Summary
Exosome ansøgning er et nyt værktøj til udvikling af lægemidler og regenerativ medicin. Vi etablerer en exosome isolation protokol med høj renhed til at isolere exosomer fra nye identificerede stamceller kaldet CB-SC for mekanistiske undersøgelser. Vi har også coculture CB-SC-afledte exosomer med menneskelige monocytter, hvilket fører til deres differentiering i fænocypisk forskellige makrofager.
Abstract
Stamcellepædagog (SCE) terapi er en ny klinisk tilgang til behandling af type 1 diabetes og andre autoimmune sygdomme. SCE terapi cirkulerer den isolerede patientens blod mononuclear celler (f.eks lymfocytter og monocytter) gennem en aferese maskine, co-kulturer patientens blod mononukleare celler med klæbende navlestrengsblod-afledte stamceller (CB-SC) i SCE-enheden, og derefter returnerer disse "uddannede" immunceller til patientens blod. Exosomer er nano-størrelse ekstracellulære vesikler mellem 30 \u2012150 nm eksisterende i alle biofluid og cellekultur medier. For yderligere at udforske molekylære mekanismer, der ligger til grund for SCE-behandling og bestemme handlinger exosomer frigivet fra CB-SC, undersøger vi, hvilke celler der er omfattende disse exosomer under behandlingen med CB-SC. Ved at co-culturing Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer med menneskelige perifere blod mononukleare celler (PBMC), fandt vi, at CB-SC-afledte exosomer overvejende blev taget op af menneskelige CD14-positive monocytter, hvilket fører til differentiering af monocytter i type 2 makrofager (M2), med spindel-lignende morfologi og udtryk for M2-associerede overflademolekyliske markører. Her præsenterer vi en protokol for isolering og karakterisering af CB-SC-afledte eksosomer og protokollen for co-kultur CB-SC-afledte exosomer med menneskelige monocytter og overvågning af M2 differentiering.
Introduction
Navlestrengsblod stamceller (CB-SC) er unikke type stamceller identificeret fra humant navlestrengsblod og adskiller sig fra andre kendte typer stamceller såsom mesenkymale stamceller (MSC) og hæmatopoietiske stamceller (HSC)1. Baseret på deres unikke egenskaber af immun modulering og deres evne til stramt at holde sig til overfladen af petriskåle, vi udviklet en ny teknologi udpeget som Stem Cell Educator (SCE) terapi ikliniske forsøg 2,3. Under SCE terapi, en patients perifere blod mononukleare celler (PBMC) indsamles og cirkuleres gennem en celle separator og co-kulturperler med klæbende CB-SC in vitro. Disse "uddannede" celler (CB-SC-behandlet PBMC) returneres derefter til patientens cirkulation i et lukket kredsløb. Kliniske forsøg har allerede vist den kliniske sikkerhed og virkning af SCE-behandling til behandling af autoimmune sygdomme, herunder type 1-diabetes (T1D)2,4 ogalopeci areata (AA)5.
Exosomer er en familie af nanopartikler med diametre på 30\u2012150 nm og findes i alle biofluid og cellekultur medier6. Exosomer er beriget med mange bioaktive molekyler, herunder lipider, mRNAs, proteiner og microRNA 'er (miRNA), og spiller en vigtig rolle i celle-til-celle kommunikation. For sent, exosomer er blevet mere attraktivt for forskere og farmaceutiske virksomheder på grund af deres terapeutiske potentialer i klinikker7,8,9. For nylig, vores mekanistiske undersøgelser viste, at CB-SC-frigivet exosomer bidrage til immunmodulering af SCE terapi10.
