Summary
Dette papir præsenterer metoder til dyrkning hjerte myocytter med forskellige former, som repræsenterer forskellige patologier, og sortering af disse klæbende hjerte myocytter baseret på deres morfologi på et enkelt celleniveau. Den foreslåede platform giver en ny tilgang til høj gennemløb og narkotika screening for forskellige typer af hjertesvigt.
Abstract
Forskellige typer af hjertehypertrofi har været forbundet med en øget mængde hjerte myocytter (CMs), sammen med ændringer i CM morfologi. Mens virkningerne af cellevolumen på genekspression er velkendte, er virkningerne af celleform ikke godt forstået. Dette papir beskriver en metode, der er designet til systematisk at analysere virkningerne af CM morfologi på genekspression. Den beskriver udviklingen af en ny encellet fældefangststrategi, som derefter efterfølges af encellet mRNA-sekvensering. En micropatterned chip er også designet, som indeholder 3000 rektangulære-formede fibronectin mikromønstre. Dette gør det muligt at dyrke CMs i tydelig længde: bredde højdestørrelsesforhold (AR), svarende til forskellige typer af hjertesvigt (HF). Papiret beskriver også en protokol, der er designet til at samle enkelte celler op fra deres mønster ved hjælp af en halvautomatisk mikrorørcellevælger og individuelt injicere dem i en separat lysisbuffer. Dette har gjort det muligt at profilere transskriptomer af enkelte CMs med definerede geometriske morfotyper og karakterisere dem i henhold til en række normale eller patologiske forhold: hypertrofisk kardiomyopati (HCM) eller efterbelastning / koncentrisk versus udvidet kardiomyopati (DCM) eller preload / excentrisk. Sammenfattende præsenterer dette papir metoder til dyrkning af CMs med forskellige former, som repræsenterer forskellige patologier, og sortering af disse klæbende CMs baseret på deres morfologi på et enkelt celleniveau. Den foreslåede platform giver en ny tilgang til høj gennemløb og narkotika screening for forskellige typer af HF.
Introduction
Ifølge Verdenssundhedsorganisationen, hjerte-kar-sygdom (CVD) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. CVD påvirker dramatisk kvaliteten af folks liv og har en enorm socioøkonomisk indvirkning. Kardiomyopatier, såsom HCM og DCM, er primære lidelser i hjertemusklen og større årsager til HF har været forbundet med høj sygelighed og dødelighed. Der er mange årsager til HF, herunder miljømæssige virkninger, såsom infektioner og udsættelse for toksiner eller visse lægemidler8. HF kan også være forårsaget af genetisk disposition, nemlig mutationer9. Det menes, at de ændringer i den genetiske sammensætning, der påvirker ekstracellulære matrix (ECM) molekyler, integriner eller cytoskeletale proteiner kan være ansvarlig for nedsat mekanosensation og forskellige typer af hjertesygdom10.
Det vigtigste træk ved HCM er uforklarlig hypertrofi af venstre hjertekammer11, og nogle gange af højre hjertekammer12, og dette ofte præsenterer med fremherskende inddragelse af interventrikulær septum. HCM er også karakteriseret ved diastolisk dysfunktion og myocyte uorden og fibrose13. I de fleste tilfælde påvirkes hjertets kontraktile apparat af mutationer i sarkomeriske proteiner, hvilket fører til øget kontraktilitet af myocytterne14. I modsætning hertil er DCM karakteriseret ved dilatation af en, eller begge, hjertekamrene og har en familiær ætiologi i 30% til 50% aftilfældene 15. DCM påvirker en bred vifte af cellulære funktioner, hvilket fører til nedsat sammentrækning af myocytter, celledød og fibrotisk reparation16.
Genetik har vist, at visse typer af mutationer tvinge enkelt CMs til at vedtage specifikke form egenskaber under HCM3, nemlig firkantede celler med en længde:bredde AR, der er næsten lig med 1:14 (AR1). Det samme gælder for DCM, med aflange celler med en AR, der er næsten lig med 11:1 (AR11). Desuden kan HF være forårsaget af øget efterbelastning (f.eks. i hypertension). I disse tilfælde, hæmodynamiske krav tvinge CMs at tage på firkantede former, i henhold til Laplace lov, og AR ændringer fra 7:15 (AR7) til 1:16,7. HF kan også skyldes en stigning i forbelastning (f.eks. under forhold, der fører til overbelastning af volumen). Når dette sker, tvinger de biofysiske begrænsninger CMs til at forlænge, og AR ændres fra 7:1 til 11:1.
Signalaktivitet ved membraner afhænger af globale cellegeometriparametre, såsom cellulære AR, størrelse, membranoverfladearealet og membrankrummene18. Når neonatal rotte CMs blev belagt på substrater, der var mønstret for at begrænse cellerne i en bestemt længde: bredde AR, de viste den bedste kontraktile funktion, når forholdet svarede til cellerne i en sund voksen hjerte. I modsætning hertil klarede de sig dårligt, når forholdet svarede til myocytes i svigtende hjerter19. I de tidlige stadier af hypertrofi, celler bliver bredere, som afspejles af en stigning i tværsnitsområdet. HF opstår i de senere stadier af hypertrofi og celler synes typisk aflange. Derfor er det ikke overraskende, at in vivo rotte modeller af kronisk hypertrofi har rapporteret en stigning i venstre ventrikel myocyte længde på omkring 30%20,men voksne CMs fra transgene mus model, der blev akut behandlet med hypertrofiske stimuli in vitro vist lignende stigninger i cellebredde i stedet21.
Single-celle RNA sekventering, som giver mulighed for præcis analyse af transskription af enkelte celler, er i øjeblikket revolutionerer forståelsen af cellebiologi. Denne teknologi var den foretrukne metode, når det kom til at besvare spørgsmålet om, hvordan de enkelte celleformer påvirkede genekspressionen. Vi sammenlignede enkelte celler med forskellige former, især med 1:1, 7:1 eller 11:1. Dette blev gjort ved at så neonatal rotte ventrikulære CMs på en specielt designet chip fyldt med fibronectin-belagt mikropattern2 med definerede ARs af 1:1, 7:1 eller 11:1. Mikrostofferne blev fremstillet ved hjælp af fotolitografiteknologi. Mikromuderne var belagt med fibronectin, omgivet af cytofobisk overflade. Derfor vil CMs vedhæfte, sprede og fange den definerede AR af mikropatterner ved udelukkende at vokse på fibronectin substrat, samtidig med at man undgår det cytofobiske område. Mikropjerne er ikke i et velformet format. I stedet er fibronectinniveauet nøjagtigt i samme højde af det omgivende cytofobiske område. Dette gav lignende betingelser til voksende celler i en petriskål, da der ikke er stress fra de omkringliggende vægge. Desuden er overfladearealet af mikropatterner med forskellige AR'er lige.
Der var to særligt vigtige aspekter af det eksperimentelle design, som førte til brug af encellet RNA-sekventering i stedet for bulk-RNA-sekvensering. For det første kan kun nogle få procenter af mikropættern være besat af en enkelt celle. For det andet, nogle gange en enkelt celle ikke fuldt besætte mikropattern overflade. Enkelte celler, der helt dækker en mikropattern overflade skal plukkes til encellet RNA-analyse. Fordi kun en undergruppe af de belagte celler på en chip opfyldt begge kriterier, var det ikke muligt blot at trypsinize hele chippen og indsamle alle celler til bulk RNA sekventering. Kvalificerede celler skulle plukkes individuelt ved hjælp af en halvautomatisk cellevælger.
Det er i øjeblikket fortsat uvist, om CM form, i sig selv, har en intra-funktionel indvirkning på myokardie syncytium. Hovedformålet med de metoder , der foreslås i dette dokument , var at udvikle en ny platform til at undersøge , om celleformen i sig selv havde en indvirkning på transskriptions17. Selv om in vitro-undersøgelser er forskellige fra in vivo-undersøgelser, var formålet med denne undersøgelse at undersøge virkningen af forskellige celleformer på genekspression, i betragtning af at det er ekstremt krævende at sammenligne celler med forskellige former in vivo. Disse eksperimenter var inspireret af Kuo et al.19, der brugte en lignende tilgang og rapporterede, at de observerede ændringer i fysiologiske parametre på grund af ændringer i celleform.
Protocol
Alle forsøg med dyr var i overensstemmelse med reglerne i den animalske etiske komité under Karolinska Institutet, Stockholm, Sverige.
1. Mikromønstret spånlayout
- Brug en specialdesignet chip (Tabel over Materialer) ( Figur1A): en 19,5 mm x 19,5 mm dækslæd med aktiverede mikropatterner, trykt ved fotolitografi på borosilikatglas.
BEMÆRK: Disse mikropatterner er omgivet af et cytofobisk område. Derfor kan en seedet celle kun vedhæfte og vokse på en af disse mikropatterner og fange AR af denne mikropattern. Chippen er opdelt i tre zoner, og hver zone består af mikroobjekter med en specifik AR. Chiplayoutet er vist i figur 1B. De definerede aR'ers geometri præsenteres i tabel 1. Forstørrede fluorescerende billeder af de forskellige former af fibronectinmikropatternerne vises i de nederste billeder i figur 1B.
2. Belægningsmikropatternede spåner
- Der tilberes 2x belægningsproteinopløsning for hver chip ved at tilsætte 80 μg fibronectin til 2 ml fosfatbufferet saltvand (PBS-/-).
- En spån overføres til en 35 mm Greiner Petri-skål, og der tilsættes straks 2 ml PBS-/-. Derefter tilsættes 2 ml af 2x belægning proteinopløsning.
- Spåner ved stuetemperatur i 2 timer inkuberes.
- Belægningsopløsningen vaskes ved successive fortyndingstrin med PBS-/-. Spånoverfladen skal altid være våd. Derefter udskiftes PBS med 2 ml plating medium og inkuberes ved 37 °C, indtil såning celler.
3. Isolering af KM'er
- Forbered plating medium ved at supplere DMEM:M199 (4:1) med 10% hest serum, 4% føtal kvæg serum, 2% HEPES (1 M) og 1% penicillin/streptomycin (10.000 U / ml)22.
- Disseker væv fra venstre hjertekammer af 2-dages gamle neonatal rotte hjerter og overføre til en 10 cm skål, der indeholder PBS. Skær vævet i ca. 1 mm3 stykker.
- Overfør det høstede væv i et rotordæksrør, der er udstyret med en rotor i hætten til vævsekspifikation (materialetabel). Lad vævet falde til ro og derefter forsigtigt fjerne supernatant.
- Tilsæt 2,5 ml af blandingen af enzym mix 1 og 2, fremstillet ved hjælp af Neonatal Heart Dissociation Kit (Tabel af Materialer), til C-røret og luk hætten stramt.
- Sæt rotordæksrøret på dissociatorens muffe, der er udstyret med varmeapparater (Figur 2A og B) (Materialetabel). Kør inkubationsprogrammet 37C_mr_NHDK_1 (Figur 2C), som varer ca. en time.
- Mens inkubationsprogrammet kører, forberedes PEB-bufferen med 2 mM EDTA og 0,5 % kvægserumalbumin (BSA) i PBS, pH 7.2, og den opbevares ved 4 °C.
- Efter inkubationsprogrammets afslutning skal rotordæksrøret (figur 2D) løsnes, og der tilsættes 7,5 ml forvarmt platingmedium.
- Prøven opsprænes, og cellesuspensionen filtreres med en si på 70 μm.
- Sien vaskes med yderligere 3 ml plating medium.
- Centrifuge celle suspension ved 600 x g i 5 min. Inspirer supernatanten helt.
- Opslæm cellepellet i 60 μL kold PEB-buffer.
- Tilsæt 20 μL neonatal Kardiomyocyte Isolation Cocktail (Tabel over Materialer),der indeholder mikron-størrelse perler, der er målrettet ikke-VM'er.
- Der tilsættes 20 μL anti-røde blodlegemerperler (materialetabel).
- Suspensionen blandes og inkuberes ved 4 °C i 15 min.
- Der tilsættes 400 μL PEB-buffer.
- Påfør cellesuspensionen på LD-kolonnen (Materialetabel),som er indsat lodret i en magnetholder og vasket godt med PEB-buffer.
- Indsaml ikke-mærkede celler og vask kolonne med 0,5 ml PEB buffer.
- Der tilsættes 8 ml platingmedium, og cellesuspensionen overføres til en 75 cm2 ubestrøget kuldefarve og inkuberes ved 37 °C i 1,5 timer. De resterende ikke-CMs vil begynde at overholde den ubestrøget celle kultur og celle suspension vil blive beriget af CM population.
4. Mønster-CMs
BEMÆRK: Vi sammenlignede enkelte CMs med ARs på 1:1, 7:1 eller 11:1. Dette gøres ved at så de isolerede neonatal rotte-CMs på en specialdesignet chip fyldt med fibronectinbelagte mikropatterner med definerede 1:1, 7:1 eller 11:1. Mikromuderne var belagt med fibronectin, omgivet af cytofobisk overflade. Derfor vil CMs vedhæfte, sprede og fange den definerede AR af mikropatterner ved udelukkende at vokse på fibronectin substrat. Mønster de isolerede CMs i henhold til følgende trin.
- Cellesuspension overføres til et 15 ml rør, cellerne tælles og fortyndes til en koncentration på 100.000 celler pr. ml ved at tilsætte passende platingmedium.
- Der tilsættes 2 ml cellesuspension på spånen, som allerede er nedsænket i 2 ml varmt platingmedi inde i en 35 mm Greiner Petri-skål.
- Inkuber skålen ved 37 °C med 5% CO2 for at lade CM'erne binde sig til de fibronectinbelagte mikropatterner og lade hver CM at erhverve AR af sin substrat mikropattern.
- Efter 18 timer skal du kontrollere chippen. Hvis de fleste af cellerne har fastgjort, afmontere og fjerne snavs og døde celler, der er knyttet til den mønstrede celle. Gør dette ved at fjerne plating medium og forsigtigt tilføje PBS-/- dropwise, startende fra midten af chippen og derefter bevæger sig mod siderne. Gentag 2 gange.
- Indsugning af PBS med frisk vedligeholdelsesmedium ved at supplere DMEM:M199 (4:1) med 4% hesteserum, 4% føtalt kvægserum, 2% HEPES (1 M) og 1% penicillin/streptomycin (10.000 U/ml).
5. Picking overholdelse AF VM'er
BEMÆRK: Efter en dyrkningsperiode på 72 timer plukkes mønstrede enkelte CMs fra deres fibronectinmikromønstre ved hjælp af en halvautomatisk cellevælger (Materialetabel) (Figur 3). Cellevælgeren bruger en software23 til at styre den motoriserede fase (Figur 3A). En mikrokapillær på 70 μm glas (figur 3B) bruges til at plukke og injicere de mønstrede neonatale rotter. Cellevælgeren sorterer klæbende celler ved at generere et vakuum og injicere cellerne ved at anvende tryk. Vakuum i sprøjte nummer 1 påføres ved at trække sprøjten ved hjælp af sprøjtepumpen(Figur 3C). Det hydrostatiske tryk er baseret på tyngdekraften og induceret ved at placere sprøjte nummer 2 i en afstand af 87 cm over mikroskopbordet. Sprøjte 1 og 2 er henholdsvis forbundet via PTFE-rør, til ventil 1 og 2, som er indlejret i styreenheden (Figur 3D). PTFE-rørene er helt fyldt med RNase-frit vand. Den plukkede enkeltcelle injiceres derefter i polymerasekædereaktionsrøret (PCR), der indeholder 3,55 μL lysisbuffer.
- Efter en dyrkningsperiode på 72 timer fjernes det gamle medium og spånoverfladen skylles forsigtigt med varm DPBS-/-.
- Hold skålen flad og aspirere det gamle medium forsigtigt med en 1000 μL pipette fra den ene side af skålen. Sørg for, at chippen altid forbliver våd.
- Tilføj 2 ml DPBS-/- forsigtigt og slip-klogt løsrive de fleste af de døde celler, der er knyttet til de mønstrede celler, startende fra midten af chippen og derefter flytter til dens sider.
- Aspirere det meste af DPBS at fjerne så mange fritliggende flydende celler som muligt, startende fra midten af chippen og derefter flytte til siderne.
- Gentag trin 5.1.2 og 5.1.3 igen.
- Brug vinklede kraftbecer til at gribe fat i kanten af chippen og straks overføre den til en ny steril 35 mm Greiner Petri fad for at reducere antallet af flydende celler, mens picking.
- Tilsæt straks 1,5 ml DPBS-/- så chippen ikke tørrer ud.
- Tilsæt 1,5 μL levende dye cycle grøn for at visualisere kernerne i de levende celler.
- Placer chippen i midten af Greiner Petri skålen ved hjælp af spidsen af spånerne.
- Sæt et kammer (Materialetabel)over chippen. Kammeret vil fastgøre chippen til bunden af skålen, uden at blokere adgangen til cellemønstrene.
- Monter Greiner Petri skålen på skålholderen på cellevælgerfasen, og indsæt den magnetiske hætte.
- Kalibrer den automatiske injektion.
- Find trådkorset, som er indgraveret på den motoriserede scene midt i billedet i Live View-vinduet.
- Fokuser på trådkorset, og vælg knappen Kalibrering til automatiseret injektion i vinduet Scanning og sortering.
- Udskift DPBS-/- med 1,5 ml DPBS/trypsin-/- (1:1), mens skålen er på scenen, for at løsne cellerne fra fibronectinen, så et flydende vakuum kan bruges til at plukke cellerne.
- Scan hele chippen ved hjælp af fanen Scanning i vinduet Scanning og sortering. Find det øverste venstre hjørne af chippen i synsfeltet og klik på Få aktuelle mikroskop position i øverste venstre hjørne række.
- Flyt derefter den motoriserede scene til nederste højre hjørne af chippen. Fokuser mikroskopet, og klik på Få aktuel mikroskopposition i nederste højre hjørnerække.
- Klik på set skarpeste plan knappen og på poppet op vinduet klik på Gå til øverste højre hjørne. Fokuser mikroskopet, og klik på Gå til nederste venstre hjørne og sæt fokus. Når du er færdig, skal du klikke på knappen Udfør og begynde at scanne.
- Når scanningen afsluttes, skal du gå til fanen Analyse og markere de enkelte celler, der består undersøgelseskriterierne.
- Sørg for, at glasmikrokapillaryen er midt i mikroskopets live view.
- Styr sprøjtepumpen ved hjælp af softwarens pumpevindue. Der opstår et vakuum ved at trække 4 ml ud af en 50 ml nummer 1-sprøjte, som har en diameter på 27 mm.
- Under fanen Sortering
- Indstil ventilventilens indsprøjtningsparametre. Det blev beregnet, at injektionsvolumen, der leverede en plukket enkelt celle var 1 μl, hvis ventil 2 blev åbnet i 120 millisekunder og derefter ventil 1 åbnet i 20 var millisekunder efter en tid bortfalder på 200 millisekunder. På grund af elasticiteten i rørene, åben ventil 1 for at stoppe injektion af strømmen.
- Indstil ventilernes op-og op-af-parametre. Det blev beregnet, at hvis ventil 1 blev åbnet i 20 millisekunder og derefter ventil 2 blev åbnet i 10 millisekunder, efter en tid bortfalder på 10 millisekunder, de fleste af de mønstrede celler kan afhentes. Dette skyldes, at deres fibronectin bindinger blev løsnet efter at være blevet behandlet af trypsin.
- Klik på knappen Beregn stien. Softwaren beregner den hurtigste vej fra celle til celle, at afhente og injicere de valgte celler i hele chippen.
- Fokuser mikroskopet på en mønstret celle på spånoverfladen.
- Brug joysticket til at flytte mikrokapillaryen forsigtigt ned, så det skarpeste billede af spidsen af mikrokapillæren kan opnås uden at røre cellen.
- Klik på knappen Angiv i sektionen Micropipette offset. Et nyt vindue vil dukke op, der viser mikrokapillær tværsnit. Klik på det nøjagtige centrum af kapillæren. Softwaren vil derefter optage spidsen offset af kapillær i x, y og z koordinater.
- Start sortering ved hjælp af knappen Start sortering.
Representative Results
Væv blev dissekeret fra venstre hjertekammer af den 2-dages gamle neonatal rotte hjerter og opdelt i enkelte celler. Så de berigede CMs blev seedet på en chip, der indeholder fibronectin mønstre med forskellige ARs. Efter 72 timers dyrkning blev mediet erstattet af 1:1000 Vibrant Dye Cycle green i DPBS-/- i 2 min for at visualisere de levende cellers kerner. Dernæst blev cellerne behandlet med DPBS-/-/trypsin (1:1) for at løsne cellerne fra fibronectinen, så et flydende vakuum kunne bruges til at lette celleplukning. I mellemtiden blev hele chippen scannet ved en forstørrelse på 10x ved hjælp af et omvendt mikroskop forbundet til cellevælgeren. Dette blev udført, før cellerne blev afrundet på grund af trypsin behandling. De kvalificerede celler blev valgt, baseret på det scannede billede, og deres koordinater blev gemt i cellevælgersoftwaren. Mikropatternerne blev kun udvalgt, hvis de indeholdt en mononukleeret enkelt celle, og kun når cellen fuldt dækkede sin fibronectin mikropattern. Cellesorteringen plukkede de markerede celler en efter en, og hver enkelt celle, der blev plukket, blev straks injiceret i et individuelt PCR-rør og placeret på mikroskopstadiet. Hvert PCR-rør indeholdt 3,55 μL lysisbuffer (tabel 2). Sorteringsprocessen, der startede med at fjerne mediet, blev afsluttet inden for 40 minutter. Den komplementære deoxyribonucleic-syre (cDNA) syntese, PCR-forforstærkning og rensning blev udført på de lysede enkeltceller baseret på Smart-Seq2-protokol24 (Tabel 3). Kvaliteten af den rensede cDNA blev kontrolleret af en automatiseret elektroforese analysator. Elektrofærogrammet for den forforstærkede cDNA for en plukket enkeltcelle præsenteres i figur 4. RNA-Seq-bibliotekerne blev udarbejdet i henhold til Smart-Seq2-protokollen24.
For at observere den sarkomiske struktur af de mønstrede CMs, de mønstrede CMs blev farves med sarkomeriske α-actinin antistof. Cellerne blev inkuberet med Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 1:800 i 1 time ved stuetemperatur for den sekundære farvning. Kerner blev plettet med 1 μg/ml DAPI. Immunfluorescerende billeder blev erhvervet med et omvendt konfokal mikroskop ved hjælp af et 63x olienedsænkningsmål (NA 1.4) (Figur 5).
Figur 1: Layout af chippen med fibronectin mikropatterner.
(A) Billede af den specialdesignede chip. Chippen er en 19,5 mm x 19,5 mm coverslip med fibronectin mikropatterns, trykt ved fotolitografi på et borosilikatglas. (B) Chip layout. Chippen er opdelt i tre zoner, og hver zone består af fibronectin mikropatterner med specifikke AR. Fluorescerende billeder af forskellige former af fibronectin mikropatterner er vist i forstørret visning for hver zone. Dette tal er blevet ændret fra "supplerende materiale 1" af Haftbaradaran Esfahani et al.2, der anvendes under http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Dissociator udstyret med varmeapparater.
A) Hele dissociatorinstrumentet, der anvendes til fuldautomatisk dissociation af 2 dage gamle neonatale rottesving. (B) Varmeenhed. (C) Rotor-cap rør. D) Klar-til-brug-programmer til en fuldt automatiseret arbejdsgang af vævseksociation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cellevælgerapparat.
(A) Forstørret visning af cellevælgerens motoriserede fase. En petriskålsholder og 80 huller til 10 PCR strips og et hul til kalibreringshår er indlejret på scenen. b) Forstørret visning af en mikrokaprisk glaskapillær. (C) Sprøjtepumpen. D) Styreenheden, som styrer åbnings- og lukketidsvinduet for ventil 1 og 2, der er monteret inde i styreenheden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Elektroferogrammet af den forforstærkede cDNA i en plukket enkelt celle.
19 PCR-cyklusser af forforstærkning blev anvendt til at opnå 15 μL 1 ng/μL renset cDNA-udbytte. Et klart bånd i gel-lignende densitometri plot er observeret, som svarer til toppen ved 1852 bp i elektrofærrammet. Den gennemsnitlige størrelse af fragmenter er 1588 bp. Desuden viser den lille mængde fragmenter, der er kortere end 300 bp, et godt cDNA-bibliotek. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Immunofluorescerende farvning af α-actinin sarcomeric struktur (grøn) og kerne (blå) af mønstrede CMs med forskellige ARs.
Kromatin blev plettet af DAPI. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Morphotype | Ar | Længde (μm) | Bredde (μm) | Fibronectinareal (μm2) |
| kr. | 1:1 | 47 | 47 | 2209 |
| kr. | 7:1 | 126 | 18 | 2268 |
| kr. | 11:1 | 155 | 14 | 2170 |
Tabel 1: Geometri af mønstrede CMs.
| Komponent | Volumen (μL) |
| Nucleas-frit vand | 0.65 |
| (0,4% vol/vol) Triton X-100 | 1.8 |
| dNTP mix (25 mM) | 0.8 |
| RNase-hæmmer (40 U μL-1) | 0.1 |
| Oligo-dT30VN oligonukleotider (100 μM) | 0.1 |
| ERCC RNA Spike-In Mix (2,5 x 105 fortynding) | 0.1 |
| Indsprøjtet enkelt celle | 1 |
| Samlet volumen | 4.55 |
Tabel 2: Brugerdefineret lysisbuffer for en enkelt celle.
| Komponent | Volumen (μL) |
| Hævet II første streng buffer (5x) | 2 |
| DTT (100 mM) | 0.5 |
| Betain (5 M) | 2 |
| Mgcl2 (1 M) | 0.1 |
| RNasehæmmer (40 U μL-1) | 0.25 |
| Hævet skrift II omvendt transskription (200 U μL-1) | 0.5 |
| TSO (100 μM) | 0.1 |
| Samlet volumen | 5.45 |
Tabel 3: Omvendt transskription (RT) mix for en RT reaktion til at syntetisere første streng cDNA fra lysatet af en enkelt CM.
Discussion
Denne undersøgelse brugte encellet RNA-sekvensering, som er en ny og kraftfuld teknologi, der kan detekskriptisere enkelte celler. Det blev kombineret med en innovativ tilgang til dyrkning enkelt CMs, således at de tog på forskellige ARs, at ellers kun kunne have været observeret in vivo.
Undersøgelsen havde nogle begrænsninger. For eksempel, neonatal CMs skulle bruges til at generere forskellige morfotyper, da det er usædvanligt udfordrende at kultur nok vitale voksne VM'er i 72 timer i definerede former. Desuden blev CMs dyrket i 72 timer ex vivo, hvilket kunne have haft en indvirkning på genekspressionsmønsteret. Men denne dyrkning var nødvendig, så cellerne kunne danne specifikke morfotyper. Desuden blev kun enkelte celler, der var mononukleerede og fuldt dækkede fibronectinmikropattern, udvalgt til sortering. Mønstrede celler på hver chip skal sorteres blot i en runde sortering. Endelig blev omkring 50 celler, der er omkring en tredjedel af de udvalgte celler, med succes samlet op fra hver chip. Der er to årsager til, at antallet af plukkede celler blev begrænset. For det første var nogle celler for tæt fastgjort til fibronectin mønster og pickup flow var ikke tvungen nok til at samle dem op. For det andet, på grund af trypsin behandling, den vedhæftede fil mellem nogle celler og fibronectin blev for løs. Derfor blev disse celler skubbet væk fra deres fibronectin mikropatterner, når mikrokapillær nærmede sig dem, og de blev ikke samlet op. Forfatterne hævder ikke, at dette setup er det samme som en in vivo miljø, men det viste sig at være en holdbar tilgang til at besvare forskning spørgsmål.
Den foreslåede metode gælder for forskellige celletyper (f.eks. for hiPS-CMs). Følgende faktorer bør dog optimeres til at undersøge andre celletyper. Der bør anvendes egnede ECM-klæbemolekyler til fastgørelse af den specifikke celletype til belægning af mikropatterne. Mikroorganernes geometri skal ændres i henhold til undersøgelsesspørgsmålet og celletypen. Dyrkningsperioden kan ændres på baggrund af undersøgelsesspørgsmålet. Løsrivelsesgenoperen og dets inkubationstid skal optimeres præcist til studiecelletypen. For eksempel kan Accutase anvendes i stedet for TryplE til løsrivelse af embryonale og neuronale stamceller. Ventilernes åbningstidsparametre bør undersøges for at plukke celler med succes, men forsigtigt. Sammenfattende har vi udviklet en ny platform til at studere celleform, der kan give en værdifuld ressource for forskere på området. I denne sammenhæng designede vi en eksperimentel tilgang, der efterlignede in vitro-karakteristiske former, der er pålagt CM in vivo af hæmodynamiske begrænsninger for at identificere samspillet mellem cellulær arkitektur og genekspression. Vi rapporterer også om udviklingen af en ny platform til at studere HF in vitro og identifikation af celleform som en stærk determinant for genekspression. Dette er en ny observation med vidtrækkende konsekvenser for biologi og medicin.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
| Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
| Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
| Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
| CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
| CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
| CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
| dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
| DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
| Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
| LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
| NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
| Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
| Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
| RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
| sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
| SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
| Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
| TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
| Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |
References
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (8), 589-600 (2006).
- Haftbaradaran Esfahani, P., et al. Cell shape determines gene expression: cardiomyocyte morphotypic transcriptomes. Basic Research in Cardiology. 115 (1), 7 (2019).
- Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Benian, G., Granzier, H. Advances in Muscle Physiology and Pathophysiology 2011. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 930836 (2012).
- Hill, J. A., Olson, E. N.
- Bray, M. A., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Sarcomere alignment is regulated by myocyte shape. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (8), 641-651 (2008).
- Benjamin, I. J., Schneider, M. D. Learning from failure: congestive heart failure in the postgenomic age. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 495-499 (2005).
- Opie, L. H., Commerford, P. J., Gersh, B. J., Pfeffer, M. A.
- Braunwald, E.
- Knoll, R., et al. The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy. Cell. 111 (7), 943-955 (2002).
- Frangogiannis, N. G. The Extracellular Matrix in Ischemic and Nonischemic Heart Failure. Circulation Research. 125 (1), 117-146 (2019).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic Cardiomyopathy: Genetics, Pathogenesis, Clinical Manifestations, Diagnosis, and Therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Mozaffarian, D., Caldwell, J. H. Right ventricular involvement in hypertrophic cardiomyopathy: a case report and literature review. Clinical Cardiology. 24 (1), 2-8 (2001).
- Olsson, M. C., Palmer, B. M., Stauffer, B. L., Leinwand, L. A., Moore, R. L. Morphological and functional alterations in ventricular myocytes from male transgenic mice with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Research. 94 (2), 201-207 (2004).
- Toepfer, C. N., et al. Hypertrophic cardiomyopathy mutations in MYBPC3 dysregulate myosin. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
- McKenna, W. J., Maron, B. J., Thiene, G. Classification, Epidemiology, and Global Burden of Cardiomyopathies. Circulation Research. 121 (7), 722-730 (2017).
- Schultheiss, H. P., et al.
- Knoll, R. A role for membrane shape and information processing in cardiac physiology. Pflugers Arch. 467 (1), 167-173 (2015).
- Rangamani, P., et al.
- Kuo, P. L., et al. Myocyte shape regulates lateral registry of sarcomeres and contractility. American Journal of Pathology. 181 (6), 2030-2037 (2012).
- Gerdes, A. M., Onodera, T., Wang, X., McCune, S. A. Myocyte remodeling during the progression to failure in rats with hypertension. Hypertension. 28 (4), 609-614 (1996).
- Kehat, I., et al. Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 regulate the balance between eccentric and concentric cardiac growth. Circulation Research. 108 (2), 176-183 (2011).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- Kornyei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Scientific Reports. 3, 1088 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. The interdependence of membrane shape and cellular signal processing. Cell. 156 (6), 1132-1138 (2014).
