Summary
Este artigo apresenta métodos para o crescimento de miócitos cardíacos com diferentes formas, que representam diferentes patologias, e classificação desses miócitos cardíacos aderentes com base em sua morfologia a um único nível celular. A plataforma proposta fornece uma nova abordagem para o alto rendimento e triagem de drogas para diferentes tipos de insuficiência cardíaca.
Abstract
Diferentes tipos de hipertrofia cardíaca têm sido associados a um volume aumentado de miócitos cardíacos (CMs), juntamente com alterações na morfologia cm. Embora os efeitos do volume celular na expressão genética sejam bem conhecidos, os efeitos da forma celular não são bem compreendidos. Este artigo descreve um método que foi projetado para analisar sistematicamente os efeitos da morfologia cm na expressão genética. Ele detalha o desenvolvimento de uma nova estratégia de captura de células únicas que é seguida pelo sequenciamento mRNA de célula única. Um chip micropatterned também foi projetado, que contém 3000 micropatterns de fibronectina em forma retangular. Isso permite o crescimento de CMs em proporções distintas de comprimento:largura (AR), correspondentes a diferentes tipos de insuficiência cardíaca (HF). O artigo também descreve um protocolo que foi projetado para pegar células únicas de seu padrão, usando um catador de células micro-pipetting semi-automatizado, e injetá-las individualmente em um buffer de lise separado. Isso possibilitou traçar o perfil dos transcritos de CMs únicos com morótipos geométricos definidos e caracterizá-los de acordo com uma série de condições normais ou patológicas: cardiomiopatia hipertrófica (HCM) ou pós-carga/concentro versus cardiomiopatia dilatada (DCM) ou pré-carga/excentricidade. Em resumo, este artigo apresenta métodos para o cultivo de CMs com diferentes formas, que representam diferentes patologias, e classificação desses CMs aderentes com base em sua morfologia em um nível unicelular. A plataforma proposta fornece uma nova abordagem para alta produtividade e triagem de medicamentos para diferentes tipos de HF.
Introduction
Segundo a Organização Mundial da Saúde, a doença cardiovascular (DCV) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A DCV afeta drasticamente a qualidade de vida das pessoas e tem um enorme impacto socioeconômico. Cardiomiopatias, como HCM e DCM, são distúrbios primários do músculo cardíaco e as principais causas de HF têm sido associadas à alta morbidade e mortalidade. Existem muitas causas de HF, incluindo efeitos ambientais, como infecções e exposição a toxinas ou certos medicamentos8. HF também pode ser causada por predisposição genética, ou seja, mutações9. Acredita-se que as alterações na composição genética que afetam moléculas de matriz extracelular (ECM), integrins ou proteínas citoesqueletal podem ser responsáveis pela mecanosensação prejudicada e vários tipos de doença cardíaca10.
A principal característica do HCM é a hipertrofia inexplicável do ventrículo esquerdo11, e às vezes do ventrículo direito12, e isso frequentemente apresenta o envolvimento predominante do septo interventricular. O HCM também é caracterizado por disfunção diastólica e desordem mióctea e fibrose13. Na maioria dos casos, o aparelho contracttil do coração é afetado por mutações em proteínas sarcomericas, levando ao aumento da contratilidade dos miócitos14. Em contrapartida, o DCM é caracterizado pela dilatação de um, ou ambos, ventrículos e tem uma etiologia familiar em 30% a 50% dos casos15. O DCM afeta uma ampla gama de funções celulares, levando à contração prejudicada dos miócitos, morte celular e reparação fibrosa16.
A genética mostrou que certos tipos de mutações forçam os CMs únicos a adotar características específicas de forma durante o HCM3, ou seja, células em forma quadrada com um ar de comprimento:largura que é quase igual a 1:14 (AR1). O mesmo vale para o DCM, com células alongadas com ar quase igual a 11:1 (AR11). Além disso, o HF pode ser causado pelo aumento da carga posterior (por exemplo, na hipertensão). Nesses casos, as demandas hemodinâmicas forçam os CMs a assumir formas quadradas, de acordo com a lei de Laplace, e o AR muda de 7:15 (AR7) para 1:16,7. O HF também pode ser causado por um aumento na pré-carga (por exemplo, em condições que levam à sobrecarga de volume). Quando isso acontece, as restrições biofísicas forçam os CMs a alongar e o AR muda de 7:1 para 11:1.