Her beskriver vi protokollen for at udforske mekanismen i SCE terapi rettet mod monocytter af CB-SC-frigivet exosomer. For det første blev EXosomer, der blev frigivet af CB-SC, isoleret fra CB-SC-afledte betingede medier ved hjælp af ultracentrifugeringsmetoder og valideret ved flowcytometri, western blot (WB) og dynamisk lyssprændering (DLS). For det andet, CB-SC-afledte exosomer blev mærket med en grøn fluorescerende lipofile farvestof: Dio. For det tredje var de co-kulturperler med PBMC at undersøge de positive procenter af Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer på de forskellige delpopulationer af PBMC ved flow cytometri. Denne protokol giver vejledning til at undersøge handlingen af exosomer underliggende immunmodulering af stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne for institutionelle menneskelige forskning etiske udvalg på Center for Discovery og Innovation, Hackensack Meridian Health. Human buffy pels blod enheder blev købt fra New York Blood Center (New York, NY). Human navlestrengsblod enheder blev indsamlet fra raske donorer og købt fra Cryo-Cell International blodbank (Oldsmar, FL). Både New York Blood Center og Cryo-Cell har modtaget alle akkrediteringer for blodtapninger og distributioner, med IRB godkendelse og underskrevet Samtykke Formularer fra donorer.
1. Cellekultur og udarbejdelse af CB-SC-afledte betingede medium
- 25 ml navlestrengsblod (Materialetabel) overføres over 20 ml gradientmedium (γ = 1,077) til et konisk rør på 50 ml.
- Centrifuge ved 1.690 x g i 20 min ved 20 °C i en svingende spand rotor uden bremse.
- Overfør forsigtigt det mononukleare cellelag (buffy coat) til et nyt 50 ml konisk rør. Fyld det koniske rør med fosfatbufferet saltvand (PBS) til 40 ml. Der blandes og centrifugeres til pelletceller ved 751 x g i 10 minutter ved 20 °C.
- Supernatanten kasseres, og der tilsættes 15 ml ACK lysisbuffer (Materialetabel) til cellepellet. Re-suspendere celler gennem pipettering. Derefter inkuberes i 10 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Dette trin fjerner de røde blodlegemer. - Fyld det koniske rør med 25 ml PBS. Centrifuge ved 751 x g i 5 min. og kassér supernatant for at opnå pelleterede mononukleare celler.
- Vask 2x med 40 ml PBS for at fjerne den resterende lysisbuffer.
- Centrifuge ved 751 x g i 5 min. for at pellete cellerne.
- Supernatanten kasseres, og de mononucleare navlestrengsblods mononuare celler skal kasseres igen med 10 ml kemisk defineret serumfrit medium (materialetabel) pr. rør.
- Kombiner navlestrengsblod mononuclear celler til et rør.
- Der skal anvendes 20 μL celleaffjedring, og der blandes med 20 μL 0,4 % topanblå opløsning (materialetabel) i et 1,5 ml rør.
- Læg ind i kammerslideet, og kvantificer cellenummeret og celleetygtet med en automatiseret celletæller.
BEMÆRK: Cellesuspension fortyndes ved 1:10, hvis cellekoncentrationen er over 1 x 107 celler/ml. - Frømonukleare celler i 150 mm x 15 mm petriskåle ved 1 x 106 celler/ml, 25 ml/skål i kemisk defineret serumfrit cellekulturmedium.
- Inkuber ved 37 °C under 8% CO2 betingelser i 10\u201214 dage, indtil CB-SC nå mere end 80% sammenløb.
- Supernatanten kasseres, og der vaskes med 15 ml PBS pr. petriskål. derefter fjerne PBS.
BEMÆRK: CB-SC er fastgjort til petriskåle stramt. - Gentag trin 1.14 to gange.
- Der tilsættes 25 ml kemisk defineret serumfrit medium pr. petriskål.
- Inkuberes ved 37 °C under 8% CO2 betingelser i 3\u20124 dage.
- Det CB-SC-afledte konditionerede medium opsamls i 50 ml koniske rør.
2. Karakterisering af CB-SC
- Afgiv CB-SC ved at pipettere 10 ml PBS-baseret celle dissociationsbuffer op og ned med en 5 ml pipettespids (materialetabel).
