Summary
Denne artikel indeholder en detaljeret metode til vævsdissociation og cellulære fraktioneringsmetoder, der muliggør berigelse af levedygtige epitelceller fra proksimale og distale regioner i den menneskelige lunge. Heri anvendes disse tilgange til funktionel analyse af lungeepitelprogenitorceller ved brug af 3D-organoidkulturmodeller.
Abstract
Epitelorganoidmodeller tjener som værdifulde værktøjer til at studere den grundlæggende biologi i et organsystem og til sygdomsmodellering. Når de dyrkes som organoider, kan epitelprogenitorceller selvfornye og generere differentierende afkom, der udviser cellulære funktioner svarende til deres in vivo-modstykker . Heri beskriver vi en trin-for-trin protokol til at isolere regionsspecifikke forfædre fra menneskelig lunge og generere 3D-organoidkulturer som et eksperimentelt og valideringsværktøj. Vi definerer proksimale og distale regioner i lungen med det formål at isolere regionsspecifikke stamceller. Vi brugte en kombination af enzymatisk og mekanisk dissociation til at isolere totalceller fra lungen og luftrøret. Specifikke stamceller blev derefter fraktioneret fra de proksimale eller distale oprindelsesceller ved anvendelse af fluorescensassocieret cellesortering (FACS) baseret på celletypespecifikke overflademarkører, såsom NGFR til sortering af basalceller og HTII-280 til sortering af alveolære type II-celler. Isolerede basale eller alveolære type II forfædre blev brugt til at generere 3D-organoidkulturer. Både distale og proksimale forfædre dannede organoider med en kolonidannende effektivitet på 9-13% i distal region og 7-10% i proksimal region, når de blev belagt 5000 celle / brønd på dag 30. Distale organoider opretholdt HTII-280+ alveolære type II-celler i kultur, mens proksimale organoider differentierede sig til cilierede og sekretoriske celler på dag 30. Disse 3D-organoidkulturer kan bruges som et eksperimentelt værktøj til at studere cellebiologien af lungeepitel og epitelmesenkymale interaktioner samt til udvikling og validering af terapeutiske strategier rettet mod epitel dysfunktion i en sygdom.
Introduction
Luftrum i det menneskelige åndedrætssystem kan bredt opdeles i ledende og respiratoriske zoner, der formidler transport af gasser og deres efterfølgende udveksling over henholdsvis epitel-mikrovaskulær barriere. De ledende luftveje omfatter luftrør, bronchi, bronchioler og terminale bronchioler, mens respiratoriske luftrum omfatter respiratoriske bronchioler, alveolære kanaler og alveoler. Epitelforingen af disse luftrum ændrer sig i sammensætning langs den proximo-distale akse for at imødekomme de unikke krav i hver funktionelt særskilt zone. Det pseudostratificerede epitel af tracheo-bronchiale luftveje består af tre hovedcelletyper, basal, sekretorisk og cilieret, ud over de mindre rigelige celletyper, herunder børste, neuroendokrine og ionocyt 1,2,3. Bronchiolære luftveje har morfologisk lignende epitelcelletyper, selv om der er forskelle i deres overflod og funktionelle egenskaber. For eksempel er basalceller mindre rigelige inden for bronchiolære luftveje, og sekretoriske celler omfatter en større andel af klubceller versus serøse og bægerceller, der dominerer i tracheo-bronchiale luftveje. Epitelceller i åndedrætszonen indbefatter en dårligt defineret kuboidcelletype i respiratoriske bronchioler ud over alveolære type I (ATI) og type II (ATII) celler af alveolære kanaler og alveoler 1,4.
Identiteten af epitelstamme- og stamcelletyper, der bidrager til vedligeholdelse og fornyelse af epitel i hver zone, er ufuldstændigt beskrevet og i vid udstrækning udledt af undersøgelser i dyremodeller 5,6,7,8. Undersøgelser på mus har vist, at enten basalceller i pseudostratificerede luftveje eller klubceller i bronchiolære luftveje eller ATII-celler i det alveolære epitel tjener som epitelstamceller baseret på kapacitet til ubegrænset selvfornyelse og multipotent differentiering 7,9,10,11,12 . På trods af manglende evne til at udføre genetiske afstamningsundersøgelser for at vurdere stammeligheden af humane lungeepitelcelletyper, giver tilgængeligheden af organoidbaserede kulturmodeller til vurdering af det funktionelle potentiale af epitelstamme- og stamcelleceller et værktøj til sammenlignende undersøgelser mellem mus og human 13,14,15,16,17.
