Cet article présente des méthodes pour la croissance des myocytes cardiaques de différentes formes, qui représentent différentes pathologies, et le tri de ces myocytes cardiaques adhérents basés sur leur morphologie à un seul niveau cellulaire. La plate-forme proposée offre une nouvelle approche au débit élevé et au dépistage des médicaments pour différents types d’insuffisance cardiaque.
Différents types d’hypertrophie cardiaque ont été associés à un volume accru de myocytes cardiaques (MC), ainsi qu’à des changements dans la morphologie cm. Bien que les effets du volume cellulaire sur l’expression des gènes soient bien connus, les effets de la forme cellulaire ne sont pas bien compris. Cet article décrit une méthode qui a été conçue pour analyser systématiquement les effets de la morphologie cm sur l’expression des gènes. Il détaille le développement d’une nouvelle stratégie de piégeage à cellules simples qui est ensuite suivie d’un séquençage de l’ARNm unicelliste. Une puce micropatrée a également été conçue, qui contient 3000 micropatterns de fibronectine en forme de rectangulaire. Cela permet de faire croître les MC en longueur distincte : rapports d’aspect largeur (AR), correspondant à différents types d’insuffisance cardiaque (HF). Le document décrit également un protocole qui a été conçu pour ramasser les cellules individuelles de leur modèle, à l’aide d’un micro-pipetting semi-pipetting picker cellulaire, et les injecter individuellement dans un tampon de lyse séparée. Cela a permis de profiler les transcriptomes des MC simples avec des morphotypes géométriques définis et de les caractériser en fonction d’une gamme de conditions normales ou pathologiques : cardiomyopathie hypertrophique (HCM) ou après charge/concentrique versus cardiomyopathie dilatée (DCM) ou préchargement/excentrique. En résumé, cet article présente des méthodes pour cultiver des MC de formes différentes, qui représentent différentes pathologies, et le tri de ces MC adhérents en fonction de leur morphologie à un niveau unicellulaire. La plate-forme proposée offre une nouvelle approche du dépistage du débit élevé et des médicaments pour différents types de HF.
Selon l’Organisation mondiale de la santé, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde. La MCV affecte considérablement la qualité de vie des gens et a un impact socioéconomique énorme. Les cardiomyopathies, telles que HCM et DCM, sont des désordres primaires du muscle cardiaque et les causes principales de HF ont été associées à la morbidité et à la mortalité élevées. Il existe de nombreuses causes de HF, y compris les effets environnementaux, tels que les infections et l’exposition aux toxines ou à certainsmédicaments 8. La HF peut également être causée par une prédisposition génétique, à savoir les mutations9. On croit que les changements dans la composition génétique qui affectent les molécules, les intégines ou les protéines cytosquelettiques de matrice extracellulaire (ECM) pourraient être responsables de la mécanosensation altérée et de divers types de maladiecardiaque 10.
La caractéristique principale de HCM est hypertrophie inexpliquée du ventriculegauche 11,et parfois du ventricule droit12,et ceci se présente fréquemment avec la participation prédominante du septum intertriculaire. HCM est également caractérisé par le dysfonctionnement diastolique et le désarroi de myocyte et lafibrose 13. Dans la plupart des cas, l’appareil contractile du coeur est affecté par des mutations dans les protéines sarcomeric, menant à la contractilité accrue des myocytes14. En revanche, DCM est caractérisé par la dilatation d’un, ou les deux, ventricules et a une étiologie familiale dans 30% à 50% des cas15. DCM affecte un large éventail de fonctions cellulaires, menant à la contraction altérée des myocytes, à la mort cellulaire et à la réparation fibrotique16.