- Centrifuge ved 1.690 x g i 5 min til pelletceller og re-suspension i 200 μL PBS.
- Fix og permeabilize celler til intracellulær farvning via farvning forberedelse kit (Tabel over materialer).
- Der tilsættes 5 μL Fc-blokker (materialetabel) pr. prøve og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Fc-blokkeren hæmmer ikke-specifik binding ved farvning med antistoffer. - Der tilsættes fluorescenskonjugeret anti-humane monoklonale antistoffer, herunder CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 og Galectin 9 ved 25 μg/ml (materialetabel) til 100 μL volumen af celler. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur med lysbeskyttelse.
- Efter farvning vaskes celler med 1 ml PBS og centrifugeres ved 751 x g i 10 min. til pelletceller.
- Re-suspendere celler med 200 μL PBS og overføres til en 5 ml rør.
- Udfør flowcytometri for at validere ekspressionen af CB-SC-tilknyttede ovenfor specifikke markører.
3. Isolering af exosomer fra CB-SC
- Centrifuge det konditionerede medium indsamlet fra trin 1.18 ved 300 x g i 10 min ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nyt 50 ml konisk rør.
- Centrifuge supernatant indsamlet fra trin 3.1 ved 2.000 x g i 20 min ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nyt 50 ml konisk rør.
- Centrifuge supernatant indsamlet fra trin 3.2 ved 10.000 x g i 30 min ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nyt 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: Den faste vinkelrotor anvendes således, at cellepillerne udfældes til siden af røret. Marker siden af hætten og træk en cirkel på siden af røret, hvor pellet forventes. - Filter supernatanter indsamlet fra trin 3.3 med et 0,22 μm filter (Tabel over Materialer).
- Overfør 15 ml medie til hver 10 kDa centrifugalfilterenhed (Materialetabel).
- Centrifuge ved 4.000 x g i 30 minutter for at isolere de koncentrerede exosom medier.
- Overfør de koncentrerede exosomer til et ultracentrifugerør. Derefter pellet exosomer ved 100.000 x g i 80 min ved 4 °C.
- Kassér supernatanten og genspjærk pellet exosomer i 10 ml PBS.
- Centrifuge ved 100.000 x g i 80 min ved 4 °C for at indsamle exosompellet.
- Genspærrer exosomerpellet i 200 μL PBS ved at pipettere op og ned.
4. Karakterisering af CB-SC-afledte exosomer
- Kvantificering af den samlede proteinkoncentration af exosomt præparat ved bicinonitsyreanalyse (BCA) kit
- Pipette 10 μL af hver albumin standard og isolerede exosom prøve udarbejdet i trin 3.10 i en 96-brønd plade i to eksemplarer.
- Der tilsættes 200 μL arbejdsreage fra BCA-sættet til hver brønd. Indholdet af pladen blandes grundigt på pladeshakeren i 10 s.
BEMÆRK: Arbejdsgenoper (WR): 50-del reagens A med 1-del reagens B. - Pladerne dækkes med folie og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
- Pladerne afkøles til stuetemperatur (RT).
- Prøveabsorbering måles ved 562 nm via en pladelæser.
- Forberedelse og farvning af exosomer til flowcytometri
- Exosomer ved tilsætning af 20 μL anti-humane CD63-magnetiske perler (4,5 μm størrelse) (materialetabel) til 25 μg CB-SC-afledte exosomer fremstillet i trin 3.10 i alt 100 μL volumen PBS.
- Rørret over en nat (18\u201222 h) kl.
- Centrifuge røret ved 300 x g i 30 s for at indsamle prøven i bunden af røret.
- Der tilsættes 300 μL isolationsbuffer (0,1 % kvægserumalbumin (BSA) i PBS, og blandes forsigtigt ved pipettering.
BEMÆRK: Dette trin vasker perle-bundet exosomer. - Anlå røret på en magnetholder i 1 min (Materialetabel), og kassér supernatanten.
- Gentag trin 4.2.4\u20124.2.5.
- Genslæven de perlebundne exosomer med 400 μL isolationsbuffer.
- Aliquot 100 μL perle-bundet exosomer til hvert rør.
- Der tilsættes fluorescenskonjugerede antistoffer (CD9-FITC, CD81-PE og CD63-FITC ved henholdsvis 25 μg/ml) til hvert flowrør med CD63 perle-fangede exosomer.
BEMÆRK: Isotype-matchede IgGs fungerer som negative kontroller. - Inkuber i 45 minutter ved stuetemperatur med lysbeskyttelse på shakeren ved 800 omdrejninger i minuttet.
- Gentag trin 4.2.4\u20124.2.5.
- Genslæven med de perlebundne exosomer i 200 μL isolationsbuffer og overføres til 5 ml flowrør.
- Rørene anbringes i prøvekarrusellen på flowcytometeret.
- Åbn protokollen for exosome test.
- Prøven køres automatisk ved hjælp af flowcytometer.
- Exosome afsløring af vestlige blot
BEMÆRK: Western blot er en veletableret metode, og vi vil ikke gå i detaljer med selve metoden.- Lyse pellets af CB-SC-afledte exosomer fra trin 3.10 med 100 μL RIPA buffer, pipette 20x, derefter placere på is i 5 min.
- Kvantificer proteinkoncentrationen af exosom lysat ved hjælp af BCA-kit og belastning 25 μg protein pr. brønd.
- Adskaf proteinerne med gelelektrophorsis i 40 minutter ved 150 V.
- Proteinet overføres til polyvinylidenfluorid (PVDF) ved hjælp af semitør overførselsmetode11.
- Bloker membranen med 5% fedtfri mælk i 30 min.
- Inkuberes med 2 μg/ml anti-human Alix (Tabel over Materialer) og 1 μg/ml anti-humane Calnexin antistoffer ( Tabel overMaterialer).
- Detekter proteinet ved chemiluminescens med et digitalt billeddannelsessystem.
- Exosome validering ved dynamisk lys spredning (DLS)
- 10 μg CB-SC-afledte exosomprøver fortyndes i 1 ml PBS.
- Den 1 ml fortyndede prøve overføres til engangsmikro-cuvette (Materialetabel).
- Anlæt kuvette i DLS-instrumentet. Indstil brydningsindekset (RI) som 1,39 for alle prøvemonitoren.
- Der udtages prøver ved 25 °C, og der foretages tre målinger pr. fraktion for at opnå en gennemsnitlig størrelsesfordeling.
- Exosom validering ved transmission elektronmikroskopi (TEM)
- Coat formvar på 300 mesh kobber gitre12 (Tabel af Materialer).
- Styrk formvar med det ekstra lag fordampet kulstof på kobbergitre12.
BEMÆRK: En sådan belægningstilgang er fremragende til støtte for prøver. - Der indlader 10 μL exosole prøver på gitrene, og lufttørst.
- Negativt pletprøver med uranylacetat i 5 min.
- Vask tre gange med DI vand og lad det lufttørre.
- Overhold og foto prøverne under TEM. Indstil accelererespændingen til 200 kV og spotstørrelse til 2.
5. Mål Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer, der tages af forskellige delpopulationer af PBMC
-
Label CB-SC-afledte exosomer med grøn fluorescerende lipofile farvestof Dio
- 100 μg CB-SC-afledte exosomer (fremstillet i trin 3.10) overføres til et 15 ml centrifugerør.
- Fortyndet prøve med PBS til 5 ml.
- Tilsæt grøn fluorescerende lipofile farvestof Dio (Tabel over Materialer), indtil arbejdskoncentrationen når 5 μM.
- Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Prøven overføres til et ultracentrifugerør.
- Centrifuge ved 100.000 x g i 80 min til pellet Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer.
- Genslæven de mærkede exosomer i 200 μL PBS.