A atividade de sinalização nas membranas depende de parâmetros globais de geometria celular, como o AR celular, tamanho, a área da superfície da membrana e a curvatura da membrana18. Quando os CMs de ratos neonatais foram banhados em substratos que foram padronizados para restringir as células em um ar específico de comprimento:largura, eles demonstraram a melhor função contratil quando as razões eram semelhantes às células em um coração adulto saudável. Em contraste, tiveram um desempenho ruim quando as proporções eram semelhantes às dos miócitos em corações fracassados19. Nos estágios iniciais da hipertrofia, as células se tornam mais largas, como refletido pelo aumento da área transversal. HF ocorre nos estágios posteriores da hipertrofia e as células normalmente aparecem alongadas. Portanto, não é de surpreender que modelos in vivo de ratos de hipertrofia crônica tenham relatado um aumento no comprimento do miócito ventricular esquerdo de cerca de 30%20, mas CMs adultos do modelo de camundongo transgênico que foram tratados agudamente com estímulos hipertróficos in vitro demonstraram aumentos semelhantes na largura celular em vezde 21.
O sequenciamento de RNA unicelular, que permite a análise precisa do transcriptome de células únicas, está atualmente revolucionando a compreensão da biologia celular. Essa tecnologia foi o método preferido quando se tratava de responder à questão de como as formas celulares individuais afetam a expressão genética. Comparamos células únicas com diferentes formas, em particular com RS de 1:1, 7:1 ou 11:1. Isso foi feito semeando os CMs ventriculares de ratos neonatais em um chip especialmente projetado cheio de micropatterns revestidos de fibronectina2 com RS definidos de 1:1, 7:1 ou 11:1. Os micropatterns foram fabricados usando tecnologia de fotolitografia. Os micropatterns foram revestidos por fibronectina, cercados por superfície citofóbica. Portanto, os CMs anexarão, espalharão e capturarão o AR definido de micropatterns, crescendo unicamente no substrato de fibronectina, evitando a área citofóbica. Os micropatterns não estão em um formato bem moldado. Em vez disso, o nível de fibronectina está exatamente na mesma altura da área citofóbica circundante. Isso proporcionou condições semelhantes ao crescimento de células em uma placa de Petri, já que não há estresse das paredes circundantes. Além disso, a superfície de micropatterns com diferentes RS são iguais.
Havia dois aspectos particularmente importantes do design experimental, o que levou ao uso de sequenciamento de RNA unicelular em vez de sequenciamento de RNA em massa. Primeiro, apenas algumas porcentagens dos micropatterns podem ser ocupadas por uma única célula. Segundo, às vezes uma única célula não ocupa totalmente a superfície de micropattern. Células únicas que cobrem completamente uma superfície de micropattern devem ser escolhidas para análise de RNA unicelular. Como apenas um subgrupo das células banhadas em um chip satisfazia ambos os critérios, não era viável simplesmente tentarpsinizar todo o chip e coletar todas as células para sequenciamento de RNA em massa. Células qualificadas precisavam ser escolhidas individualmente usando um catador de células semi-automatizado.
Atualmente ainda não se sabe se a forma cm, por si só, tem um impacto intra-funcional no sinintécio miocárdico. O principal objetivo dos métodos propostos neste artigo foi desenvolver uma nova plataforma para estudar se a forma celular em si teve impacto no transcriptome17. Embora os estudos in vitro sejam diferentes dos estudos in vivo, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito de diferentes formas celulares na expressão genética, tendo em vista que comparar células com diferentes formas in vivo é extremamente exigente. Esses experimentos foram inspirados por Kuo et al.19, que utilizaram uma abordagem semelhante e relataram que observaram alterações nos parâmetros fisiológicos devido a alterações na forma celular.
Protocol
Todos os procedimentos envolvendo animais estavam de acordo com as normas do comitê de ética animal do Instituto Karolinska, Estocolmo, Suécia.
