera tidpunkter under en time-course experiment, dvs, när celler genomgår synkroniserade förändringar vid induktion eller förtryck av genuttryck. Vid varje tidpunkt är delregioner i ett mRNA spektralt urskiljda till sond transkription töjning och förtida uppsägning. Resultatet av detta protokoll möjliggör också för analys av intracellulära lokalisering av mRNAs och heterogenitet i mRNA kopia nummer bland celler. Med hjälp av detta protokoll många prover (~ 50) kan bearbetas inom 8 h, som den tid som behövs för bara några få prover. Vi diskuterar hur man tillämpar detta protokoll för att studera transkription och nedbrytning kinetik av olika mRNAs i bakterieceller.
Introduction
Flödet av genetisk information från DNA till mRNA och protein är en av de mest grundläggande cellulära processer, vars reglering är viktigt för cellulär kondition1. Antalet mRNAs i en cell bestäms av två dynamiska processer, transkription och mRNA nedbrytning. Hur transkription och mRNA nedbrytning regleras i tid och rum av en enda cell förblir dock inte helt förstått, till stor del på grund av bristen på experimentella metoder för att kvantitativt mäta deras kinetik in vivo.
Metoder baserade på totalt mRNAs extraherade från en population av celler, såsom Northern blot, RT-PCR, RNA sekvensering, och genuttryck mikroarrayer, kan mäta den relativa skillnaden i mRNA nivåer och har använts i stor utsträckning för att analysera graden av transkription töjning2,3,4,5 ellergraden av mRNA nedbrytning6,7. De ger dock inte det absoluta antalet mRNAs per cell, och därmed, de är inte lämpliga för sondering graden av transkription inledande8. Också, eftersom mRNAs extraheras från en population av celler, kan den rumsliga fördelningen av mRNAs inom en enda cell och variabiliteten av mRNA kopia nummer bland celler inte mätas.
Nästa generations RNA-sekvensering på enskilda celler (scRNAseq) kan kvantifiera antalet mRNAs per cell i en genomisk skala9. Det är dock fortfarande svårt att använda denna teknik för att mäta transkription kinetik, på grund av utmaningar med provberedning och höga kostnader. I synnerhet har tillämpningen av scRNAseq på bakterier varit tekniskt svårt på grund av låg mRNA överflöd10,11.
Single-molecule fluorescens in situ hybridization (smFISH) baseras på hybridiseringen av fluorescently-märkt singel-stranded sonder vars ordnar är kompletterande till uppsätta som mål mRNA avintresserar 12,13. Begreppet sekvensspecifik hybridisering liknar den som används i Northern blot eller RT-PCR, men hybridiseringen sker in situ inom fasta celler, för att bevara den infödda lokaliseringen av mRNAs. Signalen av en enda mRNA förstärks med hjälp av många sonder, ~ 20 nukleotider (nt) i längd, hybridisering till olika delar av en mRNA (Figur 1A)13. I denna "plattsättning" sond tillvägagångssätt, antalet sonder som behövs för att upptäcka en enda mRNA sätter en lägre gräns på längden av mRNA som kan analyseras. Alternativt kan mRNA av intresse vara transkriptionellt smält till en icke-kodande array av tandem Lac operatörssekvenser, så att flera kopior av en fluorescently märkt LacO sond hybridisera till en enda mRNA (Figur 1B)14.
smFISH har använts för att kvantifiera antalet mRNAs per cell vid steady state (dvs. när syntes och förfall är i balans) och för att analysera medelvärdet och variabiliteten av mRNAs bland bakterieceller15,16,17. Nyligen har smFISH tillämpats för att kvantifiera mRNA-tal vid icke-steady state, direkt efter induktion eller förtryck av genuttryck i E. coli18,19,20. De tidsmässiga förändringarna i de absoluta mRNA-kopieringsnumren användes sedan för att beräkna graden av transkriptionsinitiering, töjning och uppsägning, samt graden av mRNA-nedbrytning. För denna ansökan kan konventionella smFISH förfaranden vara besvärligt eftersom det finns många prover, var och en representerar en tidpunkt, som behöver gå igenom flera steg buffertutbyte (dvs centrifugeringen och tvätt). Här beskriver vi ett smFISH-protokoll, där provhanteringsstegen förenklas dramatiskt genom att celler följs till ytan på ett täckskydd och genom att aspirera vätskor med ett vakuumfiltreringssystem14,19. Med hjälp av uttrycket av lacZ i E. coli som exempel, är det fullständiga arbetsflödet ( Figur2) påvisas, inklusive bildanalys (Figur 3) ger in vivo kinetik av transkription (initiering, töjning och uppsägning) och mRNA nedbrytning, cell-till-cell variabilitet i mRNA uttryck, och mRNAIZATION. Vi räknar med att protokollet är allmänt tillämpligt på sond in vivo-kinetik och lokalisering av andra mRNAs hos olika bakteriearter.
Protocol
1. Beredning av smFISH-sonder
OBS: För att märka smFISH-sonder med en enda fluorofore, följ ett standardprotokoll för märkning av nukleinsyra oligonukleotider baserade på NHS ester kemi21.
- Designa smFISH-sonder. Besluta om att använda "plattsättning" sonder eller "array" sonder (Figur 1) för genen av intresse. Se avsnittet Diskussion om hur du fattar beslutet.
- För "plattsättning" sonder (Figur 1A), använd en online probe designer verktyg (t.ex., se Tabell över material).
- För "array"-sonder (Bild 1B), utför en BLAST-sekvenssökning för att kontrollera att sondsekvensen inte är ett komplement till några andra mRNA-sekvenser.
- För att studera lacZ mRNA transkription och nedbrytning kinetik, använd två uppsättningar av 24 sonder, varje uppsättning som täcker den första och sista 1 kb regioner av lacZ (3.072 bp)19.
OBS: Dessa sondset kallas, nedan kallad "5' mRNA-sond" respektive "3' mRNA-sond". Sekvenser av dessa sonder listas i tabellen över material.
- Beställ probsekvenser som DNA-oligonukleotider med en C6 aminolänkare i 5'-änden. Lös upp enskilda sonder i vatten till 1 mM.
- Kombinera ekmolära mängder av sonder för "5' mRNA-sond" och "3' mRNA-sondsuppsättningar" . Till exempel, för 5' mRNA-probeuppsättningen för lacZ, kombinera 20 μL av varje sond (totalt 24 sorters sonder i uppsättningen).
- Utföretanolfällning 22 av de kombinerade sonderna för att avlägsna eventuella föroreningar av primära och sekundära aminer (såsom Tris, glycin, och ammoniumsalter) som kan hämma konjugationsreaktionen. Lös till upp DNA-pelleten i 100 μL vatten (ger ~4,5 mM DNA i en sonduppsättning).
OBS: Detta steg rekommenderas även om sonderna genomgick en standard desaltrening av tillverkaren. En filterbaserad standardrening kan fungera i stället för och utöver etanolutfällningen. - Välj två spektralt distinkta fluoroforer med en monofunktionell NHS ester moiety, så att 5' och 3' mRNA-sondset kan märkas differentially. Till exempel, förbered Cy5 NHS ester för 5' mRNA-sonder och Cy3B NHS ester för 3' mRNA-sonder. Lös upp varje typ av fluoroforer i vattenfri DMSO till slutlig 20 mg/mL (~25 mM).
- Förbered 0,1 M natriumbikarbonat (pH 8,5) precis före varje märkningsreaktion. Exponering för luft under lång tid kommer att sänka dess pH och minska märkningen effektivitet.
- För konjugationsreaktionen, kombinera följande: 15 μL av Cy5-fluorofosbeståndet (från steg 1.5), 4 μL av 5' mRNA-sondset (från steg 1.4), 75 μL natriumbikarbonat (från steg 1.6), och 7 μL vatten. Linda röret med aluminiumfolie och skaka i rumstemperatur i 3-6 h.
OBS: Längre inkubation leder inte nödvändigtvis till större märkningseffektivitet. Även reaktionen kan skalas upp eller ner om koncentrationerna av komponenterna bibehålls. - Upprepa ovanstående steg för 3' mRNA-sondset och motsvarande fluorofor (dvs. Cy3B NHS-ester).
- Utför etanolnedering22 för att avlägsna oreageterade färgmolekyler. Lös pelleten i ~50 μL TE-buffert (10mM Tris-HCl pH 8.0 med 1mM EDTA).
- Uppskatta halterna av DNA och fluorofore genom att använda en UV-Vis-spektrometer.
- Mät absorbansen vid 260 nm och 559 nm (Cy3B) eller 649 nm (Cy5). Om provet är för koncentrerat för att ge en exakt mätning, späd 1 μL av provet till 10 μL.
- Konvertera absorbansen till koncentrationen:
εDNA = 0,2 μM-1 (för 20-nt enkelsträngat DNA), εCy5 = 0,25 μM-1, och εCy3B = 0,13 μM-1
OBS: [DNA] är koncentrationen av totala sonder inom lösningen. Koncentrationen av enskilda sonder är ca 24x lägre. Koncentrationen av totala sonder kommer att användas som "sondkoncentrationer" från denna punkt. Om förhållandet mellan [DNA] och [färgämne] är 1, kan följande HPLC-steg hoppas över23, och provet bör spädas till slutlig 4- 5 μM i TE-buffert.
- (Rekommenderas) Rena de märkta sonderna från omärkta sonder och fria färgämnen genom att använda HPLC.
OBS: Även om detta ytterligare reningssteg kommer att leda till förlust av prov, är det fördelaktigt för nedströms applikationer. Avlägsnande av omärkta DNA-sonder kommer att öka fluorescenssignalen från mRNA-mål och avlägsnande av oreagerade färgämnen kommer att minska bakgrundsfluorescensen.- Förbered HPLC med en analytisk standardkolumn C18, 0,1 M trietylammoniumacetat (TEAA) som buffert A och acetonitril som buffert B.
- Tillsätt 1 M TEAA till provet (från Steg 1.9) för att göra 0,1 M TEAA.
- Ställ in toningsprogrammet enligt följande: 0-5 min med 0% B, 5-35 min med en 0-30% linjär övertoning av B, 35-37 min med en 30-100% linjär lutning på B, och 37-40 min med 0% B. Håll flödeshastigheten på 0,1 mL/min och registrera kromatogram på 260 och 649 nm (för de Cy5-märkta proverna) eller vid 260 och 559 nm (för de Cy3B-märkta proverna).
- Samla upp det eluterade provet när absorbansen ökar i både DNA- och fluorofoforkanaler.
- Koncentrera det eluterade provet med hjälp av en vakuumkoncentrator och dra upp pelleten på nytt i 50-100 μL TE-buffert.
- Kontrollera koncentrationen av DNA och fluorofore med hjälp av en UV-Vis-spektrometer (se steg 1.10). Späd, om nödvändigt, för att göra slutkoncentration runt 4-5 μM. Förvara sonderna vid -20 °C
2. Beredning av lösningar
- Bered en stor volym AVPC-behandlat vatten och buffertar (tabell 1). Dessa lösningar kan pågå i över ett år i rumstemperatur.
- Bered 4x fästlösning och tvättlösning (Tabell 1).
- Förbered förhybritiseringslösningen och avsökningshybritiseringslösningen( Tabell 1). Förbered probe hybridiseringslösningen under inkubation i Steg 5.1 eller Steg 6.1 och håll sedan lösningen i en 37 °C bänkskivan shaker för 20-40 min med ett lock för att minimera exponeringen för ljus.
OBS: Koncentrationerna av formamid, SSC, och sond lacZ var optimerade för lacZ-sonduppsättningarna för att minimera bakgrundsfluorescensen samtidigt som den verkliga signalen maximerades. Se avsnittet Diskussion för detaljer om hur du ändrar dessa koncentrationer för olika program.
3. Beredning av täckslip och glasglas
- Rena täcken och glasglas.
- Placera enskilda täcken och diabilder i en Coplin burk med hjälp av tensar. Se till att täcken och bilderna separeras och inte vidrör varandra.
- Fyll burken med 100% etanol och stäng locket. Placera burken i ett vattenbad ultraljud renare och sonikera i 15-20 min.
OBS: För vatten-bad sonicator, rekommenderas att stänga av värmaren funktion. - Häll ut etanol och tvätta med ultrarent vatten 3-4x. Använd vatten som strömmar direkt från vattenreningsmaskinen.
- Häll ut vattnet från burken och fyll det med 70% etanol. Stäng locket och utför ultraljudsbehandling i 15-20 min och tvätta med ultrarent vatten.
- Fyll burken med ultrarent vatten och sonikera i 15-20 min.
OBS: Täckliner och glasrutschbanor kan hållas över natten i Coplin-burken fylld med ultrarent vatten. - Ta en rutschkana eller en täckbild ur Coplinburken med hjälp av rena tentstötar och föna den med hjälp av N2-gas. Upprepa detta för de återstående bilderna och coverslipsna.
- Placera de torkade rutorna i en ren förvaringslåda tills användning i Steg 7.5. Placera de torkade täcken i en tom 1 000-μL pipettspetslåda, som kommer att fungera som en "kammare" i det återstående förfarandet.