-
Forberedelse af human pbmc
- Overfør 25 ml humant buffycoat (materialetabel) over 20 ml tæthedsgradientmedium (γ = 1,077) til et 50 ml konisk rør.
- Gentag trin 1.2 til 1.11.
- 1 x 106 PBMC overføres til en ikke-vævsbehandlet hydrofobe 24-brøndplade (1 ml/brønd).
BEMÆRK: En ikke-vævsbehandlet plade blev brugt til at undgå klæbe af monocytter.
-
Co-kultur Dio-mærket exosomer med PBMC
- Overfør 40 μL Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer fremstillet i trin 5.1.7 til hver PBMC-holdige brønd i en 24-brøndplade ved hjælp af en 200 μL pipette. Tilføj den samme mængde PBS til at styre brønde.
- Bland ved pipettering 10x. Inkuber i 4 timer.
- Opsaml 200 μL exosombehandlet PBMC og mærkes med Hoechst 33342 i 10 min ved stuetemperatur.
- Centrifuge ved 300 x g i 10 min. ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellepellet skal hænges igen i 100 μL PBS.
- Monter celler på mikroskopdias.
- Overhold og foto samspillet mellem Dio-mærket CB-SC-afledte exosomer med Hoechst 33342-mærket PBMC ved hjælp af et mikroskop.
- De resterende celler overføres fra trin 5.3.3 til et 1,5 ml rør.
- Centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellepellet skal hænges igen i 200 μL PBS.
- Der tilsættes 5 μL Fc-blokker pr. prøve. Inkuber i 15 min ved stuetemperatur.
- Der tilsættes antistoffer (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 og CD56 ved 25 μg/ml) (materialetabel)til pletten PBMC.
BEMÆRK: Isotype-matchede IgGs fungerer som negative kontroller. - Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur med lysbeskyttelse.
- Der tilsættes 1 ml PBS og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pellete cellerne.
- Re-suspendere cellerne med 200 μL PBS. Der tilsættes 5 μL propidiumidodid.
- Brug flowcytometri til at evaluere niveauet af Dio-mærket exosome optagelse i forskellige subpopulation af PBMC.
6. Undersøge, hvordan CB-SC-afledte eksosomer er på monocytter
- Isolation menneskelige CD14-positive monocytter
- Overfør 3 x 107 humane PBMC i et 15 ml rør.
- Centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Sæt adskillelsessøjlen (Materialetabel) i magnetseparatoren (Materialetabel).
- Adskillelsessøjler vaskes tre gange med 2 ml koldløbsbuffer (materialetabel).
- Re-suspendere cellerne i 300 μL kold PBS. Der tilsættes 60 μL CD14-mikroperler. Bland godt og inkubere på is i 15 min.
- Tilsæt 6 ml kold PBS. Centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Ophæng de pelleterede celler igen i 500 μL koldløbsbuffer.
- Overfør cellerne til skillekolonnen (forberedt i trin 6.14), og lad dem passere igennem.
- Adskillelsessøjlen vaskes tre gange med 2 ml løbebuffer pr. vask. Løft kolonnen fra magnetseparatoren, og placer den i et 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Det 15 ml rør skal placeres på is på grund af tilslutning af CD14-positive monocytter til røret ved stuetemperatur. - Overfør 2 ml koldløbsbuffer til toppen af kolonnen, og de CD14-positive celler isoleres i 15 ml-røret.
- Centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C for at pellete cd14-positive celler.
- Re-suspendere cellerne med 2 ml koldt kemisk defineret serumfrit medium (Tabel over Materialer).
- 50 μL celler overføres til et 1,5 ml rør.
- Plet med 10 μL Krome Orange-konjugeret anti-human CD14 mAb (Materialetabel) i 20 min.
BEMÆRK: Isotype-matchede IgGs fungerer som negative kontroller. - Tilsæt 1 ml PBS til cellerne. Centrifuge ved 300 x g i 10 min til pelletceller.
- Re-suspendere celler i 200 μL AF PBS og overføre det til en 5 ml rør. Bestemme renheden af CD14-positive monocytter ved flowcytometri.
- Behandling af monocytter med CB-SC-afledte exosomer
- Frø 1 x 106 renset monocytter med kemisk defineret serum-fri kultur medium (Tabel over materialer) i væv kultur-behandlet 6-brønd plade (2 ml / godt).
- Inkuber i 2 timer ved 37 °C under 5% CO2.
- Kassér supernatanten med 1 ml pipette. Der tilsættes 2 ml 37 °C forvarmt kemisk defineret dyringsmedie (Materialetabel) forsigtigt.
BEMÆRK: Monocytter blev tilklæbet til pladen inden for 2 timer. Flydende celler blev identificeret som døde eller andre celleforureninger. - Der tilsættes 80 μg CB-SC-afledte exosomer isoleret fra trin 3.10 til monocytkulturer i en 6-brøndplade med et samlet volumen på 2 ml.
BEMÆRK: Den samme mængde PBS blev tilføjet til kontrol brønde. - Inkuberes ved 37 °C under 5% CO2 i 3\u20124 dage.
- Fotografer cellemorfologien ved hjælp af et omvendt mikroskop ved 200× forstørrelse (Materialetabel).
- Fjern celler ved at pipettere op og ned i 1 ml af en PBS-baseret celle dissociationsbuffer med 1 ml pipettespids.
- Høst de resterende tilknyttede celler via en celleskraber.
BEMÆRK: Da primære monocytter eller differentierede makrofager fastgør stramt, forbliver nogle celler bundet til bunden efter behandlingen med dissociationsbuffer. Derfor høstes disse celler med en celleskraber. - Indsamle celler på 1.690 x g i 5 min. Re-suspendere celler i 200 μL PBS.
- Der tilsættes 5 μL Fc-blokker (25 μg/ml) for at blokere ikke-specifik binding.
- Der tilsættes antistoffer (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 og CD209 ved 25 μg/ml, materialetabel)til celler. Inkuber i 30 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Isotype-matchede IgGs tjener som negativ kontrol - Tilsæt 1 ml PBS til celler og centrifuge ved 300 x g i 10 min. Supernatanten kasseres, og den skal suspenderes igen med 200 μL PBS.
- Der tilsættes 5 μL propidiumidodid pr. prøve (200 μL), og cellerne overføres til et nyt 5 ml flowrør.
- Udfør flowcytometrien, og vurder niveauerne for CD14-, CD80-, CD86-, CD163-, CD206- og CD209-udtryk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I første omgang blev CB-SC's fænotype og renhed undersøgt ved flowcytometri med CB-SC-tilknyttede markører såsom leukocytgenereret antigen CD45, ES-cellespecifikke transskriptionsfaktorer OCT3/4 og SOX2. CB-SC viser høje niveauer af CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og galectin 9-udtryk, men intet udtryk for CD34 (Figur 1A). Flowcytometrianalyse bekræftede eksosomspecifikke markører, herunder CD9, CD81 og CD63, var på CB-SC-afledte eksosomer (Figur 1B). Morfologi og størrelsesfordeling af exosomer var karakteriseret ved TEM og DLS (Figur 1C,D), med en størrelse på 79,38 ± 20,07 nm. Western blot viste endvidere udtrykket af den exosom-tilknyttede markør Alix, uden udtryk for den ER-tilknyttede markør Calnexin (Figur 1E).
PBMC blev behandlet med Dio-mærket CB-SC-Exo. Mikroskopiobservationen viste den direkte interaktion mellem Dio-mærket CB-SC-Exo med PBMC (Figur 2A). For bedre at kunne definere, hvilken cellepopulation der interagerede med de Dio-mærket CB-SC-Exo, blev forskellige cellerum gated med cellespecifikke markører som CD3 til T-celler, CD11c for myeloid dendritiske celler (DC), CD14 for monocytter, CD19 for B-celler og CD56 for NK-celler (Figur 2B). Efter inkubation i 4 timer viste flowcytometri, at forskellige blodcellerum, der vises ved forskellige median fluorescensintensitet (MFI) af Dio-positive exosomer (Figur 2C). Især monocytter udviste højere median fluorescensintensitet af Dio-positive CB-SC-Exo end andre immunceller (Figur 2C), hvilket understreger, at monocytter primært blev ramt af cb-SC-afledte eksosomer.
For at undersøge de direkte virkninger af CB-SC-afledte exosomer på monocytter, blev de rensede CD14+ monocytter co-dyrket med CB-SC-afledte exosomer i 3 dage. Den exosom-behandlede monocyt held differentieret i spindel-lignende morfologier (Figur 3A). Dernæst blev fænotyper af CB-SC-Exo behandlet eller ubehandlet monocytter testet, afslører udtryk for M2-associerede markører, herunder CD163, CD206, CD209 blev markant forøget blandt den exosom-behandlede gruppe (Figur 3B, rød histogram). Sammenlignet med de konventionelle M2-makrofager, der genereres af M-CSF + IL-4, udtrykte CB-SC-Exo-behandlede monocytter tilsvarende niveauer af M2-tilknyttede markører som CD163, CD206, CD209, uden væsentlige forskelle (Figur 3C). Dataene indikerer derfor, at monocytter differentierer sig i makrofager med M2 fænotype efter behandlingen med CB-SC-afledte exosomer.
Figur 1: Karakterisering af CB-SC-afledte exosomer. (A) Fænofri karakterisering af CB-SC, højt udtryk for CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 og Galectin-9, intet udtryk for CD34. b) Ekspressioner af exosom-tilknyttede markører (CD63, CD9, CD81) på CB-SC-afledte exosomer. Isotype-matchede IgGs fungerede som kontrol for flow cytometri (grå histogram). c) Transmission Electron Mikroskopi (TEM) billede af CB-SC-afledte exosomer. d)Størrelsesfordeling af CB-SC-afledte exosomer ved hjælp af Dynamitic Light Scattering (DLS). (E)Western blots viser, at CB-SC-afledte eksosomer viser den eksosomspecifikke markør Alix, men negativ for endoplasmatisk reticulum (ER)-associeret markør Calnexin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Interaktion mellem CB-SC-afledte exosomer med forskellige populationer af PBMC. a) Samspillet mellem Dio-mærket CB-SC-Exo (grøn) med PBMC (blå, nuklear farvning med Hoechst 33342) blev fotograferet med Nikon Eclipse Ti2 mikroskop med NIS-Elements software version 5.11.02, med en høj forstørrelse viser fordelingen af Dio-mærket exosomer (grøn) i PBMC celler efter co-inkubation for 4 h 5% CO2 i ikke-væv kultur-behandlede 24-godt plade. n = 2. b) Gatingstrategi for analyse af flowcytometri med cellespecifikke overflademarkører for forskellige delpopulationer i PBMC herunder CD3 for T-celler, CD14 for monocytter, CD19 for B-celler, CD56 til NK-celler og CD11c for DCs.(C)Vis forskellige median fluorescensintensitet (MFI) af Dio-mærket exosom blandt forskellige PBMC-delpopulationer (f.eks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkninger af CB-SC-afledte eksosomer på monocytter. a)Morfologisk ændring af monocytter til spindellignende celler efter behandling med CB-SC-afledte exosomer. b)Up-reguleret niveauet af M2-associerede markører udtryk efter behandling med CB-SC-afledte exosomer, såsom CD163, CD206, og CD209 (rød linje). Ubehandlede monocytter (grøn linje) fungerede som kontrol. Isotype-matchede IgGs fungerede som negative kontrolelementer (grå linje). c) Fænoget sammenligning mellem konventionelle M2-makrofager og makrofagerne CB-SC-Exo-induceret M2. For at generere de konventionelle M2-makrofager blev de rensede CD14+ monocytter behandlet med en 50 ng/mL makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) ved 37 °C, 5% CO2-betingelser i 7 dage og efterfulgt af natten over behandlingen med 10 ng/ml IL-4. M2-tilknyttede markører, herunder CD14. CD80, CD86, CD163, CD206 og CD209 blev evalueret ved flowcytometri. Isotype-matchede immunglobulin G (IgG) tjener som kontrol. Dataene præsenteres som middelværdi ± SD; N = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelse af exosomer er et nyt område for klinisk diagnose, lægemiddeludvikling og regenerativ medicin. Her præsenterer vi en detaljeret protokol om fremstilling af CB-SC-afledte eksosomer og den funktionelle undersøgelse af exosomer om differentiering af menneskelige monocytter. Den nuværende protokol viste, at funktionelle CB-SC-afledte eksosomer er isoleret ved sekventiel centrifugering og ultracentrifugering med høj renhed og udviser immunmodulering på monocytter.