1. Layout de chip micro-padronizado
- Use um chip personalizado(Tabela de Materiais)(Figura 1A): um deslizamento de cobertura de 19,5 mm x 19,5 mm com micropatters ativados, impresso pela fotolithografia em vidro borossilicato.
NOTA: Estes micropatterns estão cercados por uma área citofóbica. Portanto, uma célula semeada só pode anexar e crescer em um desses micropatterns e capturar o AR desse micropattern. O chip é dividido em três zonas e cada zona consiste em micropatterns com um AR específico. O layout do chip é mostrado na Figura 1B. A geometria das RS definidas é apresentada na Tabela 1. Imagens fluorescentes ampliadas das diferentes formas dos micropatterns de fibronectina são mostradas nas imagens inferiores na Figura 1B.
2. Revestimento de chips micropatterados
- Prepare a solução de proteína de revestimento 2x para cada chip adicionando 80 μg de fibronectina a 2 mL de soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS-/-).
- Transfira um chip para uma placa Greiner Petri de 35 mm e adicione imediatamente 2 mL de PBS-/-. Em seguida, adicione 2 mL da solução de proteína de revestimento 2x.
- Incubar os chips em temperatura ambiente por 2h.
- Lave a solução de revestimento por sucessivas etapas de diluição com PBS-/-. A superfície do chip deve estar sempre molhada. Em seguida, substitua o PBS por 2 mL de meio de revestimento e incubar a 37 °C até as células de semeadura.
3. Isolamento de CMs
- Prepare o meio de chapeamento suplementando DMEM:M199 (4:1) com 10% de soro de cavalo, 4% soro bovino fetal, 2% HEPES (1 M) e 1% penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)22.
- Dissecar o tecido do ventrículo esquerdo de corações de ratos neonatais de 2 dias de idade e transferir para um prato de 10 cm contendo PBS. Corte o tecido em aproximadamente 1 mm3 pedaços.
- Transfira o tecido colhido em um tubo de tampa de rotor, equipado com um rotor na tampa para dissociaçãotecidual (Tabela de Materiais). Deixe o tecido se acalmar e, em seguida, remova cuidadosamente o supernante.
- Adicione 2,5 mL da mistura de enzimas mix 1 e 2, preparada utilizando o Kit de Dissociação Cardíaca Neonatal(Tabela de Materiais),ao Tubo C e feche a tampa com força.
- Insira o tubo rotor-tampa na manga do dissociador, equipado com aquecedores(Figura 2A e B)(Tabela de Materiais). Execute o programa de incubação 37C_mr_NHDK_1 (Figura 2C),que dura cerca de uma hora.
- Enquanto o programa de incubação estiver em execução, prepare o tampão PEB contendo 2 mM EDTA e 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) na PBS, pH 7.2 e mantenha-a a 4 °C.
- Após o término do programa de incubação, desprende o tubo de tampa do rotor(Figura 2D) e adicione 7,5 mL de meio de revestimento pré-aquecido.
- Resuspenda a amostra e filtrar a suspensão celular usando um coador de 70 μm.
- Lave o coador com mais 3 mL de meio de revestimento.
- Centrifugar a suspensão da célula a 600 x g por 5 min. Aspire completamente o supernatante.
- Resuspenda a pelota de célula em 60 μL de tampão PEB frio.
- Adicione 20 μL de Coquetel de Isolamento de Cardiomiocócito Neonatal(Tabela de Materiais),contendo contas do tamanho de míccros que visam não-CMs.
- Adicione 20 μL de contas de células sanguíneas anti-vermelhas(Tabela de Materiais).
- Misture a suspensão e incubar a 4 °C por 15 minutos.
- Adicione 400 μL de tampão PEB.
- Aplique a suspensão da célula na coluna LD(Tabela de Materiais),que foi inserida verticalmente em um suporte de ímã e lavada bem com tampão PEB.
- Colete células sem rótulo e lave a coluna com 0,5 mL de tampão PEB.
- Adicione 8 mL de meio de revestimento e transfira a suspensão da célula para um frasco de cultura não revestido de 75 cm2 e incubar a 37 °C por 1,5 h. Os demais não-CMs começarão a aderir à cultura celular não revestida e a suspensão celular será enriquecida pela população de CM.
4. Padronização de CMs
NOTA: Comparamos CMs individuais com RS de 1:1, 7:1 ou 11:1. Isso é feito semeando os CMs de ratos neonatais isolados em um chip especialmente projetado cheio de micropatters revestidos de fibronectina com RS definidos de 1:1, 7:1 ou 11:1. Os micropatterns foram revestidos por fibronectina, cercados por superfície citofóbica. Portanto, os CMs anexarão, espalharão e capturarão o AR definido de micropatterns, crescendo unicamente no substrato de fibronectina. Padre os CMs isolados de acordo com as etapas seguintes.
- Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL, conte as células e dilua para uma concentração de 100.000 células por mL adicionando meio de revestimento apropriado.
- Adicione 2 mL de suspensão celular ao chip, que já foi submerso em 2 mL de meio de revestimento quente dentro de uma placa Greiner Petri de 35 mm.
- Incubar o prato a 37 °C com 5% de CO2 para deixar os CMs ligados aos micropatterns revestidos de fibronectina e permitir que cada CM adquira o AR de seu micropattern substrato.
- Depois das 18h, verifique o chip. Se a maioria das células se prenderem, desprendem e removam os detritos e células mortas que estão ligados à célula padronizada. Faça isso removendo o meio de chapeamento e adicionando suavemente PBS-/- dropwise, começando a partir do centro do chip e, em seguida, movendo-se em direção aos lados. Repita duas vezes.
- Aspire o PBS com meio de manutenção fresco suplementando DMEM:M199 (4:1) com 4% de soro de cavalo, 4% soro bovino fetal, 2% HEPES (1 M) e 1% penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL).
5. Escolher CMs aderentes
NOTA: Após um período de cultivo de 72 horas, os CMs únicos padronizados são escolhidos a partir de seus micropatterns de fibronectina usando um catador de células semi-automatizado(Tabela de Materiais)(Figura 3). O catador de células usa um software23 para controlar o estágio motorizado (Figura 3A). Uma microcapillaria de vidro de 70 μm (Figura 3B) é usada para colher e injetar os CMs de ratos neonatais padronizados. O catador de células classifica as células aderentes gerando um vácuo e injetando as células aplicando pressão. O vácuo na seringa número 1 é aplicado puxando a seringa usando a bomba de seringa(Figura 3C). A pressão hidrostática é baseada na gravidade e induzida pela colocação da seringa número 2 a uma distância de 87 cm sobre a mesa do microscópio. As seringas 1 e 2 estão respectivamente conectadas através de tubos PTFE, às válvulas 1 e 2, que estão embutidas na unidade de controle(Figura 3D). Os tubos PTFE estão completamente cheios de água sem RNase. A célula única escolhida é então injetada no tubo de reação de corrente de polimerase (PCR), contendo 3,55 μL de tampão de lise.
- Após um período de cultivo de 72 horas, remova o antigo meio e lave suavemente a superfície do chip com DPBS quente-/-.
- Mantenha o prato plano e aspire o meio antigo suavemente com uma pipeta de 1000 μL de um lado do prato. Certifique-se de que o chip permanece molhado o tempo todo.
- Adicione 2 mL de DPBS-/- suavemente e desprende a maioria das células mortas que estão presas às células padronizadas, começando pelo centro do chip e, em seguida, movendo-se para seus lados.
- Aspire a maior parte do DPBS para remover o maior número possível de células flutuantes separadas, começando pelo centro do chip e, em seguida, movendo-se para os lados.
- Repita as etapas 5.1.2 e 5.1.3 mais uma vez.
- Use fórceps angulares para pegar a borda do chip e transferi-lo imediatamente para uma nova placa estéril greiner petri de 35 mm para reduzir o número de células flutuantes durante a colheita.
- Adicione imediatamente 1,5 mL de DPBS-/- para que o chip não seque.
- Adicione 1,5 μL de verde ciclo de corante vibrante para visualizar os núcleos das células vivas.
- Coloque o chip no centro da placa Greiner Petri usando a ponta dos fórceps.
- Coloque uma câmara(Tabela de Materiais)sobre o chip. A câmara vai fixar o chip na parte inferior do prato, sem bloquear o acesso aos padrões celulares.
- Monte a placa Greiner Petri no suporte da placa do estágio de catador de células e insira a tampa magnética.
- Calibrar a injeção automatizada.
- Localize a mira, que está gravada no estágio motorizado no meio da imagem na janela Live View.
- Concentre-se na mira e selecione o botão calibração para injeção automatizada na janela de digitalização e classificação.
- Substitua o DPBS-/- por 1,5 mL de DPBS/trypsin-/- (1:1) enquanto o prato estiver no palco, para soltar as células da fibronectina para que um vácuo fluido possa ser usado para colher as células.
- Escaneie todo o chip usando a guia Digitalização na janela Desarmamento e classificação. Localize o canto superior esquerdo do chip no campo de visão e clique em Obter a posição atual do microscópio na linha superior esquerda do canto esquerdo.
- Em seguida, mova o estágio motorizado para o canto inferior direito do chip. Concentre o microscópio e clique em Obter a posição atual do microscópio na linha inferior do canto direito.
- Clique no botão Definir o plano mais nítido e no clique da janela surgido no canto superior direito. Concentre o microscópio e clique em Ir para o canto inferior esquerdo e definir o foco. Quando terminar clique no botão Terminar e comece a digitalizar.
- Quando a varredura for encerrada, vá para a guia Analisar e selecione as células únicas que passam pelos critérios de estudo.
- Certifique-se de que o microcapilário de vidro está no meio da visão ao vivo do microscópio.
- Controle a bomba de seringa usando a janela Bomba do software. Crie um vácuo retirando 4 mL de uma seringa número 1 de 50 mL, que tem um diâmetro de 27 mm.
- Na guia Classificação
- Ajuste os parâmetros de injeção das válvulas. Calculou-se que o volume de injeção que entregou uma célula única escolhida era de 1 μl, se a válvula 2 foi aberta por 120 milissegundos e, em seguida, a válvula 1 aberta por 20 foi milissegundos após um lapso de tempo de 200 milissegundos. Devido à elasticidade dos tubos, abra a válvula 1 para parar de injetar o fluxo.
- Ajuste os parâmetros de captação das válvulas. Calculou-se que se a válvula 1 foi aberta por 20 milissegundos e, em seguida, a válvula 2 foi aberta por 10 milissegundos, após um lapso de tempo de 10 milissegundos, a maioria das células padronizadas pode ser captada. Isso porque suas ligações de fibronectina foram afrouxadas após serem tratadas pela trippsina.
- Clique no botão Calcular o caminho. O software calcula o caminho mais rápido de célula em célula, para pegar e injetar as células selecionadas ao longo do chip.
- Concentre o microscópio em uma célula padronizada na superfície do chip.
- Usando o joystick, mova o microcapilar para baixo cuidadosamente, para que a imagem mais nítida da ponta da microcapilar possa ser obtida sem tocar na célula.
- Clique no botão Definir na seção de deslocamento micropipette. Uma nova janela aparecerá, mostrando a seção transversal microcapilária. Clique no centro exato do capilar. Em seguida, o software gravará o deslocamento de ponta do capilar nas coordenadas x, y e z.
- Inicie a classificação usando o botão Iniciar de classificação.
Representative Results
O tecido foi dissecado a partir do ventrículo esquerdo dos corações de ratos neonatais de 2 dias de idade e dividido em células únicas. Em seguida, os CMs enriquecidos foram semeados em um chip contendo padrões de fibronectina com RRs distintos. Após 72 horas de cultivo, o meio foi substituído por 1:1000 Vibrant Dye Cycle verde em DPBS-/- por 2 minutos para visualizar os núcleos das células vivas. Em seguida, as células foram tratadas com DPBS-/-/trypsin (1:1) para afrouxar as células da fibronectina, de modo que um vácuo fluido pudesse ser usado para facilitar a colheita celular. Enquanto isso, o chip inteiro foi escaneado em uma ampliação de 10x, usando um microscópio invertido conectado ao catador de células. Isso foi realizado antes das células serem arredondadas devido ao tratamento de tripca. As células qualificadas foram selecionadas, com base na imagem digitalizada, e suas coordenadas foram salvas no software de coleta de células. Os micropatterns só foram selecionados se contiverem uma célula única mononucleada e somente quando a célula cobrisse totalmente sua micropattern fibronectina. O classificador de células escolheu as células selecionadas uma a uma e cada célula que foi escolhida com sucesso foi imediatamente injetada em um tubo PCR individual e colocada no estágio do microscópio. Cada tubo PCR continha 3,55 μL de tampão de lise(Tabela 2). O processo de triagem, que começou com a remoção da mídia, foi concluído em 40 minutos. A síntese complementar de ácido desoxiribonucleico (cDNA), a pré-amplificação e purificação do PCR foram realizadas nas células únicas lised, com base no protocolo Smart-Seq224 (Tabela 3). A qualidade do cDNA purificado foi verificada por um analisador automatizado de eletroforese. O eletroferograma do cDNA pré-amplificado de uma única célula escolhida é apresentado na Figura 4. As bibliotecas RNA-Seq foram preparadas de acordo com o protocolo Smart-Seq224.
Para observar a estrutura sarcomere dos CMs padronizados, os CMs padronizados foram manchados com anticorpo sarcomeric α-actinin. As células foram incubadas com Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 1:800 por 1 hora em temperatura ambiente para a coloração secundária. Os núcleos foram manchados com DAPI de 1 μg/mL. As imagens imunofluorescentes foram adquiridas com um microscópio confocal invertido, utilizando um objetivo de imersão a óleo de 63x (NA 1.4)(Figura 5).
Figura 1: Layout do chip com micropatters de fibronectina.
(A) Imagem do chip personalizado. O chip é um cavado de 19,5 mm x 19,5 mm com micropatterns de fibronectina, impresso pela fotolitografia em um vidro borossilicato. (B) Layout do chip. O chip é dividido em três zonas e cada zona consiste em micropatterns de fibronectina com AR específicos. Imagens fluorescentes de diferentes formas de micropatterns de fibronectina são mostradas em visão ampliada para cada zona. Esta figura foi modificada a partir de "material suplementar 1" por Haftbaradaran Esfahani et al.2, usado sob http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dissociador equipado com aparelho aquecedor.
(A) Todo o instrumento dissociador utilizado para a dissociação totalmente automatizada de ventrículos de rato neonatal de 2 dias de idade. (B) Unidade de aquecimento. (C) Tubo de tampa de rotor. (D) Programas prontos para uso para um fluxo de trabalho totalmente automatizado de dissociação de tecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aparelho de catador de células.
(A) Visão ampliada do estágio motorizado do catador de células. Um suporte de placa de petri e 80 furos para 10 tiras PCR e um orifício para calibração na mira é incorporado no palco. (B) Visão ampliada de um microcapilário de vidro. (C) A bomba de seringa. (D) A unidade de controle, que controla a janela de tempo de abertura e fechamento das válvulas 1 e 2, montada dentro da unidade de controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O eletroferograma do cDNA pré-amplificado de uma célula única escolhida.
Utilizou-se 19 ciclos de pré-amplificação para obter 15 μL de rendimento de cDNA purificado 1ng/μL. Uma faixa clara na trama de densitometria semelhante a gel é observada que corresponde ao pico de 1852 bp no eletroferograma. O tamanho médio dos fragmentos é de 1588 bp. Além disso, a pequena quantidade de fragmentos com menos de 300 bp indica uma boa biblioteca cDNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Coloração imunofluorescente de estrutura sarcomeric de α-actinin (verde) e núcleo (azul) de CMs padronizados com diferentes ARs.
A cromatina foi manchada pelo DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Morfótipo | AR | Comprimento (μm) | Largura (μm) | Área de fibronectina (μm2) |
| AR1 | 1:1 | 47 | 47 | 2209 |
| AR7 | 7:1 | 126 | 18 | 2268 |
| AR11 | 11:1 | 155 | 14 | 2170 |
Tabela 1: Geometria de CMs padronizados.
| Componente | Volume (μL) |
| Água sem núcleos | 0.65 |
| (0,4% vol/vol) Tritão X-100 | 1.8 |
| mistura dNTP (25 mM) | 0.8 |
| Inibidor de RNase (40 U μL-1) | 0.1 |
| Oligo-dT30VN oligonucleotídeos (100 μM) | 0.1 |
| ERCC RNA Spike-In Mix (2,5 x 105 diluição) | 0.1 |
| Célula única injetada | 1 |
| Volume total | 4.55 |
Tabela 2: Tampão de lise personalizada de célula única.
| Componente | Volume (μL) |
| Tampão de primeira linha supercrito II (5x) | 2 |
| DTT (100 mM) | 0.5 |
| Betaine (5 M) | 2 |
| Mgcl2 (1 M) | 0.1 |
| Inibidor de RNase (40 U μL-1) | 0.25 |
| Transcrição reversa do superscript II (200 U μL-1) | 0.5 |
| TSO (100 μM) | 0.1 |
| Volume total | 5.45 |
Tabela 3: Mistura de transcrição reversa (RT) para uma reação RT para sintetizar o CDNA de primeira linha a partir do lysate de um único CM.
Discussion
Este estudo utilizou o sequenciamento de RNA unicelular, que é uma tecnologia nova e poderosa que pode detectar o transcriptome de células únicas. Foi combinado com uma abordagem inovadora para a cultura de CMs individuais, de modo que eles assumiram diferentes ARs que, caso contrário, só poderiam ter sido observados in vivo.
O estudo teve algumas limitações. Por exemplo, os CMs neonatais tiveram que ser usados para gerar diferentes morótipos, pois é excepcionalmente desafiador cultivar CMs adultos vitais suficientes por 72 horas em formas definidas. Além disso, os CMs foram cultivados por 72 horas ex vivo, o que pode ter tido um impacto no padrão de expressão genética. No entanto, essa colheita era necessária, para que as células pudessem formar morótipos específicos. Além disso, apenas células únicas mononucleadas e totalmente cobertas pela micropatterna fibronectina foram selecionadas para classificação. Células padronizadas em cada chip devem ser classificadas apenas em uma rodada de classificação. Finalmente, cerca de 50 células que são cerca de um terço das células selecionadas foram captadas com sucesso de cada chip. Há duas razões que restringiram o número de células escolhidas com sucesso. Primeiro, algumas células estavam muito ligadas ao padrão de fibronectina e o fluxo de captação não foi forçado o suficiente para pegá-las com sucesso. Em segundo lugar, devido ao tratamento de trippsina, o apego entre algumas células e a fibronectina tornou-se muito solto. Consequentemente, essas células foram afastadas de seus micropatterns de fibronectina, quando a microcapilaria se aproximou delas, e elas não foram captadas. Os autores não afirmam que essa configuração é a mesma de um ambiente in vivo, mas provou ser uma abordagem viável para responder à pergunta da pesquisa.
O método proposto é aplicável em diferentes tipos de células (por exemplo, para hiPS-CMs). No entanto, os seguintes fatores devem ser otimizados para estudar outros tipos de células. Moléculas adesivas ECM adequadas para fixação do tipo celular específico devem ser usadas para o revestimento dos micropatterns. A geometria dos micropatterns deve ser modificada de acordo com a questão do estudo e tipo celular. O período de cultivo pode ser modificado com base na questão do estudo. O reagente de desprendimento e seu tempo de incubação devem ser otimizados precisamente para o tipo de célula de estudo. Por exemplo, accutase pode ser usado em vez de TryplE para desprendimento de células-tronco embrionárias e neuronais. Os parâmetros de tempo de abertura das válvulas devem ser examinados para colher células com sucesso, mas suavemente. Em resumo, projetamos uma nova plataforma para estudar a forma celular que pode fornecer um recurso valioso para pesquisadores da área. Nesse contexto, projetamos uma abordagem experimental que imitava formas características in vitro impostas ao CM in vivo por restrições hemodinâmicas para identificar a interação entre arquitetura celular e expressão genética. Também relatamos o desenvolvimento de uma nova plataforma para estudar o HF in vitro e a identificação da forma celular como um poderoso determinante da expressão genética. Esta é uma nova observação com implicações de longo alcance para a biologia e medicina.
Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
| Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
| Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
| Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
| CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
| CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
| CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
| dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
| DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
| Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
| LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
| NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
| Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
| Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
| RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
| sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
| SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
| Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
| TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
| Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |
References
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