- Med hjälp av en hydrofoba markör rita cirklar på täcken efter cirkulära hål i pipettspetslådan. Dessa cirklar (~ 0,5 cm i diameter) kommer att fungera som "brunnar". Vänta minst 5-10 min för att markören ska torkas helt.
OBS: Håll alltid locket på spetslådan stängt. - Applicera en 20-μL droppe på 0,1% poly-L-lysin till varje brunn. Inkubera i 10-50 min i rumstemperatur.
OBS: Justera denna volym enligt brunnsstorleken. Se till att lösningen helt täcker brunnsområdet. För längre inkubation, var försiktig så att du undviker avdunstning. - Efter inkubation aspirate poly-L-lysin utan att vidröra ytan eftersom detta kommer att skrapa av poly-L-lysin. Applicera sedan en droppe (~20 μL) AVPC-vatten på de poly-L-lysinbehandlade brunnarna. Stäng lock av "kammaren" för att förhindra avdunstning tills steg 5.1.
4. Tid-kurs experiment och provfixering
- Odla E. coli celler i ~ 20 mL flytande kultur i en 250-mL kolv. Håll kolven i en vattenbadskak (30 °C) och fortsätt skaka. Stoppa skaktaren endast när du tar prover.
OBS: Resultat som presenteras i detta dokument erhålls från MG1655 celler som odlas i M9 minimalt medium kompletteras med 0,2% glycerol, 0,1% casamino syror, och 1 mg/ L tiamin till en exponentiell tillväxtfas (OD600~ 0,2). - Tillsätt 250 μL av 4x-fästlösningen i ett tomt 1,5 mL-rör. Upprepa och förbered flera rör, lika många som de tidpunkter som ska tas. Märk rören med tidspunktsnummer och håll dem i rumstemperatur.
- Ta 750 μL av cellodling (OD600~ 0,2) innan du startar en time-kurs experiment. Lägg till kulturen i ett rör som markerats för "tid noll" (från Steg 4.2). Invertera röret försiktigt för att blanda celler med fästlösningen.
OBS: Pipett inte upp och ner för att blanda, virvel, eller "vara grov" på cellerna. Detta prov representerar det förträngda tillståndet och kommer att användas som en kontroll för att beräkna fluorescensintensiteten hos ett enda mRNA (se steg 9.4). - Lägg till 0,02-1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) till den flytande kulturen för att inducera lacZ-uttryck. Starta en timer vid denna punkt (t = 0 min) och prov med ett visst tidsintervall (t.ex. var 1 min) från och med då. För provtagning, upprepa Steg 4.3.
- Lägg till 5 mM orthonitropheynl-β-D-fucopyranoside (ONPF) eller 500 mM glukos24 vid en viss tidpunkt under tid-kursen experiment (t.ex. vid t = 1,5 min) för att förtränga lacZ uttryck. Efter re-repression, fortsätta för att ta prov kulturerna (Kliva 4.3) för att spåra mRNA-degradering.
OBS: Repression kan också göras med ~ 400 μg/mL rifampicin, en transkriptionsinitieringshämmare25. - För fixering, inkubera de rör som innehåller provsmakade celler vid rumstemperatur i 15 min, följt av inkubation i is i 30 min.
- För att ta bort fixativ, centrifugera rören vid 4 500 x g i 4 min vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten med en pipett.
OBS: Se till att kassera formaldehyd i en separat avfallsbehållare efter säkerhetsprotokollet. - Lägg till 1 mL DEPC-PBS och åter upphäva cellerna. Upprepa centrifugeringen och åter fjädring 2x fler gånger.
OBS: Fasta celler är ömtåliga och behöver skonsam behandling. Försiktigt åter upphäva pelleten och undvika bubblor. - Efter det sista tvättsteget, åter suspendera celler i ~30 μL DEPC-PBS.
5. Permeabilisering av cellmembran
- Applicera varje tidspunktsprov på olika brunnar på täcket (~30 μL per brunn). Vänta på 10-30 min i rumstemperatur för celler att hålla sig på ytan. Undvik att slå samman vätskedropparna mellan brunnarna.
- För att skölja bort obundna celler, aspirera vätskan och applicera ~20 μL DEPC PBS på varje brunn. Aspirera DEPC PBS inom några minuter.
- Permeabilisera cellmembranen genom att applicera 15 μL av 70% etanol på varje brunn i 4 min. Aspirera etanol efter 4 min, och se till att brunnarna är helt torra.
OBS: Det är kritiskt att begränsa etanolbehandlingen i 4 min. Längre behandling kommer att resultera i över-permeabilisering. - Applicera 30 μL av tvättlösningen på varje brunn.
6. Sond hybridisering
- Aspirera tvättlösningen från varje brunn. Applicera 30 μL av förhybridiseringslösningen på varje brunn. Inkubera kammaren i 37 °C-ugnen i 30 min.
OBS: Lägg till ~50 mL vatten till kammarens botten för att ge fuktighet. - Aspirera förhybridiseringslösningen från varje brunn. Applicera ~30 μL av probhybritiseringslösningen på varje brunn. Täck kammaren med aluminiumfolie och inkubera i 37 °C-ugnen i 2 h.
OBS: Se till att probhybritiseringslösningen ligger i 37 °C bänkskivans skakspets innan detta steg. Undvik sammanslagning av vätskor mellan brunnar. Applicera en mindre volym av lösningen på varje brunn, om det behövs.
7. Efter-hybridisering tvätt och förberedelse för bildframställning
- Med hjälp av en flerkanalig pipett, applicera ~30 μL av tvättlösningen på varje brunn på en gång. Aspirera och upprepa 3-5x gånger tvätt. Inkubera kammaren i 37 °C-ugnen i 15-30 min.
- Upprepa Steg 7.1 två gånger till.
- Tvätta varje brunn med DEPC-PBS 5x gånger. Följ den metod som används i Steg 7.1 men hoppa över inkubationsprocessen.
- Aspirera vätskan från täcket. Applicera 4 μL av DEPC-PBS på varje brunn.
- Använd tslag, lyft och vänd på täcket och placera den försiktigt över en glasrutschbana (från steg 3.2). Undvik bubblor.
- Täta kanterna på täcket med silikon dentalt tuggummi.
- Vänta tills tandköttet är stelnat. Man kan pausa här och lagra glidningen över natten vid 4 °C .
OBS: Andra smFISH-protokoll föreslår att man tillsätter reagenser för syrgassanning (t.ex. glukosoxidas/katalas) eller med hjälp av ett kommersiellt anti-fade-monteringsmedium14,26 föratt öka fluoroforernas fotostabilitet.