Sammenlignet med andre konventionelle protokoller er ultrafiltrering en etableret metode til isolering og rensning af exosomer fra forskellige celler eller medier baseret på molekylvægt og udelukkelsesstørrelser, der er forskellige fra andre ekstracellulære vesikler (ELBILER). Mens ultrafiltrering isolation er mere tidsbesparende end den ultracentrifugering-baserede adskillelse, det kan forårsage strukturelle skader på vesikler i store størrelser. Exosomer kan også indsamles af polyethylenglycol (PEG)-medieret nedbør til lave omkostninger, selv om denne metode risikerer exosome renhed på grund afproteinforureninger 13,14. Derfor var den nuværende protokol omkostningseffektiv til at producere exosomer med høj renhed. Baseret på immunmodulationer af CB-SC-afledte exosomer10, karakterisering af CB-SC-afledte exosomer kan tilbyde en værdifuld biomarkør til at vurdere styrken af Stamcellepædagog med CB-SC før kliniske anvendelser.
Makrofager er professionelle antigen-præsenterende celler mod virale og bakterielle infektioner, med forskellige biologiske funktioner og heterogeniteter. Baseret på deres forskelle i overflademarkører og immunfunktion, makrofager er kategoriseret med to sub-populationer: type 1 makrofager (M1, konventionelle makrofager forårsager inflammation) og type 2 makrofager (M2, viser anti-inflammation)15. Denne undersøgelse viste, at rensede humane monocytter blev opdelt i type 2 makrofager efter behandlingen med CB-SC-afledte exosomer, viser en anti-inflammation fænotype10. CB-SC-afledte exosom-behandlede monocytter udstillede den aflange morfologi og udtrykte M2-tilknyttede overflademarkører (f.eks. Sådanne fæotypiske ændringer af monocytter fremhæve den nye mekanisme, der ligger til grund for immunmodulering af CB-SC til behandling af type 1 diabetes og andre autoimmune sygdomme. Under SCE-behandlingen blev patienternes immunceller co-dyrket med CB-SC i ca. 8\u20129 h. De SCE-behandlede monocytter bragte CB-SC-afledte exosomer tilbage i kroppen, hvilket bidrog til M2-differentieringen og udvidelsen af induktionen af immuntolerance, hvilket førte til forbedring af kliniske resultater efter behandling med SCE-behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Zhao er grundlægger af Tianhe Stem Cell Bioteknologi Inc. Dr. Zhao er en opfinder af Stamcelle educator teknologi. Alle andre forfattere har ingen økonomiske interesser, der kan være relevante for det indsendte værk.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Mr. Poddar og Mr. Ludwig for generøs finansiering støtte via Hackensack UMC Foundation. Vi sætter pris på Laura Zhao for engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
References
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , Springer Science & Business Media. (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
