Dette papir præsenterer metoder til dyrkning hjerte myocytter med forskellige former, som repræsenterer forskellige patologier, og sortering af disse klæbende hjerte myocytter baseret på deres morfologi på et enkelt celleniveau. Den foreslåede platform giver en ny tilgang til høj gennemløb og narkotika screening for forskellige typer af hjertesvigt.
Forskellige typer af hjertehypertrofi har været forbundet med en øget mængde hjerte myocytter (CMs), sammen med ændringer i CM morfologi. Mens virkningerne af cellevolumen på genekspression er velkendte, er virkningerne af celleform ikke godt forstået. Dette papir beskriver en metode, der er designet til systematisk at analysere virkningerne af CM morfologi på genekspression. Den beskriver udviklingen af en ny encellet fældefangststrategi, som derefter efterfølges af encellet mRNA-sekvensering. En micropatterned chip er også designet, som indeholder 3000 rektangulære-formede fibronectin mikromønstre. Dette gør det muligt at dyrke CMs i tydelig længde: bredde højdestørrelsesforhold (AR), svarende til forskellige typer af hjertesvigt (HF). Papiret beskriver også en protokol, der er designet til at samle enkelte celler op fra deres mønster ved hjælp af en halvautomatisk mikrorørcellevælger og individuelt injicere dem i en separat lysisbuffer. Dette har gjort det muligt at profilere transskriptomer af enkelte CMs med definerede geometriske morfotyper og karakterisere dem i henhold til en række normale eller patologiske forhold: hypertrofisk kardiomyopati (HCM) eller efterbelastning / koncentrisk versus udvidet kardiomyopati (DCM) eller preload / excentrisk. Sammenfattende præsenterer dette papir metoder til dyrkning af CMs med forskellige former, som repræsenterer forskellige patologier, og sortering af disse klæbende CMs baseret på deres morfologi på et enkelt celleniveau. Den foreslåede platform giver en ny tilgang til høj gennemløb og narkotika screening for forskellige typer af HF.
Ifølge Verdenssundhedsorganisationen, hjerte-kar-sygdom (CVD) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. CVD påvirker dramatisk kvaliteten af folks liv og har en enorm socioøkonomisk indvirkning. Kardiomyopatier, såsom HCM og DCM, er primære lidelser i hjertemusklen og større årsager til HF har været forbundet med høj sygelighed og dødelighed. Der er mange årsager til HF, herunder miljømæssige virkninger, såsom infektioner og udsættelse for toksiner eller visse lægemidler8. HF kan også være forårsaget af genetisk disposition, nemlig mutationer9. Det menes, at de ændringer i den genetiske sammensætning, der påvirker ekstracellulære matrix (ECM) molekyler, integriner eller cytoskeletale proteiner kan være ansvarlig for nedsat mekanosensation og forskellige typer af hjertesygdom10.
Det vigtigste træk ved HCM er uforklarlig hypertrofi af venstre hjertekammer11, og nogle gange af højre hjertekammer12, og dette ofte præsenterer med fremherskende inddragelse af interventrikulær septum. HCM er også karakteriseret ved diastolisk dysfunktion og myocyte uorden og fibrose13. I de fleste tilfælde påvirkes hjertets kontraktile apparat af mutationer i sarkomeriske proteiner, hvilket fører til øget kontraktilitet af myocytterne14. I modsætning hertil er DCM karakteriseret ved dilatation af en, eller begge, hjertekamrene og har en familiær ætiologi i 30% til 50% aftilfældene 15. DCM påvirker en bred vifte af cellulære funktioner, hvilket fører til nedsat sammentrækning af myocytter, celledød og fibrotisk reparation16.
Genetik har vist, at visse typer af mutationer tvinge enkelt CMs til at vedtage specifikke form egenskaber under HCM3, nemlig firkantede celler med en længde:bredde AR, der er næsten lig med 1:14 (AR1). Det samme gælder for DCM, med aflange celler med en AR, der er næsten lig med 11:1 (AR11). Desuden kan HF være forårsaget af øget efterbelastning (f.eks. i hypertension). I disse tilfælde, hæmodynamiske krav tvinge CMs at tage på firkantede former, i henhold til Laplace lov, og AR ændringer fra 7:15 (AR7) til 1:16,7. HF kan også skyldes en stigning i forbelastning (f.eks. under forhold, der fører til overbelastning af volumen). Når dette sker, tvinger de biofysiske begrænsninger CMs til at forlænge, og AR ændres fra 7:1 til 11:1.
Signalaktivitet ved membraner afhænger af globale cellegeometriparametre, såsom cellulære AR, størrelse, membranoverfladearealet og membrankrummene18. Når neonatal rotte CMs blev belagt på substrater, der var mønstret for at begrænse cellerne i en bestemt længde: bredde AR, de viste den bedste kontraktile funktion, når forholdet svarede til cellerne i en sund voksen hjerte. I modsætning hertil klarede de sig dårligt, når forholdet svarede til myocytes i svigtende hjerter19. I de tidlige stadier af hypertrofi, celler bliver bredere, som afspejles af en stigning i tværsnitsområdet. HF opstår i de senere stadier af hypertrofi og celler synes typisk aflange. Derfor er det ikke overraskende, at in vivo rotte modeller af kronisk hypertrofi har rapporteret en stigning i venstre ventrikel myocyte længde på omkring 30%20,men voksne CMs fra transgene mus model, der blev akut behandlet med hypertrofiske stimuli in vitro vist lignende stigninger i cellebredde i stedet21.
Single-celle RNA sekventering, som giver mulighed for præcis analyse af transskription af enkelte celler, er i øjeblikket revolutionerer forståelsen af cellebiologi. Denne teknologi var den foretrukne metode, når det kom til at besvare spørgsmålet om, hvordan de enkelte celleformer påvirkede genekspressionen. Vi sammenlignede enkelte celler med forskellige former, især med 1:1, 7:1 eller 11:1. Dette blev gjort ved at så neonatal rotte ventrikulære CMs på en specielt designet chip fyldt med fibronectin-belagt mikropattern2 med definerede ARs af 1:1, 7:1 eller 11:1. Mikrostofferne blev fremstillet ved hjælp af fotolitografiteknologi. Mikromuderne var belagt med fibronectin, omgivet af cytofobisk overflade. Derfor vil CMs vedhæfte, sprede og fange den definerede AR af mikropatterner ved udelukkende at vokse på fibronectin substrat, samtidig med at man undgår det cytofobiske område. Mikropjerne er ikke i et velformet format. I stedet er fibronectinniveauet nøjagtigt i samme højde af det omgivende cytofobiske område. Dette gav lignende betingelser til voksende celler i en petriskål, da der ikke er stress fra de omkringliggende vægge. Desuden er overfladearealet af mikropatterner med forskellige AR’er lige.
Der var to særligt vigtige aspekter af det eksperimentelle design, som førte til brug af encellet RNA-sekventering i stedet for bulk-RNA-sekvensering. For det første kan kun nogle få procenter af mikropættern være besat af en enkelt celle. For det andet, nogle gange en enkelt celle ikke fuldt besætte mikropattern overflade. Enkelte celler, der helt dækker en mikropattern overflade skal plukkes til encellet RNA-analyse. Fordi kun en undergruppe af de belagte celler på en chip opfyldt begge kriterier, var det ikke muligt blot at trypsinize hele chippen og indsamle alle celler til bulk RNA sekventering. Kvalificerede celler skulle plukkes individuelt ved hjælp af en halvautomatisk cellevælger.
Det er i øjeblikket fortsat uvist, om CM form, i sig selv, har en intra-funktionel indvirkning på myokardie syncytium. Hovedformålet med de metoder , der foreslås i dette dokument , var at udvikle en ny platform til at undersøge , om celleformen i sig selv havde en indvirkning på transskriptions17. Selv om in vitro-undersøgelser er forskellige fra in vivo-undersøgelser, var formålet med denne undersøgelse at undersøge virkningen af forskellige celleformer på genekspression, i betragtning af at det er ekstremt krævende at sammenligne celler med forskellige former in vivo. Disse eksperimenter var inspireret af Kuo et al.19, der brugte en lignende tilgang og rapporterede, at de observerede ændringer i fysiologiske parametre på grund af ændringer i celleform.
Denne undersøgelse brugte encellet RNA-sekvensering, som er en ny og kraftfuld teknologi, der kan detekskriptisere enkelte celler. Det blev kombineret med en innovativ tilgang til dyrkning enkelt CMs, således at de tog på forskellige ARs, at ellers kun kunne have været observeret in vivo.
Undersøgelsen havde nogle begrænsninger. For eksempel, neonatal CMs skulle bruges til at generere forskellige morfotyper, da det er usædvanligt udfordrende at kultur nok vitale voksne VM’er i 72 timer i definerede former. Desuden blev CMs dyrket i 72 timer ex vivo, hvilket kunne have haft en indvirkning på genekspressionsmønsteret. Men denne dyrkning var nødvendig, så cellerne kunne danne specifikke morfotyper. Desuden blev kun enkelte celler, der var mononukleerede og fuldt dækkede fibronectinmikropattern, udvalgt til sortering. Mønstrede celler på hver chip skal sorteres blot i en runde sortering. Endelig blev omkring 50 celler, der er omkring en tredjedel af de udvalgte celler, med succes samlet op fra hver chip. Der er to årsager til, at antallet af plukkede celler blev begrænset. For det første var nogle celler for tæt fastgjort til fibronectin mønster og pickup flow var ikke tvungen nok til at samle dem op. For det andet, på grund af trypsin behandling, den vedhæftede fil mellem nogle celler og fibronectin blev for løs. Derfor blev disse celler skubbet væk fra deres fibronectin mikropatterner, når mikrokapillær nærmede sig dem, og de blev ikke samlet op. Forfatterne hævder ikke, at dette setup er det samme som en in vivo miljø, men det viste sig at være en holdbar tilgang til at besvare forskning spørgsmål.
Den foreslåede metode gælder for forskellige celletyper (f.eks. for hiPS-CMs). Følgende faktorer bør dog optimeres til at undersøge andre celletyper. Der bør anvendes egnede ECM-klæbemolekyler til fastgørelse af den specifikke celletype til belægning af mikropatterne. Mikroorganernes geometri skal ændres i henhold til undersøgelsesspørgsmålet og celletypen. Dyrkningsperioden kan ændres på baggrund af undersøgelsesspørgsmålet. Løsrivelsesgenoperen og dets inkubationstid skal optimeres præcist til studiecelletypen. For eksempel kan Accutase anvendes i stedet for TryplE til løsrivelse af embryonale og neuronale stamceller. Ventilernes åbningstidsparametre bør undersøges for at plukke celler med succes, men forsigtigt. Sammenfattende har vi udviklet en ny platform til at studere celleform, der kan give en værdifuld ressource for forskere på området. I denne sammenhæng designede vi en eksperimentel tilgang, der efterlignede in vitro-karakteristiske former, der er pålagt CM in vivo af hæmodynamiske begrænsninger for at identificere samspillet mellem cellulær arkitektur og genekspression. Vi rapporterer også om udviklingen af en ny platform til at studere HF in vitro og identifikation af celleform som en stærk determinant for genekspression. Dette er en ny observation med vidtrækkende konsekvenser for biologi og medicin.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |