התכתוב תכנון כקריאה התנהגותית כמותית עבור חישת גירויים מזיקים
Summary
תכנון מים מתוקים מציגים שלוש חבטות (גלישה, פריסלזיס, ו כיווץ) הניתנים להבחנה על ידי ניתוח התנהגותי כמותי. אנו מתארים שיטה לגרום לכיסה באמצעות גירויים מזיקים שונים, כימות שלהם, והבחנה בין פריסלזיס וגלישה. באמצעות נוק-דאון גנטי, אנו מדגימים את הספנות של התכתשות כקריאה פנוטיפית כמותית.
Abstract
תכנון מים מתוקים בדרך כלל לדאות בצורה חלקה דרך הנעה ciliary בצד הפתח שלהם. תנאים סביבתיים מסוימים, עם זאת, יכול לגרום צורות מונעות על ידי התנועה: פריסלזיס או כיווץ. בעוד פריסלזיס נובע פגם ciliary, כיווץ אינו תלוי בתפקוד cilia והוא תגובה ספציפית לגירויים מסוימים, כולל קטיעה, טמפרטורה מזיקה, חומציות קיצונית, ואתנול. לפיכך, שני ההליכות המונעות על ידי בשרים הם שונים מבחינה מכנית. עם זאת, הם יכולים להיות קשים להבחין איכותית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לגירויים שונים באמצעות גירויים פיזיים וכימיים שונים. אנו מפרטים את האפיון הכמותי של התכתוש, אשר ניתן להשתמש בו כדי להבחין בו פריסלזיס וגלישה, באמצעות תוכנה זמינה בחופשיות. מאז כיווץ הוא הליכה פלנרית אוניברסלית, אם כי עם הבדלים ספציפיים למינים אופייניים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב על כל מיני התכנון, בעת שימוש בשיקולים המתאימים. כדי להדגים זאת, אנו משווים את התגובה של שני המינים הפלנריים הפופולריים ביותר המשמשים במחקר התנהגותי, Dugesia japonica ו Schmidtea mediterranea, לאותה קבוצה של גירויים פיזיקליים וכימיים. יתר על כן, הייחודיות של כיווץ מאפשר פרוטוקול זה לשמש בשילוב עם הפרעות RNA ו / או חשיפה תרופתית לנתח את המטרות המולקולריות ואת המעגלים העצביים המעורבים, פוטנציאל מתן תובנה מכנית להיבטים חשובים של nociception ותקשורת עצבית-שרירית.
Introduction
בנוסף לפופולריות שלהם עבור תאי גזעומחקר התחדשות 1,2,3,פלנריים מים מתוקים שימשו זמן רב במחקריםהתנהגותיים 4, 5,ניצול גודלם הגדול יחסית (כמהמילימטריםבאורך), קלות ועלות נמוכה של תחזוקת מעבדה, וספקטרום רחב שלהתנהגויותנצפות. המבוא של ראייה ממוחשבת ומעקב אוטומטי ללימודיהתנהגות פלנריים 6,7,8,9,10,11 אפשרו בידול כמותי של פנוטיפים התנהגותיים. התנהגות בעלי חיים היא קריאה ישירה של תפקוד עצבי. בגלל מערכת העצבים המישנית היא בגודל בינוני ומורכבות, אבל מניות שפרו אלמנטים מרכזיים עם המוחבעל החוליות 12,13,14,לימוד התנהגות פלנרית יכול לספק תובנה לתוך מנגנונים שוחזים של פעולה עצבית אשר עשוי להיות קשה לבדיקה ישירה אורגניזמים מורכבים יותר. לפיכך, תכנון הוא מודל בעל ערך עבור מחקרי נוירוביולוגיההשוואתית 8,12,15,16,17,18,19,20,21. בנוסף, הסביבה הימית מאפשרת חשיפה מהירה ונוחה לכימיקלים כדי ללמוד את השפעתם על תפקוד המוח בהתחדשות ופלנריים בוגרים, מה שהופך אותם למערכת פופולריתלנוירו-רעלים 22,,23,,24,,25,,26.
לפלנריים יש שלוש תלינים נפרדים, המכונים גלישה, פריסלזיס, ולכיווץ. כל הליכה מוצגת בנסיבות ספציפיות: גלישה היא ההליכה המוגדרת כברירת מחדל, פריסלזיס מתרחשת כאשרפונקציית הקליארית נפרץ 7,27, ו כיווץ הוא הליכה בריחה – ללא תלות בתפקוד cilia – בתגובה לגירויים מזיקים מסוימים7. הוכנו כי כיווץ היא תגובה ספציפית, הנוזרת על ידי התחושה של רמזים כימיים או פיזיים מסוימים, כולל טמפרטורות קיצוניות או pH, פגיעה מכנית, או גורם כימי ספציפי, ולכן אינו תגובתמתח כללית 7,28,29.
בשל ספציפיותו הפרמטרים הסטריאוטיפיים שלה, אשר ניתן לכמת בקלות באמצעות פרוטוקול זה, כיווץ הוא פנוטיפ התנהגותי רב עוצמה המאפשר לחוקרים לבצע מחקרים מכניים לנתח מסלולים חושיים ושליטה עצבית שלהתנהגות 25,28. בנוסף, כיווץ כבר הראה להיות נקודת קצה רגישה כדי לומר תופעות כימיות שליליות על התפתחות מערכת העצבים ותפקוד במחקרים neurotoxicology22,24,25,30. כמו מספר מסלולים חושיים שונים נראה להתכנס כדי לגרום כיווץבאמצעות מנגנונים שונים 28, כיווץ שונה מהתנהגויות פלנריות אחרות כי שונים, אבל ספציפיים, גירויים יכולים לשמש כדי לנתח מעגלים עצביים ברורים וללמוד כיצד אותות שונים משולבים כדי לייצר את פנוטיפ מכווץ.
חשוב לציין, קיימים הבדלי מינים, כאשר כימיקל אחד עלול לעורר כיווץ במין פלנרי אחד, אך תגובה התנהגותית שונה במין אחר. לדוגמה, מצאנו כי anandamide גורם מכווץ בזן התכנון Dugesia japonica אבל גורם פריסלזיס ב Schmidtea מדיטרנה28. דוגמה זו מדגישה את החשיבות של היכולת להבחין באופן אמין בין ההליכות השונות, משום שהן ביטויים פנוטיפיים של מנגנונים מולקולריים ברורים. עם זאת, קשה להבחין בין התכתשות מהפריסטלזיס באמצעות נתונים תצפיתיים איכותיים, משום ששני הגייטים מונעים על ידי שרירים וחותקיםקווי דמיון איכותיים 7,28. לפיכך, כדי להבחין בין ההליכות יש צורך לבצע הדמיה cilia או מחקר התנהגותי כמותי, המאפשר הבחנה בהתבסס על פרמטריםאופייניים 7,28. מכיוון שהדמיית cilia היא מאתגרת מבחינה ניסיונית ודורשת ציוד מיוחד כגון מיקרוסקופ מורכב הגדלה גבוההומצלמהבמהירות גבוהה 7,28, היא אינה נגישה באופן נרחב לחוקרים כמו ניתוח התנהגותי כמותי.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור (1) אינדוקציה של כיווץ באמצעות גירויים פיזיים (רעילים, קטיעה, אור UV קרוב) וכימי (allyl isothiocyanate (AITC), cinnamaldehyde) גירויים ו (2) ניתוח כמותי של התנהגות פלנרית באמצעות תוכנה זמינה בחופשיות. על ידי כימות ארבעה פרמטרים (תדירות תנודות אורך הגוף, מהירות יחסית, משרעת מקסימלית, ואמימטריה של הארכת הגוףוהתכווצות) 7, כיווץ ניתן להבדיל מגלישה, פריסלזיס, ו מצבים התנהגותיים אחרים שדווחו בספרות, כגון קטר כמו נחש15 או אפילפסיות15. יתר על כן, בעוד כיווץ הוא שוחמר בין מיניםפלנריים שונים 7, כל מין יש תדירות אופיינית משלו ומהירות; לכן, לאחר שנקבעו מהירויות הגלישה והכווץ של מין, ניתן להשתמש במהירות לבדה כאמצעי להבחין בין התכתוכות לביןגלישה ונזיד 29. הפרוטוקול אינו מניח הכשרה מוקדמת בניתוח תמונה חישובית או מחקרים התנהגותיים ולכן ניתן ליישם גם עבור ניסויים התנהגותיים תכנון בהקשר מעבדה הוראה ברמת התואר הראשון. נתונים לדוגמה כדי להקל על התאמת פרוטוקול מסופקים בחומר משלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ללמוד באופן כמותי את ההשפעות שלגירוייםפיזיים וכימיים 7,28,29 או מניפולציה גנטית (RNAi)28,29 על תנועה פלנרית. כדי למקסם את הרזולוציה המרחבית, עדיף להזיז את המצלמה קרוב ככל האפשר לזירה תוך ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למר טאפן גול על הערותיו על כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי NSF CAREER Grant 1555109.
Materials
| Allyl isothiocyanate, 95% (AITC) | Sigma-Aldrich | 377430-5G | CAUTION: Flammable and acutely toxic; handle in a fume hood with appropriate PPE. |
| Camera lens, 2/3 25mm F/1.4 | Tamron | 23FM25SP | |
| Cell culture plates, 6 well, tissue culture treated | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL polypropylene, sterile | MedSupply Partners | 62-1019-2 | |
| Cinnamaldehyde, >95% | Sigma-Aldrich | W228613-100G-K | |
| Dimmable A4 LED Tracer Light Box | Amazon | B07HD631RP | |
| Flea3 USB3 camera | FLIR | FL3-U3-13E4M | |
| Heat resistant gloves | Fisher Scientific | 11-394-298 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854200 | |
| Instant Ocean Sea Salt, prepared in deionized water | Instant Ocean | SS15-10 | Prepare in deionized water at 0.5 g/L. |
| Montjüic salts, prepared in Milli-Q water | Sigma-Aldrich | various | Prepare in milli-Q water at 1.6 mM NaCl, 1.0 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM KCl, 1.2 mM NaHCO3; adjust pH to 7.0 with HCl. |
| Petri dishes, 100 mm x 20 mm, sterile polystyrene | Simport | D210-7 | |
| Pipette, 20-200 μL range | Rainin | 17008652 | |
| PYREX 150 mL beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000150 | |
| Razor blade, 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Roscolux color filter: Golden Amber | Rosco | R21 | Alternatively purchase the Roscolux Designer Color Selector (Musson Theatrical product #SBLUX0306) which includes all 3 color filters together. |
| Roscolux color filter: Medium Red | Rosco | R27 | |
| Roscolux color filter: Storaro Red | Rosco | R2001 | |
| Samco transfer pipette, 62 µL large aperture | Thermo Fisher | 691TS | |
| Support stand | Fisher Scientific | 12-947-976 | |
| Thermometer | VWR | 89095-600 | |
| UV laser pointer | Amazon | B082DGS86R | This is a Class II laser (405nm ±10nm) with output power <5 mW. |
References
- Rink, J. C. Stem cell systems and regeneration in planaria. Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).
- Reddien, P. W., Alvarado, A. S. Fundamentals of Planarian Regeneration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).
- Cebrià, F. Regenerating the central nervous system: how easy for planarians. Development Genes and Evolution. 217, 733-748 (2007).
- Pearl, R. Memoirs: The Movements and Reactions of Fresh-Water Planarians: A Study in Animal Behaviour. Journal of Cell Science. , 2-46 (1903).
- Mc Connell, J. . A Manual of Psychological Experimentation on Planarians. , (1967).
- Talbot, J., Schötz, E. M. Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes. Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).
- Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. Scrunching: a novel escape gait in planarians. Physical Biology. 12, 055001 (2015).
- Inoue, T., et al. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).
- Arenas, O. M., et al. Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception. Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms. PLoS One. 5, 1-20 (2010).
- Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. Nervous system development and regeneration in freshwater planarians. Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266 (2017).
- Cebrià, F., et al. The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system. Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).
- Ross, K. G., et al. SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians. Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).
- Nishimura, K., et al. Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates. Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).
- Birkholz, T. R., Beane, W. S. The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light. Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).
- Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain. Elife. 5, (2016).
- Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion. Biology Open. , 1-8 (2014).
- Currie, K. W., Pearson, B. J. Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians. Development. 140, 3577-3588 (2013).
- Hagstrom, D., et al. Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity. Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology. Regeneration. 3, 65-77 (2016).
- Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Hayes, P., Graham, A., Collins, E. M. S. Multi-behavioral endpoint testing of an 87-chemical compound library in freshwater planarians. Toxicological Sciences. , 26-44 (2019).
- Zhang, S., Hagstrom, D., Siper, N., Behl, M., Collins, E. M. S. Screening for neurotoxic potential of 15 flame retardants using freshwater planarians. Neurotoxicology and Teratology. 73, 54-66 (2019).
- Wu, J. P., Li, M. H. The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential. Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).
- Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. Analysis of ciliary assembly and function in planaria. Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).
- Sabry, Z., et al. Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response. PLoS One. , 753244 (2019).
- Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians. Physical Biology. 13, 1-12 (2016).
- Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library. Toxicological Sciences. , (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian. PLoS One. 10, 0142214 (2015).
- Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength. PLoS One. 9, 114708 (2014).
- Petrus, M., et al. A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition. Molecular Pain. 3, 40 (2007).
- Takano, T., et al. Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior. Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).