8. Bildbehandling
- För att hitta ett område av intresse, använd live-läge faskontrast avbildning. Ändra synfält inom en brunn genom att manövrera scenen joystick. Välj ett område där celltätheten är optimal (dvs. det finns många celler som för det mesta är separerade). Justera z-fokus så att faskontrast cellbilder är i fokus.
- Ta ögonblicksbilder i storleksordningen Cy5 (4-s exponering), Cy3 (2-s exponering) och faskontrast (0,2-s exponering).
OBS: Cy3B färgmolekyler avbildas i Cy3-kanalen, och bilderna benämns Cy3-bilder. - Upprepa steg 8.1-8.2 för att skaffa bilder av ~ 10 olika områden inom en brunn.
- Flytta målet till en annan brunn och upprepa steg 8.1-8.3.
- Exportera bilder som TIFF-filer.
- (Tillval) Bild flerfärgspärlor adsorberas på omslagsytan i Cy5 och Cy3 kanaler för att bestämma rumsliga skift mellan Cy5 och Cy3 kanaler för bildregistrering ändamål.
- Applicera ~10 μL av flerfärgslysrörspärlor (0,2 μm diameter) på en ren täckyta och vänta i 10-30 min. Efter tvättning med ~50 μL PBS, applicera ~5 μL PBS och sandwicha täcket med en glasrutschkana. Täta och montera på mikroskopet.
- Bildpärlor i både Cy5- och Cy3-kanaler.
9. Bildanalys
OBS: Matlab kod som används i detta steg finns i följande GitHub webbplats: https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020. GitHub-mappen innehåller allt som behövs för bildanalysen, inklusive parametervärden för cellsegmentering och dekoridentifiering. Proceduren i detta steg förklaras ytterligare i master script, som kallas "FISHworkflow.m".
- Öppna ett cellsegmenteringsverktyg, till exempel microbeTracker27 eller Oufti28, och läs in faskontrastbilder. Välj "Oberoende ramar" och tryck på en knapp som heter "Alla ramar" för att påbörja segmenteringsprocessen, från vilken celler identifieras och deras konturer beräknas (Bild 3B,C).
OBS: Detaljerade protokoll för att använda dessa programpaket finns tillgängliga online (t.ex. oufti.org). - Ladda Cy5 fluorescensbilder i spotFinder-funktionen hos microbeTracker eller Oufti, och tryck på knappen "Kör" för att påbörja spotidentifiering och kvantifiering baserad på 2D Gaussian-montering (Figur 3B,C). Upprepa detta steg för Cy3 fluorescensbilder för att analysera fläckar i Cy3-kanalen. Detta steg producerar en lista över fläckar i varje cell, inklusive deras intensiteter och koordinater.
- (Tillval) Filtrera bort dim fläckar (falskt positiva) med hjälp av ett tröskelvärde, som förklaras i filen FISHworkflow.m.
OBS: Undersök lysrörsfläckar i den negativa kontrollen (t.ex. MG1655 ΔlacZ) och bestäm tröskeln för att filtrera bort falska positiva. - För att erhålla spotintensiteten hos ett enda mRNA, använd en lista över dekorintensiteter som mättes vid tiden noll (innan du lägger till IPTG), och passa fördelningen av dekorintensiteter med en gaussisk blandningsmodell med två blandningskomponenter. Ta topppositionen för den första gaussiska populationen (svart linje i figur 3D,E) som spotintensiteten hos ett enda mRNA. Utför detta för Cy5 fläckar och Cy3 fläckar separat för att få plats intensiteten av en enda 5 ' och 3 ' lacZ mRNA.
OBS: Upprepa detta i varje tid-kurs experiment eftersom spotintensiteten i en enda mRNA kan variera något i olika experiment. - Dela fluorescensintensiteten på en plats med intensiteten hos ett enda mRNA (från steg 9.4) för att få antalet mRNAs inom en plats. Summera normaliserade dekorintensiteter inom en cell för att beräkna det totala antalet mRNA i en cell (Bild 3F). Utför dessa beräkningar för 5' och 3' mRNA separat.
- Beräkna och rita medelvärdet av mRNA-talen per cell vid varje tidpunkt (t.ex. figur 4B), och analysera in vivo-kinetiken för transkription och mRNA-nedbrytning från tidsförändringen av medelvärdet av mRNA-nivåerna (Figur 4B).
- För att få den hastighet transkription töjning, utföra en minst-rutor montering av en linje till den inledande ökningen av 5' och 3' mRNA signaler och identifiera avlyssningar till de basala nivåerna (Figur 4B). Skillnaden mellan dessa avlyssningar indikerar den genomsnittliga tiden för RNAPs att resa från 5's sond regionen till 3' sond regionen. Dela avståndet mellan två avsökningsuppsättningar (2 kb) med denna tid för att få den genomsnittliga transkriptionstöjningens genomsnittshastighet.
- För att erhålla hastigheten för mRNA-nedbrytning, passa en exponentiell sönderfallsfunktion, y = A·exp(-t/τ) till slutförfallsregionen av signalerna 5' och 3' mRNA (t.ex. Figure 4B Den passande parametern, τ, är den genomsnittliga mRNA-livslängden.
- (Tillval) Analysera cell-till-cell-variationen i genuttryck (t.ex. det cellnivåsvar på induktionen som visas i figur 4C), baserat på fördelningen av mRNA-tal i varje cell (beräknat i Steg 9.5).
- (Tillval) Med hjälp av information om spotplacering längs större och mindre axlar i en cell (som erhållits från Steg 9.2), analysera lokalisering av mRNAs (Figur 4D,E).
- (Tillval) Analysera samlokalisering av 5' och 3' mRNAs (Bild 5) genom att jämföra lokalisering av fläckar som upptäckts i Cy5- och Cy3-kanalerna.
- Ladda bilder av flerfärgspärlor (Steg 8.6) i spotFinderF-funktionen i microbeTracker och få koordinater av pärlacentroider i Cy5- och Cy3-kanaler. Använd listan över centroid-koordinater för att beräkna affine transformationsmatrisen, som informerar om hur Cy5- och Cy3-kanaler förskjuts och roteras med avseende på varandra29.
- Applicera affine transformationsmatrisen på Cy5- och Cy3 FISH-bilder för att konvertera Cy3-bilder i Cy5-koordinaten. Klassificera om en plats samlokaliseras med en annan plats i en annan kanal. Till exempel anses en plats i Cy5-kanalen vara samlokaliserad med en annan plats i Cy3-kanalen om avståndet mellan deras centroider är mindre än 150 nm (Bild 5).
- Analysera hur många Cy5 fläckar klassificeras som "co-lokaliserade" med Cy3 fläckar vid varje tidpunkt punkt. Analysera också intensiteten hos de samlokaliserade fläckarna (Bild 5).
Representative Results
Bild 3 visar representativa bilder från detta smFISH-protokoll. Ett fullständigt synfält (86,7 μm x 66,0 μm med hjälp av vår mikroskopiinställning som beskrivs närmare i Table of Materials) visar ~500 E. coli-celler som är spridda över hela fältet (Figur 3A). Om cellernas densitet är mycket högre än vad som visas i den här bilden blir den automatiska cellsegmenteringen svår eftersom segmenteringsalgoritmer inte på ett tillförlitligt sätt identifierar enskilda celler när celler vidrör varandra. Man behöver justera koncentrationen av celler och inkubationstid som används för ytföljsamhet (Steg 5.1) för att uppnå den optimala tätheten av celler i synfältet.
Cellernas morfologi i faskontrastbilderna bör förbli jämförbar med den hos levande celler för segmenteringsändamål (figur 3A-C). Om celler över-permeabilized, cellen morfologi förändringar (som "spöken"; Kompletterande figur 1). I så fall kan man minska varaktigheten av 70% etanol behandling i steg 5.3.
Före induktion den genomsnittliga lacZ uttrycksnivån var ~ 0,03 mRNAs per cell, överensstämmermed tidigare rapporter 15,30. Även fördelningen av lacZ mRNA platsintensiteter före induktion passade inte bra med en normalfördelning eller en Poissonfördelning på grund av förekomsten av fläckar med höga intensiteter (Figur 3D,E). Detta tyder på att de flesta av de fläckar som upptäcks under det undertryckta tillståndet representerar en enda lacZ mRNA, men en liten population av fläckar innehåller mer än en lacZ mRNA. För att isolera befolkningen med en enda lacZ mRNA, använde vi en Gaussisk blandning modell med två blandningskomponenter (insets i figur 3D,E). Sedan, medelvärdet av den första Gaussian togs som medelvärdet intensiteten av en enda mRNA plats (t.ex. toppen av den svarta kurvan i figur 3D) och används för att konvertera dekorintensiteten till antalet mRNAs, för eventuella fläckar som upptäckts i tid-kurs experimentet. För att beräkna det totala antalet mRNAs inom en cell summerades de normaliserade dekorintensiteterna i varje cell (Bild 3F)19.
När uttrycksnivån av lacZ mRNA är låg, finns det en eller två diffraktionsbegränsade lacZ mRNA fläckar rumsligt separeras inom en cell. Därför kan bilderna av dessa fläckar analyseras av 2D Gaussian passande för deras intensitet och lokalisering.
När uttrycksnivån är hög, så att fläckar överlappar varandra inom en cell, gör 2D Gaussian passande inte tillförlitlig kvantifiering. I så fall bör mRNA-nivån beräknas genom att dividera den totala, bakgrundsundertraherade fluorescenssignalen inom en cell med medelintensiteten för ett enda mRNA19.
När uttrycket av lacZ induceras ökar signalen av 5' lacZ mRNA först och den av 3' lacZ mRNA ökar senare (Bild 4B). Om uttrycket av lacZ är undertryckt, minskar både 5' och 3' lacZ mRNA signaler med viss fördröjning mellan (Figur 4B). För att få graden av transkription töjning, ökningen av 5' och 3' signaler är först passar med linjer (Figur 4B), och skillnaden i x-fångar tas som den tid för RNAPs att resa avståndet mellan två sond regioner (2.000 nt). Transkriptionstappens töjningshastighet kan mätas från varje tid-kursexperiment och standardavvikelser kan beräknas från experimentella dubbletter. Den genomsnittliga andelen transkription töjning var 15-30 nt / s under våra experimentella förhållanden19.
Dessutom erhölls hastigheten för mRNA-nedbrytning (invers av medelmRNA-livstiden) genom att förse sönderfallsregionen med en exponentiell funktion (Figur 4B). Våra tid-kursdata innehåller mRNA nedbrytning under och efter transkription31. Vi passar tidspunkterna efter 3 ' mRNA började förfalla (t > 6 min) att sond nedbrytningen av frisläppta mRNAs. Vi erhöll ~ 90 s som en genomsnittlig livslängd på antingen 5 ' eller 3 ' lacZ mRNA19.
Frekvensen för initiering av transkription kan beräknas från lutningen på 5' signalökning efter induktion (Figur 4B, blå), eller från det genomsnittliga mRNA-talet vid steady state (vilket är initieringshastigheten dividerat med nedbrytningshastigheten). Sannolikheten för förtida transkriptionsterminering kan dessutom uppskattas, antingen genom att förhållandet mellan lutningen på 3' signalökningen mot den på 5'signalökningen 32 eller mellan steady-state-nivåerna på 3' och 5' mRNA-regioner19.
Eftersom smFISH är en encellsteknik kan vi analysera cell-till-cellvariation i transkriptionen. Man kan till exempel analysera procentandelen celler som uttrycker lacZ mRNA efter att IPTG har lagts till (Bild 4C). En kan också tilltala huruvida mRNAlokaliseringändringar efter induktion. Vi observerade att 5' och 3' lacZ mRNA fläckar flytta något utåt, bort från mitten av cellen (Figur 4D,E), överensstämmer med en tidigare rapport33.
Slutligen kan analys av samlokalisering mellan 5' och 3' mRNA fläckar vara informativ (Bild 5A). Till exempel, i det undertryckta tillståndet (tid noll), är cirka 25% av 5' mRNA-fläckar samlokaliserade med en 3' mRNA-plats. Vid t = 1 min, som många gen loci har 5 ' mRNA syntes, men ännu inte 3 ' mRNA syntes, de flesta av de 5' mRNA fläckar är av sig själva utan 3' mRNA signal (dvs, låg sannolikhet för co-lokalisering). Men när 3' mRNA visas (dvs., t = 2 min), ökar sannolikheten för samlokalisering (lila pil i figur 5A,B). Denna tidpunkt, när samlokaliseringen blir frekvent, beror på graden av transkription töjning. 2-D densitetstomten på 5' och 3' lacZ mRNA-nummer inom varje samlokaliseringsplats som detekteras vid denna tidpunkt kan användas för att dra slutsatsen RNAPs densitet på lacZ-genen (Figur 5C). Som tidigare rapporterats19, de 5 ' mRNA nummer i denna tomt visar att de flesta av lacZ loci har mindre än 10 RNAPs på DNA när lacZ uttryck induceras av 1 mM IPTG. Dessutom är 3' mRNA-nummer i denna plot relaterade till klustring av RNAPs34. Det faktum att antalet 3 ' mRNA är nära en innebär att ungefär bara en RNAP kommer in i 3' sond regionen. Detta tyder på att RNAPs på lacZ genen är rumsligt åtskilda, istället för att bilda ett kluster (eller "konvoj").
Figur 1: Utformning av smFISH-sonder för ett mRNA av intresse. (A) En plattsättningsmetod. Sekvenser av korta DNA oligonukleotider (~ 20 bp i längd) väljs så att de kan täcka mRNA av intresse. Oligonukleotidsonderna är märkta med en fluorescerande färgämnesmolekyl. (B) En matrismetod. En icke-kodande array av tandemsekvenser (t.ex. "lacO array") är transkriptionellt smält till mRNA av intresse. Fluorescerande märkt sond som komplement till upprepningsenheten (t.ex. lacO-sond med 17 bp i längd) används för att förstärka signalen från ett mRNA. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk för smFISH experimentella förfarandet och tidslängd för varje steg. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: bildanalys av SMFISH. (A-C) smFISH mikroskopi bild av 5' lacZ mRNA (röd) och 3' lacZ mRNA (grön) i vild-typ E. coli (MG1655) odlas i M9 minimalt medium kompletterat med 0,2% glycerol, 0,1% casamino syror, och 1 mg/L tiamin vid 30 °C. (A) En representativ bild av ett prov från t = 3 min efter induktion med 0,05 mM IPTG vid t = 0 min och förtryck med 500 mM glukos vid t = 1,5 min. Faskontrast och två fluorescensbilder av Cy5 (för 5' lacZ mRNA, röd) och Cy3 (för 3' lacZ mRNA, grön) överdrivlades med pseudo-färgning. Bilden visar ett helt fält på 86,7 μm x 66,0 μm. Skala bar, 5 μm. (B) Inzoomningsversion av en liten region (gul ruta) i (A). Cellkonturerna visas i vitt och fluorescensfläckar som identifieras från bildanalys visas med röda prickar. Skala bar, 1 μm. (C) Detektering av cellkontur och fluorescerande fläckar under ett höguttrycksvillkor (t = 4 min efter induktion med 1 mM IPTG). Skala bar, 1 μm. (D-E) Fördelningar av 5' och 3' mRNA-platsintensiteter som uppmätts innan du lägger till IPTG (det undertryckta tillståndet). Histogrammen visas med två Gaussiska funktioner (svart och grått) vars medelvärden är från den gaussiska blandningsmodellen. Inset visar kvantil-kvantiltäppning av slumptal som genereras från de gaussiska blandningsmodellerna och experimentellt uppmätta mRNA-punktintensiteter (n = 1040 för 5' mRNA och 680 för 3' mRNA). (F) Information som erhållits för en enskild cell pekade på panel (B). För en given cell (i) identifierades fläckar i Cy5- och Cy3-kanaler, och deras intensitet (I) och koordinat längs den korta och långa axeln hos en cell (d, l) kvantifierades från 2D Gaussian-tillpassning. Efter normalisering platsintensiteter summerades att ge det totala antalet 5 ' eller 3 ' mRNAs i denna cell. Även samlokalisering mellan fläckar från olika kanaler kan analyseras som i exemplet som visas i figur 5. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av in vivo-kinetik av transkription och mRNA-nedbrytning. (A) Schematiska och representativa bilder av tvåfärgssmFISH-experiment som mäter förändringar i lacZ mRNA-nivåer över tid. Röda och gröna streckade linjer anger Cy5- eller Cy3B-märkta oligonukleotidsonder som hybridiserar till de 1 kb långa 5' respektive 3' mRNA-regionerna i lacZ mRNA i E. coli. Också visas är överlägg av två fluorescens bilder med en faskontrast bild vid indikerade tidpunkter efter induktion med 0,2 mM IPTG vid t = 0 min. Transkription var förträngda med 500 mM glukos vid t = 1,5 min. Skala bar, 1 μm. Siffran har ändrats från Kim et al19. (B) 5' och 3' lacZ mRNA-nummer per cell över tid, under det experiment som beskrivs i panelen (A). Fel barer är bootstrapped SEMs. Minst 1 200 celler analyserades per tidspunkt. Den inledande ökningen av 5' och 3' mRNA signaler var passar med en linje (blå). Skillnaden i x-fångar var 1,93 min, vilket ger den genomsnittliga andelen transkription töjning av 17,3 nt / s. Slutliga förfall av 5' och 3' mRNA signaler var passar med en exponentiell sönderfallsfunktion (grå). Fitparametrarna indikerar att den genomsnittliga mRNA-livslängden är 1,52 min för 5' mRNA och 1,66 min för 3' mRNA. (C) Procent av celler med en eller flera lacZ mRNA fläckar under försöket som beskrivs i (A). Fel barer är bootstrapped SEMs. (D) Lokalisering av en plats längs en cells korta axel. Man kan kvantifiera en plats närhet till membranet genom att dela platsen längs den korta axeln (d) med halv bredd av cellen (w). (E) Förändring av lokaliseringen av 5' och 3' lacZ mRNA fläckar längs cellers kort axel under experimentet som beskrivs i (A). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Analys av samlokalisering av 5' och 3' mRNA-fläckar. (A) Schematisk visar den förväntade samlokaliseringen mellan 5' och 3' mRNA fläckar efter induktion. När 3' mRNA görs ökar sannolikheten för att en 5' mRNA-plats samlokaliseras med en 3' mRNA-plats (lila pil). (B) Sannolikheten för samlokalisering efter induktion med 1 mM IPTG. Den lila pilen anger den tidpunkt där sannolikheten för samlokalisering först blir frekvent enligt schemat i panelen (A). (C) Antalet 5' och 3' lacZ mRNAs inom en samlokaliseringsplats som detekterats vid t = 2 min efter induktion med 1 mM IPTG (totalt 841 fläckar). Gråa punkter representerar enskilda samlokaliserade fläckar, medan röda punkter representerar medelvärdet av binneda data. Felstaplar är SEM. Gråfärgen anger tätheten av punkter i ett givet område i grafen. Den streckade linjen anger en lutning på 1. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6: Optimering av tillståndet för sondhybridisering. Två sorters prover användes: MG1655 celler som odlas enligt beskrivningen i figur 3 och förblir oinducerade (blå) eller behandlade med 0,5 mM IPTG i 20 min (röd). Probe hybridisering lösning gjordes med olika koncentrationer av sonder (totalt 72 Cy5-konjugerade sonder kakel hela lacZ regionen) och av formamid. Formamidkoncentrationerna justerades också i förhybridiseringslösningen och tvättlösningen, i enlighet med detta. "No probe" (grå linje) anger fluorescensnivå för de IPTG-tillagda cellerna som behandlades utan sonder under hybridiseringssteget. Genomsnittlig fluorescensintensitet normaliserad av cellområde (AU) beräknades från 300-800 celler. Fel barer är bootstrapped SEMs. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Förvrängda cell morfologier på grund av över permeabilization. Överlagring av faskontrast (gråskala), 5' lacZ mRNA (Cy5, röd), och 3' lacZ mRNA (Cy3, grön) bilder av MG1655 celler 5 min efter induktionen med 1 mM IPTG. (A) Ett exempel som visar blandning av normala celler och alltför permeabiliserade celler som saknar normal morfologi (anges med rosa pilar). (B) Ett exempel som visar "spöklika" celler hopklumpade. Skala bar = 1 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
| DEPC Vatten | ||||
| Tillsätt 0,1% DEPC till ultrarent vatten och inkubera flaskan (täckt) i 37 °C ugnen över natten och autoklav nästa dag. | ||||
| DEPC PBS (10X) | ||||
| Blanda följande: | ||||
| 80 g | NaCl (sista 1,37 M) | |||
| 2 g | KCl (sista 27 mM) | |||
| 14,2 g | Na2HPO4 (slutlig 100 mM) | |||
| 2,7 g | KH2PO4 (slutlig 20 mM) | |||
| Ultrarent vatten till 1L | ||||
| Filtrera (0,22 μm) i en glasflaska. | ||||
| Tillsätt 0,1% DEPC och följ instruktionen för DEPC vatten. | ||||
| För att göra 1X lösning, späd 10 gånger med DEPC vatten. | ||||
| 1M DEPC-natriumfosfatbuffert, pH 7,4 | ||||
| Blanda följande: | ||||
| 115 g | Na2HPO4 | |||
| 22,8 g | NaH2PO4 | |||
| Ultrarent vatten till 1 L | ||||
| Filtrera (0,22 μm) i en glasflaska. | ||||
| Tillsätt 0,1% DEPC och följ instruktionen för DEPC vatten. | ||||
| 4X fixeringslösning (16% formaldehyd) | ||||
| 5 mL | 20% formaldehyd | |||
| 500 μL | DEPC vatten | |||
| 750 μL | 1M DEPC-natriumfosfatbuffert, pH 7,4 | |||
| Förvaras i 4 °C i upp till 2-4 veckor. | ||||
| FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd är giftigt. Använd handskar och använd en draghuva när du gör denna lösning. | ||||
| Tvättlösning | ||||
| Blanda följande: | ||||
| 10 mL | Formamid (sista 25%) | |||
| 4 mL | 20X SSC (slutlig 2X) | |||
| Fyll DEPC vatten till 40 mL | ||||
| Filter (0,22 μm) och förvara vid 4 °C | ||||
| FÖRSIKTIGHET: Formamid är giftigt. Använd handskar och använd en draghuva när du gör denna lösning. | ||||
| Lösning för förhybrittering | ||||
| 200 μL | Formamid (sista 20%) | |||
| 100 μL | 20X SSC (slutlig 2X) | |||
| 10 μL | 100X VRC (slutlig 1X) | |||
| 25 μL | 4% (w/v) BSA (slutlig 0.1%) | |||
| 685 μL | DEPC vatten | |||
| OBS: Vortexa VRC-beståndet innan du tar ut 10 μL. | ||||
| VARNING: Formamid är giftigt och en känd teratogen. Använd handskar och hantera den under en draghuva. | ||||
| Lösning för sondhybridisering | ||||
| 200 μL | Formamid (sista 20%) | |||
| 100 μL | 20X SSC (slutlig 2X) | |||
| 10 μL | 100X VRC (slutlig 1X) | |||
| 25 μL | 4% (w/v) BSA (slutlig 0.1%) | |||
| 10 μL | 40 mg/mL E. coli tRNA (slutlig 0,4 mg/mL) | |||
| 200 μL | 50% dextran sulfat (slutlig 10%) | |||
| x μL | 5' mRNA-sondset (från Steg 1.12) till slutlig 4 nM. | |||
| y μL | 3' mRNA-sondset (från Steg 1.12) till slutlig 4 nM. | |||
| - | DEPC-vatten för att göra den totala volymen 1 mL | |||
| OBS: Lägg dextran sulfat sist. Eftersom det är mycket trögflytande, skär änden av en pipett spets innan du tar 200 μL ut från 50% lager. Efter att ha lagt dextran sulfat, pipettera upp och ner för att homogenisera lösningen. | ||||
Tabell 1: Recept på de lösningar som används.
Discussion
Här presenterade vi ett smFISH-protokoll för mätning av mRNA-kinetik i E. coli. I de tidigare publicerade smFISH protokollen för bakterier23, celler hölls i rören tills själva slutet av protokollet, det vill säga tills de är redo för avbildning. Även om det har många fördelar, såsom minimal ospecifik bindning av fluorescerande sonder på täckunderlagetyta 23, är det svårt att följa dessa protokoll när det finns många prover från en tid-kurs experiment. Först behöver en relativt stor volym celler (>1 mL) provsmakas och till och med skördas före fixering. För det andra måste cellproverna centrifugeras flera gånger för att utbyta lösningar och tvätta efter hybridiseringssteget. I vårt protokoll, en liten volym (< 1 mL) av kultur är direkt blandat med en fixlösning i en 1,5-mL rör, hjälper till att snabbt "frysa" celltillståndet vid provtagningsögonblicket. Också, celler stanna fäst vid ytan under hela förfarandet, och olika lösningar kan utbytas snabbt genom att aspirera vätskor med ett vakuum filtreringssystem och tillämpa lösning droppar på en gång med en flerkanalspipett. Denna skillnad gör vårt protokoll mycket fördelaktigt när ett stort antal prover måste bearbetas på en gång. Med hjälp av vårt protokoll kan 12-48 prover hanteras samtidigt och hela FISH-proceduren kan slutföras inom ~8 timmar, ungefär en liknande tid som behövs för några få prover (Bild 2). Även om vi använde uttrycket av lacZ i E. coli som exempel, är protokollet allmänt tillämpliga på olika gener och bakteriearter med överväganden som diskuteras nedan.
För olika gener, det första att tänka på är smFISH sonder. Man får utforma oligonukleotid sonder som kakel mRNA av intresse (Figur 1A)13. I denna "plattsättning" sond tillvägagångssätt, är varje sond ~ 20 bas lång och märkt med en fluorophore vid 5 'eller 3'-ändstationen. Denna strategi är bekväm eftersom ingen genetisk manipulation behövs. Alternativt kan en tandemrest på ~20 bp-sekvens, främmande till den genomiska sekvensen (t.ex. en array av lacO-sekvens i Caulobacter crescentus14), införas i den oöversatta regionen av en gen av intresse och en enda sond som kompletterar upprepningsenheten används för att märka mRNA ("array"-metoden; Bild 1B). I båda fallen dekorerar flera fluoroforer ett mRNA, vilket ger förstärkt fluorescenssignal som lätt kan skiljas från en enda sond ospecifikt bunden inuti en cell.
Om du ska välja "plattsättning" eller "array" tillvägagångssätt beror på den negativa kontrollen, ett prov där ospecifik bindning av sonder testas eftersom den saknar målet mRNA. För plattsättningssonder (Figur 1A), kan en mutant stam utan genen av intresse eller ett tillstånd, där genen inte transkriberas (t.ex. förtrycket av lacZ) fungera som en negativ kontroll för att testa ospecifik bindning av sonder. För den matrisbaserade smFISH (Bild 1B) kan en vildtypsstam som saknar matrisen fungera som en negativ kontroll eftersom den inte innehåller bindningsplatser för sonderna.
Optimala hybridiseringsförhållanden kan bero på sondsekvenserna och till och med valet av fluorofafärgämnen. Vi optimerade hybridiseringsvillkoret för lacZ-probeuppsättningar genom att hålla hybridiseringstemperaturen vid 37 °C och testa olika koncentrationer av probuppsättningar och formamid i hybridiseringslösningen. Högre koncentrationer av formamid tenderar att minska både ospecifik och specifik bindning26,35. Vi rekommenderar att man systematiskt ändrar hybridiseringen och dess tvättförhållanden samtidigt som hybridiseringstiden och temperaturen håller samma. I och med att villkoret blir strängare minskar både ospecifik och specifik bindning (figur 6). Det är viktigt att hitta en punkt där den icke-specifika bindningen börjar träffa under ett godtagbart tröskelvärde utan att ytterligare äventyra specifik bindning. Vi använde till exempel den signalnivå som erhållits utan några sonder ("inga sonder") som ett tröskelvärde (Bild 6).
Den tvåfärgade smFISH-metoden som märker två separata regioner i ett mRNA är begränsat till långa gener. För att mäta graden av transkription töjning, tog vi fördel av det faktum att lacZ är lång (3075 bp) och dess uttryck kan induceras av IPTG. När en gen är kort, är det svårt att utforma två plattsättning sond uppsättningar (nära 5' och 3' slutar) och lösa tidsfördröjningen mellan framträdanden av 5 ' vs. 3 ' mRNA regioner. I detta fall kan man räkna begynnande mRNAs på steady state by smFISH och analysera deras distribution med en analytisk modell som har graden av transkription töjning som en passande parameter20. Också, när en gen av intresse inte är inducible, kan man behandla celler med rifampicin vid tid noll och mäta den tidsmässiga förändringen i 5' och 3' mRNA sub-regioner. Fördröjningen från minskningen av 5' mRNA signal till den av 3' mRNA signal kan sedan användas för att beräkna graden av transkription töjning som gjorttidigare 31.
Slutligen är smFISH-protokollet mångsidigt och kan kombineras med andra märkningsscheman. Tidigare visualiserades DNA-locus tillsammans med mRNAs genom att kombinera mRNA FISH med antingen DNA FISH14 eller fluorescerande reporter-operator system20. Proteinprodukter kan visualiseras genom att man utför immunofluorescens tillsammans med mRNA FISH14,36. Också, det kan kombineras med tredimensionella super-upplösning mikroskopi37 att visualisera mRNAs i alla tredimensionerna 38,39.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta protokoll har utvecklats av S.K. under hennes postdoktorala forskning i Dr. Christine Jacobs-Wagners laboratorium vid Howard Hughes Medical Institute och Microbial Sciences Institute vid Yale University. Vi tackar Dr Jacobs-Wagner och hennes labbmedlemmar för olika ingångar under metodutvecklingen och Laura Troyer för kritisk läsning av manuskriptet. S.K. erkänner stöd från Searle Scholars Program; K.V. erkänner stöd av James Scholar Preble Research Award från University of Illinois.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strain | |||
| Escherichia coli MG1655 | |||
| Chemicals, peptides, and others | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
| Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
| Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
| Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
| Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
| FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
| Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
| Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
| Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
| Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
| 2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
| Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
| Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
| Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
| Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
| Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
| TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
| Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
| Equipment | |||
| C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
| Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
| Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
| Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
| Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
| Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
| UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
| Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
| Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
| Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
| Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
| Tools | |||
| 1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
| 1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
| Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
| Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24x60 No1 |
| Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
| Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Gloves | Microflex | MK-296-M | |
| Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
| Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
| Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
| Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
| MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
| https://oufti.org/ | |||
| Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
| Microscope | |||
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
| Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
| Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
| Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
| Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
| Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
| Probe sequence | |||
| DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
| lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
| lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
| lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
| lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
| lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
| lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
| lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
| lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
| lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
| lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
| lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
| lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
| lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
| lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
| lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
| lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
| lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
| lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
| lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
| lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
| lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
| lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
| lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
| lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
| lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
| lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
| lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
| lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
| lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
| lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
| lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
| lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
| lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
| lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
| lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
| lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
| lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
| lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
| lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
| lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
| lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
| lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
| lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
| lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
| lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
| lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
| lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
| lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
| lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
| lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
| lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
| lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
| lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
| lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
| lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
| lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
| lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
| lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
| lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
| lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
| lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
| lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
| lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
| lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
| lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
| lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA | |
References
- Bervoets, I., Charlier, D. Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).
- Epshtein, V., Nudler, E. Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation. Science. 300 (5620), 801-805 (2003).
- Vogel, U., Jensen, K. F. The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate. Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).
- Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced. Nature Genetics. 9, 184 (1995).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128 (2009).
- Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
- Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
- Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. What do you mean by transcription rate. BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Kuchina, A., et al. Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding. BioRxiv. , 869248 (2019).
- Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing. Nature Microbiology. , (2020).
- Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Montero Llopis, P., et al. Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria. Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).
- So, L. -h, et al. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).
- Taniguchi, Y., et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 329 (5991), 533-538 (2010).
- Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression. Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).
- Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo. Nucleic Acids Research. 44 (18), 142 (2016).
- Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling. Cell. 179 (1), 106-119 (2019).
- Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality. Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).
- Joo, C., Ha, T. Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456 (2006).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Adesnik, M., Levinthal, C. The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).
- Campbell, E. A., et al. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell. 104 (6), 901-912 (2001).
- Raj, A., Tyagi, S. Methods in Enzymology. Walter, N. G. 472, Academic Press. 365-386 (2010).
- Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).
- Paintdakhi, A., et al. Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. Methods in Enzymology. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time. Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).
- Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli. Molecular Systems Biology. 11 (1), 781 (2015).
- Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation. Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).
- Yang, S., et al. Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli. Nature Communications. 10 (1), 5131 (2019).
- Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).
- Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).
- Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states. Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. eLife. 5, 13065 (2016).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
