Denne protokollen gir en omfattende prosedyre for å fremstille menneskelig iPS celle-avledet motor nerve organoid gjennom spontan montering av en robust bunt av aksoner utvidet fra en sfæroid i en vev kultur chip.
En fascicle av aksoner er et av de store strukturelle motivene observert i nervesystemet. Forstyrrelse av akson fascicles kan forårsake utviklings- og nevrodegenerative sykdommer. Selv om mange studier av aksoner er utført, er vår forståelse av dannelse og dysfunksjon av akson fascicles fortsatt begrenset på grunn av mangel på robuste tredimensjonale in vitro-modeller. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for rask generering av en motornerve organoid (MNO) fra humane induserte pluripotente stamceller (iPS) i en mikrofluidisk-basert vevskulturbrikke. Først er fabrikasjon av chips som brukes til metoden beskrevet. Fra menneskelige iPS-celler dannes en motorneuronspæroid (MNS). Deretter overføres den differensierte MNS til brikken. Deretter vokser aksoner spontant ut av spheroiden og monteres i en fascicle i et mikrokanals utstyrt i brikken, noe som genererer et MNO-vev som bærer en bunt av aksoner som strekker seg fra sfæroidet. For nedstrømsanalysen kan MNOer tas ut av brikken som skal fikses for morfologiske analyser eller dissekeres for biokjemiske analyser, samt kalsiumavbildning og multielektrodearrayopptak. MNOer generert med denne protokollen kan lette narkotikatesting og screening og kan bidra til forståelse av mekanismer underliggende utvikling og sykdommer i akson fascicles.
Spinalmotornevroner (MN) utvider aksoner til skjelettmuskler for å kontrollere kroppsbevegelse. Deres aksonære baner er svært organisert og regulert i utviklingsprosessen. Til tross for mange studier på axon forlengelse ogveiledning 1, mekanismer for organisert axon bunt formasjon er fortsatt under etterforskning. Aksoner av motoriske nevroner blir ofte skadet av nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS)2, men patofysiologiske mekanismer for skaden på aksonfascikaler er dårlig forstått. Dermed er det nødvendig med en fysiologisk og patologisk modell for å rekapulere aksonbuntdannelse og regresjon i feltet.
En menneskelig stamcelleavledet motor neuron er en lovende plattform for å forstå utvikling og sykdommer som ALS3. Humane induserte pluripotente stamceller (iPS-celler) kan brukes til å modellere sykdommer ved hjelp av pasientavledede celler. Til dags dato har ulike differensieringsmetoder fra pluripotente stamceller til MN blittrapportert 4,5,6. Imidlertid er aksoner av nevroner i todimensjonal kultur tilfeldig orientert og ikke rekafulere in vivo mikromiljø i å utvikle nerver der aksoner er enveis montert gjennom tette axo-aksonale interaksjoner7. For å overvinne dette problemet har vi utviklet en teknikk for å generere et tredimensjonalt vev som ligner motornerve fra humane iPS-celler8, og kalt vevet som motornerveorganoid (MNO). MNO består av cellelegemer som ligger i en motor neuron spheroid (MNS) og en aksonal fascicle utvidet ut fra sfæroid. Aksonene i fascicleen er enveisorienterte, som ligner aksoner i utviklingen av motornerver. Derfor gir MNOer unikt et fysiologisk aksonalt mikromiljø, som ikke ble gjort av noen andre tidligere utviklede nevronale kulturmetoder.
I denne protokollen beskriver vi metoder for vevkulturchipsfabrikasjon, rask motor neuron differensiering og motornerve organoid dannelse i utviklede chips. Vår vev kultur chip er veldig enkel, og den inneholder bare et rom for å akseptere en sfæroid, en mikrokanal for å danne en axon bunt, og et rom for bolig axon terminaler. Enheten inneholder ikke komplekse strukturer, inkludert mikrogropoer eller mikroporefiltre som ofte brukes til å skille aksoner og cellelegemer etterstørrelse 9,10. Derfor kan våre enheter enkelt fremstilles ved å følge trinnene som er beskrevet i denne protokollen hvis et fotolitografioppsett er tilgjengelig.
Rask differensiering av humane iPS-celler oppnås med en optimalisert kombinasjon av induserende og mønsterfaktorer (SB431542, LDN-193189, retinsyre (RA) og glattet agonist (SAG)) og akselerasjonsfaktorer (SU5402 og DAPT). Det har blitt rapportert at kombinasjonen av SU5402 og DAPT akselererer differensieringen av perifere nevroner og nevrale crest celler11. I denne protokollen tilbyr vi tre forskjellige metoder for å generere MNOer, slik at leserne kan bestemme en metode som passer best til deres behov. Vi anbefaler at du utfører differensiering av humane iPS-celler etter å ha dannet en sfæroid (3D-metoden), siden differensierte MNS kan overføres direkte til en vevskulturbrikke. Alternativt kan menneskelige iPS-celler differensieres til motoriske nevroner i monolayer (2D) kultur, og deretter opprettet i tredimensjonale motor neuron sfæroider som vi tidligere rapporterte8. Vi har oppdatert protokollen, og med den tredimensjonale differensieringsmetoden som er beskrevet i denne protokollen, kan overgangen fra 2D til 3D unngås og MNOer kan oppnås med kortere differensieringstid, færre trinn og redusert teknisk risiko uten dissosiasjonstrinnet. Kommersielt tilgjengelige nevroner kan også brukes til å generere MNS for å redusere tiden for differensiering.
For å generere en MNO, dyrket vi en MNS i vevskulturbrikken. Aksonene strekker seg fra spheroiden og strekker seg inn i mikrokanal der aksoner samler og justerer seg enveis. Dette forenkler axo-aksonær interaksjon og spontan dannelse av et tett montert enveis buntvev av aksoner i mikrokanal, som er unikt oppnådd ved denne protokollen, mens enten spontan buntdannelse eller veiledet aksonær orientering alene kan oppnås ved andreprotokoller 12,13,14. I et typisk eksperiment migrerer få celler ut fra sfæroider til mikrokanal, og de fleste celler forblir nærliggende sfæroider. Denne metoden gjør at aksoner spontant skilles ut fra sfæroidene uten å bruke størrelsesavhengige fysiske barrierer (f.eks. mikrogropor eller mikroporefiltre) for å skille aksoner fra cellelegemer.
Den resulterende MNO kan bli utsatt for ulike undersøkelser, inkludert morfologiske, biokjemiske og fysiske analyser. Cellekroppen og utvidet aksonbunt kan isoleres fysisk ved å kutte og kan analyseres separat for nedstrøms eksperimenter, for eksempel biokjemiske analyser. Biologiske materialer, inkludert RNA og protein, kan isoleres fra bare noen få axonbunter for vanlige biokjemiske analyser, inkludert RT-PCR og vestlig blotting. Her beskriver vi en protokoll for generering av motornerveorganoid fra iPS-celler, som tilbyr en attraktiv fysiologisk og patologisk modell for å studere mekanismen underliggende utvikling og sykdom av aksonfascicles.
Denne protokollen beskriver dannelsen av en motor nerve organoid (MNO) som har en axon bunt utvidet fra en motor neuron sfæroid generert fra menneskelige iPS-celler. Den dannede axonbunten er tykk, fleksibel og godt organisert i enveisstrukturer. Ved å dissekere aksonbunten kan aksonprotein med høy renhet oppnås tilstrekkelig til biokjemiske analyser. Neuronal aktivitet kan måles i akson bunter og sfæroider med kalsium imaging. Kontaminering av kjernefysiske og dendrittiske proteiner i aksonalt lysat ble ikke oppdaget ved vestlig blotting, noe som viser at vår metode effektivt separerte aksoner fra cellelegemer og dendritter.
En av fordelene med denne protokollen er den raske differensieringen og genereringen av MNO utstyrt med en axon-bunt, der alle prosesser kan gjøres i 4 uker med 3D-protokollen og 5-6 uker ved hjelp av 2D-protokollen. Dette er kort sammenlignet med andre protokoller som vanligvis tar 3-4 uker å bare differensiere til MN fra embryonale stamceller og iPS-celler17, og det tar ytterligere 2-4 uker å oppnå aksonal forlengelse. 3D-protokollen foretrekkes vanligvis over 2D-protokollen på grunn av kortere differensieringstid, færre trinn og redusert teknisk risiko uten dissosiasjonstrinnet sammenlignet med 2D-protokollen. Den mikrofluidiske-baserte vevskulturbrikken ble designet på en måte slik at aksonene til MNS kan forlenge mot det andre rommet gjennom mikrokanal, noe som letter dannelsen av en bunt av aksoner ved å indusere aksonære interaksjoner og affinitet mellom aksoner. På grunn av det enkle eksperimentelle oppsettet kan alle protokollene som er beskrevet her ikke bare utføres av bioingeniører, som er kjent med manipulering av en vevskulturbrikke, men også biologer og nevrologer som ikke er kjent med mikrofluidiker og mikrofabrikasjonsteknikker. Det bør bemerkes at trinn 1 og 2 også kan utføres ved hjelp av en ekstern fabrikasjonstjeneste.
Et av de kritiske trinnene for å oppnå protokollen er en sekvensiell endring av kulturmedium. Det anbefales å fullstendig endre kulturmediet på hvert trinn under differensieringen, slik at faktorer i det brukte mediet ikke forstyrrer MN-differensieringen. Et annet kritisk punkt i denne protokollen er å opprettholde udifferensierte iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten på den første iPS cellekulturen påvirker effektiviteten betydelig for å oppnå motornevroner og MNO. Et annet poeng er at diameteren på MNS skal være mindre enn størrelsen på hullet på brikken (1,5 mm). Større sfæroider kan ikke komme inn i kammeret, og potensielt oppleve alvorlig hypoksisk nekrose i midtdelen. Størrelsen på MNSs kan kontrolleres ved å endre et innledende såing antall iPS-celler (i 3D-protokoll) eller motornevroner (i 2D-protokoll). Såetettheten av celler bør optimaliseres for hver iPS-cellelinje.
Kompartaliserte mikrofluidiske enheter med mikrogropotter og små porefiltre har blitt mye brukt til å skille aksoner fra cellelegemer og dendritter. Denne teknikken kan også skille aksoner fra cellelegemer og dendritt, med overlegen overflod av aksoner i buntet vev. Sammenlignet med de andre metodene, er en stor begrensning av denne metoden at den ikke kan skille to forskjellige kulturmedier i den nåværende utformingen av vevskulturbrikken, noe som hindrer evnen til co-kultur av to forskjellige celler som krever to forskjellige medier. En annen begrensning er at PDMS-brikken satte forhåndsbestemt begrensning på størrelsen på vevet. En sfæroid større enn hullet kan ikke komme inn i kammeret, og axon bunten kan ikke vokse tykkere enn bredden på mikrofluidisk kanal.
Denne metoden kan brukes på andre typer nevroner. Vår gruppe har vist evne til å modellere en cerebral kanal ved hjelp av en modifisert metode kombinert med cerebral organoidteknikker 18. Kortikale sfæroider ble introdusert i begge rom og aksonene spontant langstrakte gjensidig mot hver sfæroid, og deretter en akson bunt dannet spontant. Som et resultat kan to kortikale sfæroider kobles til gjennom en aksonbunt, og vevet kan oppnås som ett stykke. Dette viser at tilnærmingen er svært allsidig for å danne axon bunt vev uavhengig av nevronale celletyper. I denne protokollen ble humane iPS-celler brukt, men andre stamceller, inkludert menneskelige ES-celler og humane nevrale stamceller, kan brukes med endringer i den presenterte protokollen. 3D-sfæroider av nevroner kan genereres av ulike protokoller19,20. Denne metoden for å lage vev med en axon bunt kan potensielt kombineres i fremtiden med de andre differensieringsprotokoller for å lage 3D MN sfæroid. I tillegg kan tykkelsen og lengden på axonbunten styres ved ganske enkelt å endre bredden og høyden på mikrokanaler av vevskulturbrikken for fremtidige utviklinger.
Vi tror at denne protokollen kan brukes til narkotikatesting og screening og kan bidra til forståelsen av mekanismer som ligger til grunn for utvikling og sykdommer i akson fascicles.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 og 18K19903, Core-2-core program, og Beyond AI institute.
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma | 440302 | |
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
200µl Wide Bore Pipet Tips | BMBio | BMT-200WRS | |
6-well plates | Violamo | 2-8588-01 | |
Accutase | ICT | AT104 | |
B-27 Supplement (50X) | Gibco | 17504044 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A6003 | |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Wako | 020-12913 | |
CO2 incubator | Panasonic | MCO-18AIC | |
Cryostor CS10 | Stem Cell Technologies | 07959 | |
DAPT | Sigma | D5942 | |
DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
Fluo-4 AM | Dojindo Laboratories | CS22 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | |
Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix) | Corning | 354230 | |
HB9 Antibody | Santa Cruz | sc-22542 | |
HBSS | Wako | 085-09355 | |
Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons) | Cellular Dynamics | R1051 | |
Isopropyl alcohol (IPA) | Wako | 166-04836 | |
Knock Out Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN193189 | Sigma | SML0559 | |
MEA probe | Alpha MED Scientific inc | MED-P5004A | |
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA) | Sigma | M7145 | |
Microscope Glass | Matsunami | S9111 | |
mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 05825 | |
N2 supplement | Wako | 141-08941 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Photoresist SU-8 2100 | Microchem | #SU-8 2100 | |
Prime surface 96U | Sumitomo Bakelite | MS-9096U | |
ReLeSR (passaging reagent) | Stem Cell Technologies | 05872 | |
Retinoic acid | Wako | 186-01114 | |
SAG | Sigma | SML1314 | |
SB431542 | Wako | 192-16541 | |
Silicon wafer | SUMCO | PW-100-100 | |
Silpot 184 w/c kit | Dow Toray | Silpot 184 w/c kit | |
Smi32 Antibody | Biolegend | 801701 | |
SU5402 | Sigma | SML0443 | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
Synapsin I Antibody | Millipore | Ab1543 | |
TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution) | Gibco | 12604-021 | |
Tuj1 Antibody | Biolegend | 801202 | |
Y-27632 | Wako | 030-24021 |