Vi beskriver metoder til isolering af epitelcelletyper fra forskellige regioner i den menneskelige lunge og deres kultur ved hjælp af et 3D-organoidsystem til at rekapitulere de regionale celletyper. Lignende metoder er udviklet til funktionel analyse og sygdomsmodellering af epitelceller fra andre organsystemer 18,19,20,21. Disse metoder giver en platform til identifikation af regionale epitelprogenitorceller, til at udføre mekanistiske undersøgelser, der undersøger deres regulering og mikromiljø, og for at muliggøre sygdomsmodellering og lægemiddelopdagelse. Selvom undersøgelser af lungeepitelceller udført i dyremodeller kan drage fordel af analysen, enten in vivo eller in vitro, har indsigt i identiteten af humane lungeepitelprogenitorceller i høj grad været afhængig af ekstrapolering fra modelorganismer. Som sådan giver disse metoder en bro til at relatere identiteten og adfærden af humane lungeepitelcelletyper med deres undersøgelser, der undersøger regulering af stam- / stamcelleceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant lungevæv blev opnået fra afdøde vævsdonorer i overensstemmelse med samtykkeprocedurer udviklet af International Institute for Advancement of Medicine (IIAM) og godkendt af Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.
1. Vævsbehandling til isolering af lungeceller fra enten tracheo-bronchiale eller små luftvejs/parenkymale (små luftveje og alveoler) regioner
- Forbered og autoklaver alle dissektionsinstrumenter, glasvarer og passende opløsninger en dag før celleisolering.
- Ved modtagelse af lungevæv skal du identificere og adskille de proksimale og distale regioner. Luftrøret og bronchi betragtes som "proksimale". Med henblik på denne protokol disponeres luftrør og de første 2-3 generationer af bronchi og anvendes til isolering af "proximalt" luftvejsepitel. Små luftveje med en diameter på 2 mm eller derunder og omgivende parenkymvæv betragtes i forbindelse med denne protokol som "distalt" lungeepitel (figur 1A).
BEMÆRK: Alle procedurer, der involverer behandling af humant lungevæv, skal udføres i et biosikkerhedsskab med brug af passende personlige værnemidler.
2. Berigelse og underindstilling af små luftvejs og alveolære epitelceller fra distalt lungevæv
- Distal vævsforberedelse
- Anbring det distale lungevæv i en steril petriskål (150 x 15 mm). Skær væv i ca. 1 cm3 stykker og læg det i et rent 50 ml rør.
- Vask vævet 3x med kølet HBSS, kassér HBSS vask hver gang for at fjerne blod og epitelforingsvæske.
- Læg vævet i en ny petriskål og tør det med sterile anti-fnugservietter. Brug pincet og saks til at fjerne så meget visceral pleura (en delikat gennemsigtig membran, der dækker overfladen af lungen) som muligt.
- Brug en saks til at hakke væv i stykker med en diameter på ca. 2 mm. Overfør hakket væv til en ren petriskål og fars yderligere ved at hakke det til en omtrentlig størrelse på 1 mm med et sterilt enkeltsidet barberblad.
- Fordøjelse af enzymer
BEMÆRK: Liberase stamopløsning er 5 mg / ml (100x) og DNase lager er 2,5 mg / ml (100x) (Materialetabel).- Der tilsættes 50 μg/ml liberase og 25 μg/ml DNase i steril HBSS i et 50 ml konisk rør.
- Overfør ca. 2-3 g hakket væv til et nyt 50 ml konisk rør med 25 ml HBSS, indeholdende Liberase og DNase. Inkuberes i 40-60 minutter ved 37 °C med kontinuerlig omrystning ved hjælp af en mixer indstillet til 900 o / min. Efter 30 minutters inkubation tritureres fordøjet væv ved hjælp af en 30 ml sprøjte uden en nål for at undgå dannelse af klumper og fortsætte med inkubationen.
BEMÆRK: Inkubationstiden med enzymerne kan variere afhængigt af vævets type eller tilstand. For eksempel tager enzymatisk fordøjelse af normalt væv ca. 45 min. Fibrotisk væv fra idiopatiske lungefibroseprøver kan dog kræve en længere inkubationstid på op til 60 minutter. Overvåg derfor væv omhyggeligt under dette trin for at forhindre beskadigelse af overflademarkørerne, hvilket er afgørende for FACS.
- Isolering af en enkelt celle
- Triturer vævet ved at trække 5x gennem en 16 G nål monteret på en 30 ml sprøjte. Vævssuspensionen trækkes ind i en bredboret pipette, og der føres gennem en række cellesiene (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) under vakuumtryk. Silen vaskes med 20 ml HBSS+-buffer for at opsamle de resterende celler. Opskriften på HBSS+ buffer findes i Materialetabel.
- Tilsæt et tilsvarende volumen HBSS+ buffer efter 45 minutter til filtratet for at hæmme Liberase-aktiviteten og forhindre overfordøjelse.
- Centrifugefiltrater ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten. Tilsæt 1 ml røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer til pelleten, vip forsigtigt røret for at løsne pelleten og inkuberes på is i 1 min.
BEMÆRK: Mængden og tiden i RBC lysis-opløsningen afhænger af pelletens størrelse. Det er vigtigt at opretholde cellerne på is og overvåge tiden i RBC lysis opløsning omhyggeligt for at forhindre lysis af målceller. Hvis RBC lysis er utilstrækkelig, gentages trinnet. - Tilsæt 10-20 ml HBSS + buffer for at neutralisere RBC lysis buffer. Centrifugefiltrater ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis lysede røde blodlegemer (spøgelsesceller) danner et uklart lag over cellepillen, skal du resuspendere pellet i 10 ml HBSS + buffer og sil suspensionen gennem 70 μm cellesi for at eliminere spøgelsescellerne. Filtratet centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C, og der fortsættes med yderligere trin.
- Udtømning af immunceller og endotelceller (valgfrit trin)
- Udtøm CD31+ endotelceller og CD45+ immunceller fra puljen af samlede celler ved hjælp af CD31 - og CD45-mikroperler konjugeret med monoklonalt anti-humant CD31- og CD45-antistof (isotype mus IgG1) og LS-kolonner i overensstemmelse med producentens protokol (materialetabel).
- Strømmen, der primært består af epitel- og stromalceller, opsamles i et frisk sterilt rør, og den centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Udfør et celleantal for at fastslå det samlede antal celler i flowet igennem.
- Celleoverfladefarvning til fluorescensassocieret cellesortering (FACS)
- Resuspend 1 x 107 celler pr. 1 ml HBSS + buffer. Der tilsættes primære antistoffer ved den krævede koncentration, og cellerne inkuberes i 30 minutter ved 4 °C i mørke. I denne undersøgelse blev fluoroforkonjugerede primære antistoffer anvendt, medmindre andet er angivet. Detaljer om antistofkilder og titere er beskrevet i materialetabel.
BEMÆRK: HTII-280 er i øjeblikket det bedste overfladereaktive antistof, der tillader underindstilling af distale lungeceller i overvejende luftvejs (HTII-280-) og alveolære type 2 (HTII-280+) cellefraktioner. En advarsel til denne strategi er, at AT1-celler ikke er farvet ved hjælp af denne metode og er dårligt repræsenteret på grund af deres skrøbelighed. AT1-celler er imidlertid dårligt repræsenteret i distale lungepræparater, formodentlig på grund af deres skrøbelighed og tab under udvælgelse af levedygtige celler af FACS og repræsenterer således kun et sjældent forurenende stof i luftvejscellefraktionen. - Cellerne vaskes ved at tilsætte 3 ml HBSS+-buffer og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis der anvendes ukonjugerede primære antistoffer, tilsættes den krævede koncentration af et passende fluoroforkonjugeret sekundært antistof og inkuberes i 30 minutter på is. Overskydende sekundært antistof vaskes af ved tilsætning af 3 ml HBSS+-buffer og centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Kassér supernatant- og resuspendcellerne i HBSS+ buffer pr. 1 x 107 celler/ ml. Filtrer celler i 5 ml polystyrenrør gennem en silhætte for at sikre dannelse af en enkeltcellesuspension. Tilsæt DAPI (1 μg/ml) for at plette gennemtrængelige (døde) celler.
BEMÆRK: Det er vigtigt at anvende passende enkeltfarve- og fluorescens minus en (FMO) kontroller (dvs. antistoffarvningscocktail minus et antistof hver) for at minimere falske positiver under FACS. I denne undersøgelse blev positive og negative selektionsperler anvendt til empirisk kompensation for overlapning af emissionsspektre mellem fluorophorer (Materialetabel). FACS beriger celletyper af interesse. Levedygtige epitelceller beriges baseret på deres CD45-negative, CD31-negative, CD236-positive celleoverfladefænotype og negativ farvning for DAPI. Denne epitelcellefraktion kan yderligere subsettes baseret på farvning til celletypespecifikke overflademarkører, såsom specifik farvning til HTII-280-positive celler, der er beriget til AT2-celler. I modsætning hertil tillader negativ selektion for HTII-280 berigelse af små luftvejsepitelceller såsom klub- og cilierede celler (figur 2).
- Resuspend 1 x 107 celler pr. 1 ml HBSS + buffer. Der tilsættes primære antistoffer ved den krævede koncentration, og cellerne inkuberes i 30 minutter ved 4 °C i mørke. I denne undersøgelse blev fluoroforkonjugerede primære antistoffer anvendt, medmindre andet er angivet. Detaljer om antistofkilder og titere er beskrevet i materialetabel.
3. Berigelse og underindstilling af epitelprogenitorceller fra luftrør-bronchiale luftveje
- Væv forberedelse
- Dissekere proksimale luftveje (luftrør/bronkier) fra lungerne. Åbn luftveje langs deres længde ved hjælp af en saks for at udsætte lumen og tilsæt 50 μg / ml Liberase for fuldt ud at dække vævet.
- Inkuberes i 20 minutter ved 37 °C med kontinuerlig omrystning ved hjælp af en termoblander indstillet til 900 o / min.
- Fjern den proksimale luftvej fra centrifugerøret og læg den i en steril petriskål (150 x 15 mm). Skrab forsigtigt overfladen af luftvejene ved hjælp af en skalpel for fuldstændigt at fjerne luminale epitelceller fra vævet.
- Petriskålen vaskes med 5 ml steril HBSS+-buffer for at opsamle alle løsnede luminale epitelceller og overføre de løsnede celler til 50 ml konisk centrifugerør. Triturer suspensionen ved at trække 5x til 16 G nål og 18 G nål monteret på en 10 ml sprøjte for at få enkeltcelle suspension.
- Suspensionen centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspend pelleten i frisk HBSS + buffer og opbevar disse luminale luftvejsceller på is, klar til at blive kombineret med enkeltcellesuspensionen genereret fra de hakkede proksimale luftveje i de kommende trin.
- Brug en saks til at skære resterende trakeo-bronchialt væv langs dets ringe for at generere små strimler væv og overføre strimlerne til en frisk petriskål. Hak vævsstrimlerne ved hjælp af et enkeltsidet barberblad for at lave mindre stykker.
BEMÆRK: Da de proksimale luftveje er brusk, kan de ikke hakkes så fint som det distale lungevæv. - Overfør hakket væv til C-rørene, tilsæt 2 ml Liberase til røret, hvilket sikrer, at vævet er nedsænket. Læg C-røret på den automatiserede dissociator, og kør Human Lung Protocol-2 for mekanisk at dissociere væv yderligere.
BEMÆRK: Dissociatoren, der anvendes i denne protokol, tilbyder et optimeret program kaldet human lung protocol-2 til denne specifikke applikation (se Materialetabel).
- Enzymfordøjelse og enkeltcelleisolering
- Ca. 2 g hakket proximalt væv fra C-røret overføres til hvert 50 ml konisk centrifugerør, og der tilsættes 50 μg/ml Liberase og 25 μg/ml DNase-opløsning til hvert rør.
BEMÆRK: For at sikre effektiv dissociation bør rør ikke fyldes ud over 30 ml-mærket. - Det hakkede væv inkuberes i 45 minutter ved 37 °C med kontinuerlig omrystning ved hjælp af en mixer indstillet til 900 o/min.
- Den dissocierede vævssuspension føres gennem en række cellesikker (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) under vakuumtryk som nævnt ovenfor, og strømmen opsamles. Silen vaskes med 20 ml HBSS+-buffer for at opsamle de resterende celler.
BEMÆRK: Da proksimalt væv er brusk og omfangsrigt sammenlignet med det distale væv, er der en større mulighed for tilstopning af filtrene. Brug af en tragt kan hjælpe med at forhindre overløb af væsken, mens den passerer gennem silene. - Tilsæt et tilsvarende volumen HBSS+ buffer til filtratet for at hæmme Liberase-aktiviteten og forhindre overfordøjelse. De isolerede luminale proksimale luftvejsceller fra 3.1.5 tilsættes til cellesuspensionen på dette trin.
- Centrifuger den kombinerede cellesuspension ved 500 x g i 10 min. Fjern supernatanten, og gentag cellevasken i HBSS+ buffer. Udfør udtømning af CD45+ immunceller og CD31+ endotelceller som nævnt ovenfor i 2.4 (valgfrit trin).
- Metoder til farvning ligner distalt lungevæv, følg trinene i 2.5. Berige levedygtige epitelceller baseret på deres CD45-negative, CD31-negative, CD236-positive celleoverfladefænotype og negativ farvning for DAPI.
- Yderligere delmængde epitelcellefraktionen baseret på farvning til celletypespecifikke overflademarkører, såsom NGFR, hvilket muliggør berigelse af basale (NGFR-positive) og ikke-basale (NGFR-negative; sekretoriske, cilierede, neuroendokrine) celletyper (figur 3).
- Ca. 2 g hakket proximalt væv fra C-røret overføres til hvert 50 ml konisk centrifugerør, og der tilsættes 50 μg/ml Liberase og 25 μg/ml DNase-opløsning til hvert rør.
4. Organoid kultur
- Tilføj 5.000 (dette tal kan justeres for at give den ønskede tæthed af epitelorganoider) sorterede proksimale eller distale epitelceller til sterile 1,5 ml rør sammen med 7,5 x 104 MRC-5 celler (human lungefibroblastcellelinje). Epitel-mesenkymale interaktioner er kritiske for udvidelsen af stamceller.
- Centrifuger ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Det er vigtigt manuelt at bekræfte celletallet opnået fra sortereren for at sikre nøjagtigheden organoidkolonidannelseseffektivitet. - Fjern og kassér forsigtigt supernatanten, og resuspender cellepillen i 50 μL iskolde medier suppleret med antibiotika. Opbevar celleophænget på is.
- Der tilsættes 50 μL iskoldt 1x vækstfaktorudtømt kældermembranmatrixmedium til hætteglasset, og afpipetter forsigtigt suspensionen på is for at blande.
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge iskolde medier og vedligeholde celler på is for at undgå for tidlig polymerisation af kældermembranmatrixmediet. - Cellesuspensionen overføres til cellekulturindsatsen i porestørrelse på 0,4 μm i en 24-brøndplade (1,4 x 104 celler/cm2), idet man sørger for at undgå indføring af luftbobler.
- Inkuberes ved 37 °C i 30-45 min. for at tillade matrixen at størkne.
- Tilsæt 600 μL forvarmet vækstmedium til brønden.
BEMÆRK: Media blev suppleret med antimykotiske midler (0,4%) og Pen strep (1%) i de første 24 timer efter såning og 10 μM Rho kinase inhibitor i de første 72 timer. - Kultur ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 30 dage, i hvilket tidsrum mediet skal skiftes hver 48. time.
BEMÆRK: Kulturens varighed kan ændres baseret på formålet med eksperimentet. Længere endepunkter bruges til at studere differentiering, mens kortere endepunkter på 7 dage, 14 dage osv. kan bruges, hvis formålet med eksperimentet ikke er at opnå fuldstændig differentiering. - Tilsæt 10 μM TGFβ-hæmmer til kulturmediet i 15 dage for at opretholde cellerne i den proliferative fase og undertrykke overvækst af fibroblaster.
BEMÆRK: Resultaterne varierer afhængigt af det kulturmedium, der anvendes til analysen. For eksempel blev resultaterne vist heri genereret ved hjælp af Pneumacult-ALI Medium, hvilket resulterer i dannelsen af store organoider fra distal lunge, godt differentierede og større organoider fra proksimal lunge.
5. Organoid farvning
- Fastgørelse og indlejring af organoider
- Aspirer medier fra både de øvre og nedre transmembranindsættelseskamre og skyl en gang med varm PBS.
- Kulturerne fikseres ved at anbringe 300 μL PFA (2 % w/v) i indsatsen og 500 μL i brønden i 1 time ved 37 °C. Fjern fikseringsmidlet, og skyl med varm PBS, og pas på, at basememtmembranmatrixproppen ikke løsnes.
BEMÆRK: Faste organoider kan opbevares nedsænket i PBS ved 4 °C i en til to uger, før der påbegyndes yderligere trin. - Aspirer PBS, vend indsatsen og skær forsigtigt indsatsmembranen rundt om dens periferi. Brug pincet til at fjerne transwellmembranen, og pas på ikke at forstyrre matrixstikket.
- I en petriskål skal du trykke på indsatsen for at gendanne matrixstikket.
- Der tilsættes en dråbe prøvebehandlingsgel, såsom Histogel (ved 37 °C), til matrixproppen, og gelen holdes ved 4 °C, indtil gelen størkner.
- Overfør stikket til en indlejringskassette, dehydrere gennem stigende koncentrationer af ethanol (70, 90 og 100%), klar i xylen og indlejre i paraffinvoks.
- Skær 7 μm sektioner på en mikrotom og saml på positivt ladede dias.
- Immunofluorescensfarvning af organoider
- Placer dias ved 65 ° C i 30 minutter for at afvoks.
- Deparaffiniser sektionerne ved nedsænkning i xylen og rehydrere gennem faldende koncentrationer af ethanol.
- Udfør højtemperatur antigenhentning i antigenafmaskeringsopløsning, citronsyrebase ved hjælp af en kommercielt tilgængelig retriever ved at dyppe dias i opløsningen i 15 minutter (materialetabel).
- Omgiv vævet med en hydrofob barriere ved hjælp af en pappen.
- Bloker ikke-specifik farvning mellem de primære antistoffer og vævet ved at inkubere i Blokeringsbuffer.
- Sektioner inkuberes i den passende koncentration af primære antistoffer fortyndet i inkubationsopløsning natten over ved 4 °C i et befugtet kammer.
- Skyl sektioner 3x ved stuetemperatur med en vaskebuffer.
- Der inkuberes i den passende koncentration af fluorokromkonjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur.
- Skyl sektioner 3x ved stuetemperatur med 0,1% Tween 20-TBS. Inkuber sektioner i 5 minutter i DAPI (1 μg/ml). Skyl sektionerne én gang i TBS (Tris-bufferet saltvand) med 0,1% Tween 20, tør og monter i en monteringsopløsning (figur 4 og figur 5).
BEMÆRK: Kilde- og optimal arbejdsfortynding af primære og sekundære antistoffer, der anvendes til immunfluorescensfarvning, er inkluderet i materialetabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kilde lungevæv
Luftrøret og ekstrapulmonal bronchus (figur 1A) blev anvendt som kildevæv til isolering af proksimale luftvejsepitelceller og efterfølgende generation af proksimale organoider. Distalt lungevæv, der omfatter både parenchyma og små luftveje på mindre end 2 mm i diameter (figur 1A), blev anvendt til isolering af små luftvejs- og alveolære epitelceller (distal lungeepitel) og generering af enten små luftveje eller alveolære organoider. Proksimale luftveje foret med et pseudostratificeret epitel indbefatter rigelige basale stamceller, der er immunreaktive for membranproteinet NGFR (figur 1B, C). I modsætning hertil omfattede epitelceller, der forede alveoler, en delmængde, der viste apikal membranimmunreaktivitet med HTII-280 monoklonalt antistof, hvilket tyder på deres alveolære type 2-celle (AT2) identitet (figur 1B, D). Disse overflademarkører blev brugt til at subset af enkeltcellesuspensioner af epitelceller isoleret fra enten proksimale eller distale regioner.
Vævsdissociation og cellefraktionering
Enkeltcellesuspensioner af samlede celler blev isoleret fra enten proksimale eller distale regioner af humant lungevæv og fraktioneret ved hjælp af både magnetisk perle og FACS for at give berigede epitelcellepopulationer (figur 2 og figur 3). Rigelige forurenende celletyper, herunder røde blodlegemer, immunceller og endotelceller, blev farvet ved hjælp af antistoffer mod henholdsvis CD235a, CD45 og CD31 efterfulgt af magnetisk associeret cellesortering til udtømning af disse celletyper fra den samlede pulje af lungeceller. De resulterende "udtømte" cellesuspensioner blev signifikant beriget for epitelcellepopulationer i både distale (figur 2E) og proksimale (figur 3E) vævsprøver med tilsvarende stigning i FACS-effektiviteten. Efter udtømning af CD235a/CD45/CD31 positive celler ved hjælp af CD45 &CD31 mikroperler steg procentdelen af CD31-/CD45-/CD235a- fra 14% (figur 2A,B) til 51,7% (figur 2E,F) i distal population. Yderligere FACS-udtømning af celler, der pletter positivt for enten CD235a, CD45 eller CD31, eliminering af celler med positiv farvning for DAPI og positiv selektion for epitelcelleoverflademarkøren CD326, førte til en højt beriget distal cellepopulation, der tegnede sig for 33,5% (figur 2E, G) sammenlignet med 7% (figur 2A, C ) før udtømning af negativ befolkning. Yderligere underindstilling af distale epitelcellepopulationer blev opnået ved fraktionering baseret på overfladefarvning med henholdsvis HTII-280 monoklonalt antistof (figur 2D, H). Følgelig omfattede distale lungeepitelceller 4,3% HTII-280+ og 2,6% HTII-280- delmængder (figur 2D uden udtømning af CD31/CD45/CD235a) og 30% HTII-280+ og 3,6% HTII-280- delmængder (figur 2H efter udtømning af CD31/CD45/CD235a).
De samlede celler isoleret fra det proksimale område blev udtømt for CD235a/CD45/CD31 positive celler ved hjælp af CD45 &CD31 mikroperler og procentdelen af CD31-/CD45-/CD235a- steg fra 17% (figur 3A,B) til 56,6% (figur 3E,F). Positiv selektion for epitelcelleoverflademarkøren CD326 i celler isoleret fra det proksimale område førte til en højt beriget proksimal cellepopulation, der tegnede sig for 38% (figur 3E,G) af de samlede lungecellefraktioner sammenlignet med 9,3% (figur 3A, C) uden udtømning af henholdsvis negativ population. Yderligere underindstilling af proksimale epitelcellepopulationer blev opnået ved fraktionering baseret på overfladefarvning med antistoffer mod henholdsvis NGFR (figur 3D, H). Følgelig omfattede proksimale lungeepitelceller 2,7% NGFR+ og 6,5% NGFR-delmængder (figur 3D uden udtømning af CD31/CD45/CD235a) og 13% var NGFR+ og 25% NGFR- (figur 3H efter udtømning af CD31/CD45/CD235a).
Lungeorganoid kulturer
Distale lungeepitelorganoider blev dyrket inden for vækstfaktorudtømt kældermembranmatrix i medier, der blev empirisk testet for at optimere for organoid vækst og differentiering. Tre forskellige medier blev evalueret, herunder PneumaCult-ALI-medium, lille luftvejsepitelcellevækstmedium (SAECG-medium) og musebasalsmedium. Optimal organoidvækst blev opnået under anvendelse af PneumaCult-ALI-medium, som blev udvalgt til yderligere undersøgelser. Kulturer af HTII-280+ distale lungeepitelceller gav hurtigt ekspanderende organoider med en gennemsnitlig kolonidannende effektivitet på 10% (figur 4A, B). Immunfluorescensfarvning af dag 30-kulturer ved anvendelse af HTII-280 og SPC monoklonalt antistof afslørede lumenholdige organoider, der overvejende består af HTII-280+ og SPC+ distale lungeepitelceller (figur 4C, C 'og figur 4D, D'). Kulturer af distal lungeepitel HTII-280-celler gav organoider, der var sammensat af et pseudostratificeret epitel, der lignede små luftveje (ikke vist).
Proksimale lungeepitelorganoider blev dyrket fra NGFR+ celler podet i Matrigel og dyrket i 30 dage i PneumaCult-ALI-medium. Store lumenholdige organoider blev observeret (figur 5D, E, F) med en gennemsnitlig kolonidannende effektivitet på 7,8% (figur 5A, B, C). Organoider var sammensat af et pseudostratificeret epitel sammensat af selvfornyende Krt5+ og NGFR+ basalceller (figur 5D, 5E) og differentierede luminale celletyper, herunder FoxJ1+ cilierede celler og MUC5AC+ sekretoriske celler (figur 5D,E).
Figur 1: Prøveudtagning af humant lungevæv. (A) Skematisk repræsentation af den humane lunge, der viser strategi for prøveudtagning af proksimale og distale regioner til celleisolering. (B) H&E farvning af de proksimale og distale områder af lungen. (C,D) Immunofluorescerende farvning af tilsvarende regioner, der viser NGFR+ basale stamceller (rød) ved kældermembranen i bronchiale luftveje og HTII-280+ alveolære type II-forfædre (grøn) i alveolerne. skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ sorteringsstrategi for distale lungeceller. (A,E) Procentdel af forskellige cellepopulationer før og efter udtømning af CD45 + og CD31 + population ved hjælp af CD31 og CD45 magnetiske perler i distale områder af lungen fra en biologisk prøve. (B,F) Repræsentativt billede af FACS-plot, der viser gatingstrategi for distal CD31-/CD45-/CD235a-population før og efter udtømning af CD31/CD45/CD235a positiv population (C,G) Epcam+ population før og efter udtømning af CD31/CD45/CD235a positiv population. (D,H) HTII-280+/- population før og efter udtømning af CD31/CD45/CD235a positive celler. Paneler A-D er fra den samme biologiske prøve, og paneler E-H er fra den samme biologiske prøve. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativ sorteringsstrategi for proksimale lungeceller. (A,E) Procentdel af forskellige cellepopulationer før og efter udtømning af CD45+ og CD31+ population ved hjælp af CD31 og CD45 magnetiske perler i proksimale områder af lungen. (B,F) Repræsentativt billede af FACS-plot, der viser gatingstrategi for proximal CD31-/CD45-/CD235a-population før og efter udtømning af CD31/CD45/CD235a positiv population (C,G) Epcam+ population før og efter udtømning af CD31/CD45/CD235a positiv population. (D,H) NGFR+/- population før og efter udtømning af CD31/CD45/CD235a positive celler. Panelerne A-D og E-H blev fremstillet ud fra to forskellige biologiske prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Karakterisering af distale lungeorganoider. (A) Repræsentativt billede af de humane distale organoider dyrket i PneumaCult-ALI-medium (2x forstørrelse). (B) Koloniformningseffektiviteten (%CFE) blev beregnet på tredobbelte brønde af organoider afledt af to forskellige biologiske prøver. (C, C') Immunofluorescerende farvning af tilsvarende distale organoider dyrket i ALI-medium, der viser HTII-280+ AT2-celler (grøn). (D, D') Markøren, der anvendes til isolering af AT2-celler i denne undersøgelse, HTII-280 costainer (grøn) til den anden godt karakteriserede AT2-cellemarkør , SPC (rød). Skala bar = 50um. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Karakterisering af proksimale organoider fra den humane proksimale lunge. (A,B) Repræsentativt billede af de humane proksimale organoider dyrket i PneumaCult-ALI medium skala bar 50 μm. (C) Den procentvise kolonidannende effektivitet (% CFE) blev beregnet på tredobbelte brønde af organoider afledt af to forskellige biologiske prøver. Immunofluorescerende farvning af differentierede proksimale organoider på dag 30 med (D) Krt5+ basalceller (grøn), FoxJ1+ cilierede celler (rød) (E) Krt5+ basalceller (grøn) og MUC5AC+ bægerceller (rød). (F) Den markør, der blev anvendt til isolering af basalceller i denne undersøgelse, NGFR (grøn) co-pletter for den godt karakteriserede basalcellemarkør, Krt5 (rød). Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en pålidelig metode til isolering af definerede underpopulationer af lungeceller fra humant lungevæv til enten molekylær eller funktionel analyse og sygdomsmodellering. Kritiske elementer i metoder omfatter evnen til at opnå vævsdissociation med bevarelse af overfladeepitoper, som tillader antistofmedieret berigelse af frisk isolerede celler og optimering af kulturmetoder til effektiv dannelse af regionsspecifikke epitelorganoider. Vi fokuserer på genopretning og berigelse af epitelprogenitorceller, der er i stand til at danne organoider, når de rekombineres med stromale støtteceller i tredimensionel kultur. Selvom vi ikke definerede organoidernes klonalitet i disse kulturer, viste lignende undersøgelser udført ved hjælp af isolerede muselunge epitelceller at være klonalt baseret på brug af blandede kulturer af celler, der huser forskellige fluorescerende journalister22,23.
Metoder beskrevet heri omfatter tilpasninger, der har til formål at forbedre cellegendannelse fra fordøjet lungevæv. Fordøjede prøver føres gennem en 16-gauge nål for yderligere at forstyrre eventuelle resterende ufordøjede klumper og for at opnå en homogen cellesuspension. Celleaggregering forårsaget af ekstruderet genomisk DNA blev afbødet ved tilsætning af DNase I, som producerede et homogent cellepræparat, der tilvejebringer en uafbrudt fluidisk strøm under FACS-isolering. Sammen forbedrer disse enkle ændringer genopretningen af målcellepopulationerne og undgår forsinkelser på grund af klumpning under FACS-berigelse.
Tidligere protokoller kræver vævsfordøjelse med Elastase, dispase og tripsin/2 mM EDTA for at give en enkeltcellesuspension før celleisolering 4,5. Denne kombination af proteaser fører imidlertid til tab af overfladeproteiner og kræver, at celler dyrkes natten over på purcolbelagte kulturretter til reekspression af overfladeproteiner inden antistoffarvning og FACS. I modsætning hertil giver kombinationen af Liberase og mekanisk omrøring for forsigtigt at forstyrre lungevæv en mere effektiv, men mildere dissociationsprotokol, der kan udføres hurtigere, samtidig med at overfladeepitoper bevares til antistoffarvning og FACS-berigelse. Således kondenseres den samlede vævsbehandlingstid, og FACS-isolering kan udføres umiddelbart efter vævsdissociation.
Disse metoder muliggør isolering og in vitro-dyrkning af epitelprogenitorceller, der giver specialiseret afkom, der er repræsentativt for deres oprindelsesregion. Disse metoder kan imidlertid anvendes på samme måde til identifikation og berigelse af andre cellepopulationer såsom immun-, vaskulære og stromale celletyper. Dette kan især være relevant for udviklingen af regionale lungeepitel-on-chip-systemer, der muliggør modellering af vaskulære og epitelrum og introduktion af andre celletyper såsom immunceller 24,25,26. I en nylig undersøgelse brugte vi 3D-organoidkulturer af alveolær epitel genereret ved hjælp af denne metode blev brugt som et værktøj til at studere COVID 19-modellering af lungen og til at screene terapeutiske mål mod SARS-CoV-2-infektion. 27
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi sætter pris på støtte fra Mizuno Takako til IFC og H og E farvning, Vanessa Garcia til vævssektionering og Anika S Chandrasekaran til at hjælpe med manuskriptforberedelse. Dette arbejde støttes af National Institutes of Health (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) og Celgene IDEAL Consortium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation | |||
| 10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | Fisher scientific | BD 309646 | |
| 30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip | VWR | BD302832 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| Biohazard bags | VWR | 89495-440 | |
| connecting ring | Pluriselect | 41-50000-03 | |
| Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V) | sigma Aldrich | DN25-1G | |
| Disposable Petri dishes | Corning/Falcon | 25373-187 | |
| Funnel | Pluriselect | 42-50000 | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| Liberase TM Research Grade | sigma Aldrich | 5401127001 | |
| needle 16G | VWR | 305198 | |
| needle 18G | VWR | 305199 | |
| PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50100-51 | |
| PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50300-03 | |
| PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50040-51 | |
| PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50500-03 | |
| PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer) | Pluriselect | 43-50070-51 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| Red Blood Cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Equipment’s | |||
| GentleMACS C Tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS Octo Dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| Leica ASP 300s Tissue processor | |||
| LS Columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand** | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 05-412-503 | |
| HBSS+ Buffer | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 2ml |
| EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | Thermo fisher scientific | AM9260G | 500µl |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 10ml |
| HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml | VWR | 45000-456 | 500ml bottle |
| HEPES (1 M) | Thermo fisher scientific | 15630080 | 5ml |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 5ml |
| List of antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 369820 | 1:50 |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set | Fisher Scientific | BDB552843 | |
| CD31 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | 20µl/ 107 total cells |
| CD45 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | 20µl/ 107 total cells |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-10MG | 1:10000 |
| FITC anti-human CD235a | BioLegend | 349104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD31 | BioLegend | 303104 | 1:100 |
| FITC anti-human CD45 | BioLegend | 304054 | 1:100 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Mouse IgM anti human HT2-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 1:300 |
| PE anti-human CD271(NGFR) | BioLegend | 345106 | 1:50 |
| Composition of Organoid Culture mediums | |||
| MRC-5 | ATCC | CCL-171 | |
| PneumaCult -ALI Medium | Stemcell Technologies | 5001 | |
| Small Airway Epithelial Cell Growth Medium | PromoCell | C-21170 | |
| ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile | Greiner Bio-One | 662641 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x) | Stemcell Technologies | 72302 | |
| Mouse Basal medium: | |||
| Amphotericin B | Thermo fisher scientific | 15290018 | 50 µl |
| DMEM/F-12, HEPES | ThermoFisher scientific | 11330032 | 50 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | 5 ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X) | ThermoFisher scientific | 41400045 | 500 µl |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture | Thermo fisher scientific | 15640055 | 500 µl |
| SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM) | Stem cell | 72234 | 5 µl |
| List of antibodies for Immunohistochemistry | |||
| Antigen unmasking solution, citric acid based | Vector | H-3300 | 937 µl in 100ml water |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Primary Antibodies | |||
| Anti HT2-280 | Terracebiotech | TB-27AHT2-280 | 1:500 |
| FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5) | Thermo Fisher Scientific | 14-9965-82 | 1:300 |
| Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody | R and D systems | MAB4218 | 1:300 |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059] | Biolegend | 905901 | 1:500 |
| MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1) | Thermo Fisher Scientific | MA5-12178 | 1:300 |
| PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1) | LifeSpan Biosciences | LS-C143022-100 | 1:300 |
| Purified Mouse Anti-E-Cadherin | BD biosciences | 610182 | 1:1000 |
| Sox-2 Antibody | Santa Cruz biotechnologies | sc-365964 | 1:300 |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit lgG, 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | 1:500 |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | BioLegend | 406506 | 1:500 |
| Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21113 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21134 | 1:500 |
| Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-21144 | 1:500 |
| Buffers | |||
| Immunohistochemistry Blocking Solution | 3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline) | ||
| Immunohistochemistry Incubation Solution | 3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS | ||
| Immunohistochemistry Washing Solution | TBS with 0.1% Tween 20 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
- Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
- McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
- Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Weber, C.
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
- Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
- Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).