La génétique a montré que certains types de mutations forcent les MC uniques à adopter des caractéristiques de forme spécifiques pendant hcm3, à savoir les cellules de forme carrée avec une longueur: largeur AR qui est presque égale à 1:14 (AR1). Il en va de même pour le DCM, avec des cellules allongées avec un AR qui est presque égal à 11:1 (AR11). De plus, la HF peut être causée par une augmentation de la charge après chargement (p. ex., dans l’hypertension). Dans ces cas, les exigences hémodynamiques obligent les MC à prendre des formes carrées, selon la loi de Laplace, et l’AR passe de 7:15 (AR7) à 1:16,7. Hf peut également être causée par une augmentation du préchargement (par exemple, dans des conditions qui conduisent à une surcharge de volume). Lorsque cela se produit, les contraintes biophysiques forcent les MC à s’allonger et l’AR passe de 7:1 à 11:1.
L’activité de signalisation aux membranes dépend des paramètres mondiaux de géométrie cellulaire, tels que l’AR cellulaire, la taille, la surface de la membrane et la courbure membranaire18. Quand les MC néonatals de rat ont été plaqués sur des substrats qui ont été modelés pour limiter les cellules dans une longueur spécifique : AR de largeur, ils ont démontré la meilleure fonction contractile quand les rapports étaient semblables aux cellules dans un coeur adulte sain. En revanche, ils ont mal performé quand les rapports étaient semblables à ceux des myocytes dans les coeurs défaillants19. Dans les premiers stades de l’hypertrophie, les cellules deviennent plus larges, comme en témoigne une augmentation de la zone transversale. Hf se produit dans les derniers stades de l’hypertrophie et les cellules semblent généralement allongées. Par conséquent, il n’est pas surprenant que les modèles in vivo de rat de l’hypertrophie chronique aient rapporté une augmentation de la longueur ventriculaire gauche de myocyte d’environ 30%20,mais les MC adultes du modèle transgénique de souris qui ont été aiguëment traités avec des stimulus hypertrophiques in vitro ont démontré des augmentations semblables de largeur cellulaireau lieu 21.
Le séquençage de l’ARN à cellules individuelles, qui permet une analyse précise du transcriptome des cellules individuelles, révolutionne actuellement la compréhension de la biologie cellulaire. Cette technologie était la méthode préférée lorsqu’il s’agissait de répondre à la question de savoir comment les formes cellulaires individuelles affectaient l’expression des gènes. Nous avons comparé des cellules individuelles avec différentes formes, en particulier avec des AR de 1:1, 7:1 ou 11:1. Ceci a été fait en ensemencant les MC ventriculaires néonatals de rat sur une puce spécialement conçue remplie des micropatterns fibronectin-enduits2 avec les ARs définis de 1:1, 7:1 ou 11:1. Les micropatternes ont été fabriqués à l’aide de la technologie de photolithographie. Les micropatterns ont été enduits par la fibronectine, entourées par la surface cytophobe. Par conséquent, les MC fixent, propagent et capturent l’AR défini des micropatrins en se cultivant uniquement sur le substrat de fibronectine, tout en évitant la zone cytophobe. Les micropatternes ne sont pas dans un format bien formé. Au lieu de cela, le niveau de fibronectine est exactement à la même hauteur de la zone cytophobe environnante. Ceci a fourni des conditions semblables aux cellules croissantes dans une boîte de Petri, car il n’y a aucun effort des murs environnants. En outre, la surface des micropatrins avec différents AR sont égaux.
Il y avait deux aspects particulièrement importants de la conception expérimentale, qui ont mené à l’utilisation du séquençage d’ARN unicelliste au lieu du séquençage en vrac d’ARN. Premièrement, seuls quelques pourcentages des micropatrins peuvent être occupés par une seule cellule. Deuxièmement, parfois, une seule cellule n’occupe pas entièrement la surface du micropatrin. Les cellules individuelles qui recouvrent complètement une surface micropatreuse doivent être cueillies pour l’analyse de l’ARN unicellule. Étant donné que seul un sous-groupe de cellules plaquées sur une puce satisfaisait aux deux critères, il n’était pas possible de simplement trypsiniser la puce entière et de recueillir toutes les cellules pour le séquençage en vrac de l’ARN. Les cellules qualifiées devaient être cueillies individuellement à l’aide d’un cueilleur de cellules semi-automatisé.
On ne sait pas encore si la forme du CM, en soi, a un impact intrafonctionnel sur le syncytium myocardique. L’objectif principal des méthodes proposées dans cet article était de développer une nouvelle plate-forme pour étudier si la forme cellulaire en soi avait un impact sur le transcriptome17. Bien que les études in vitro soient différentes des études in vivo, le but de cette étude était d’étudier l’effet des différentes formes cellulaires sur l’expression des gènes, en gardant à l’esprit que la comparaison des cellules avec différentes formes in vivo est extrêmement exigeante. Ces expériences ont été inspirées par Kuo et coll.19, qui ont utilisé une approche similaire et ont signalé qu’elles observaient des changements dans les paramètres physiologiques en raison de changements dans la forme des cellules.
Cette étude a utilisé le séquençage de l’ARN à cellules simples, qui est une technologie nouvelle et puissante qui peut détecter le transcriptome des cellules individuelles. Il a été combiné avec une approche novatrice de la culture des MC unique, de sorte qu’ils ont pris différents ARs qui, autrement, n’auraient pu être observés in vivo.
L’étude avait certaines limites. Par exemple, les MC néonatals ont dû être utilisés pour générer différents morphotypes, car il est exceptionnellement difficile de culture suffisamment vitale mc adultes pendant 72 heures dans des formes définies. En outre, les MC ont été cultivés pendant 72 heures ex vivo, ce qui aurait pu avoir un impact sur le modèle d’expression des gènes. Cependant, cette culture était nécessaire, de sorte que les cellules puissent former des morphotypes spécifiques. En outre, seules les cellules simples qui ont été mononucléées et entièrement couvert le micropattern fibronectine ont été sélectionnés pour le tri. Les cellules à motifs sur chaque puce doivent être triées simplement en un seul tour de tri. Enfin, environ 50 cellules, soit environ un tiers des cellules sélectionnées, ont été captées avec succès à partir de chaque puce. Il y a deux raisons qui ont limité le nombre de cellules choisies avec succès. Tout d’abord, certaines cellules étaient trop étroitement attachées au modèle de fibronectine et le flux de ramassage n’était pas assez forcé pour réussir à les ramasser. Deuxièmement, en raison du traitement à la trypsine, l’attachement entre certaines cellules et la fibronectine est devenu trop lâche. Par conséquent, ces cellules ont été repoussées loin de leurs micropatterns de fibronectine, quand le microcapillaire s’est approché d’eux, et elles n’ont pas été ramassées. Les auteurs ne prétendent pas que cette configuration est la même qu’un environnement in vivo, mais il s’est avéré être une approche viable pour répondre à la question de recherche.
La méthode proposée s’applique aux différents types de cellules (p. ex., pour les mcs hiPS). Toutefois, les facteurs suivants devraient être optimisés pour étudier d’autres types de cellules. Des molécules adhésives ECM appropriées pour l’attachement du type cellulaire spécifique doivent être utilisées pour enduire les micropatrins. La géométrie des micropatrins doit être modifiée en fonction de la question de l’étude et du type cellulaire. La période de culture peut être modifiée en fonction de la question de l’étude. Le réaccente de détachement et son temps d’incubation doivent être optimisés précisément pour le type de cellule d’étude. Par exemple, Accutase peut être utilisé au lieu de TryplE pour le détachement de cellules souches embryonnaires et neuronales. Les paramètres de temps d’ouverture des valves doivent être scrutés à la loupe pour choisir les cellules avec succès, mais doucement. En résumé, nous avons conçu une nouvelle plate-forme pour étudier la forme cellulaire qui peut fournir une ressource précieuse pour les chercheurs dans le domaine. Dans ce contexte, nous avons conçu une approche expérimentale qui imitait les formes caractéristiques in vitro imposées au CM in vivo par des contraintes hémodynamiques pour identifier l’interaction entre l’architecture cellulaire et l’expression génique. Nous rapportons également le développement d’une nouvelle plate-forme pour étudier hf in vitro et l’identification de la forme cellulaire comme un déterminant puissant de l’expression des gènes. Il s’agit d’une nouvelle observation qui a des implications profondes pour la biologie et la médecine.
The authors have nothing to disclose.
Aucun.
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |