이 논문은 다른 병리를 나타내는 다양한 모양의 심장 심근세포를 성장시키고 단일 세포 수준에서 자신의 형태에 따라 이러한 부착 된 심장 심근세포를 분류하는 방법을 제시합니다. 제안 된 플랫폼은 심부전의 다른 모형을 위한 높은 처리량 및 약 검열에 새로운 접근을 제공합니다.
심장 비대의 다른 모형은 CM 형태에 있는 변경과 더불어 심장 심근세포 (CMs)의 증가한 부피와 연관되었습니다. 유전자 발현에 대한 세포 부피의 효과는 잘 알려져 있지만 세포 모양의 효과는 잘 이해되지 않습니다. 이 논문은 CM 형태가 유전자 발현에 미치는 영향을 체계적으로 분석하도록 설계된 방법을 설명합니다. 그것은 다음 단세포 mRNA 시퀀싱 다음에 새로운 단세포 트래핑 전략의 개발을 자세히 설명합니다. 마이크로패턴 칩은 3000개의 직사각형 모양의 섬유네틴 마이크로패턴을 포함하는 설계되었습니다. 이를 통해 다양한 유형의 심부전(HF)에 해당하는 뚜렷한 길이:너비 종횡비(AR)로 CM을 늘릴 수 있습니다. 이 논문은 또한 반자동 마이크로 파이펫 팅 셀 피커를 사용하여 패턴에서 단일 셀을 픽업하고 개별적으로 별도의 용해 버퍼에 주입하도록 설계된 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 단일 심용의 전사체를 정의된 기하학적 형태형으로 프로파일롬을 프로파일레이션하고 비대성 심근병증(HCM) 또는 증액/동심 대 엽전증(DCM) 또는 전하/편이의 범위에 따라 이를 특성화할 수 있게 되었습니다. 요약하자면, 이 백서는 서로 다른 형상을 가진 CM을 성장시키는 방법을 제시하며, 이는 서로 다른 병리를 나타내고, 단일 셀 수준에서 그들의 형태에 따라 이러한 부착된 CM을 분류합니다. 제안된 플랫폼은 HF의 다른 모형을 위한 높은 처리량 및 약 검열에 새로운 접근을 제공합니다.
세계 보건 기구에 따르면, 심장 혈관 질병 (CVD) 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인. CVD는 사람들의 삶의 질에 극적으로 영향을 미치고 사회 경제적 영향을 미칩니다. HCM과 DCM과 같은 심근병증은 심장 근육의 1 차적인 무질서이고 HF의 주요 원인은 높은 이환율 및 사망과 연관되었습니다. 감염 및 독소 또는 특정 약물에 노출과 같은 환경 효과를 포함한 HF의 많은 원인이 있습니다8. HF는 또한 유전 적 소인, 즉 돌연변이9에의해 발생할 수 있습니다. 세포외 매트릭스 (ECM) 분자, 통합 또는 시토 셀레탈 단백질에 영향을 미치는 유전 구성의 변화가 손상된 메카노센감각 및 다양한 유형의 심장질환(10)에대한 책임이 있다고 믿어진다.
HCM의 주요 특징은 좌심실(11)과 때로는 오른쪽심실(12)의설명할 수 없는 비대이며, 이것은 종종 심실 중격의 지배적인 관여를 제공합니다. HCM은 또한 확장기 기능 장애 및 근세포 혼란 및섬유증(13)을특징으로 한다. 대부분의 경우, 심장의 수축 장치는 육종 단백질의 돌연변이에 의해 영향을 받아 심근세포(14)의수축도 증가한다. 대조적으로, DCM은 1개, 또는 둘 다, 심실의 팽창을 특징으로하며, 15의케이스의 30%에서 50%에 가족 병인학을 갖는다. DCM은 근구세포의 수축, 세포사멸 및 섬유성수리(16)의수축을 초래하는 광범위한 세포 기능에 영향을 미친다.
유전학은 특정 유형의 돌연변이가 HCM3,즉 길이가 있는 사각형 모양의 세포 인 1:14 (AR1)에서 특정 형상 특성을 채택하도록 단일 CM을 강제하는 것으로 나타났습니다. 11:1(AR11)과 거의 동일한 AR을 가진 길쭉한 세포가 있는 DCM도 마찬가지입니다. 또한, HF는 증가된 후부하(예를 들어, 고혈압)에 의해 야기될 수 있다. 이러한 경우, 혈역학적 요구는 LAplace의 법칙에 따라 CM이 사각형 모양에 걸릴 강제로, AR은 7:15 (AR7)에서 1:16,7로변경됩니다. HF는 또한 프리로드의 증가(예: 부피 과부하로 이어지는 조건)에 의해 발생할 수 있습니다. 이 경우 생물학적 제약으로 인해 CM이 길게 변하고 AR이 7:1에서 11:1로 변경됩니다.
멤브레인의 시그널링 활동은 세포 AR, 크기, 멤브레인 표면적 및 멤브레인곡률(18)과같은 글로벌 세포 형상 파라미터에 의존한다. 신생아 쥐 CM이 특정 길이에서 세포를 제한하기 위해 패턴이 된 기판에 도금되었을 때: 너비 AR, 그들은 비율이 건강한 성인 심장의 세포와 유사할 때 최고의 수축 기능을 입증하였다. 대조적으로, 그 비율은 실패한 심근세포의 것과 유사할 때 제대로 수행되지 않았습니다19. 비대의 초기 단계에서, 세포는 단면 영역의 증가에 의해 반영된 바와 같이, 넓어집니다. HF는 비대증의 후반 단계에서 발생하며 세포는 전형적으로 길쭉한 것으로 나타난다. 따라서, 만성 비대의 생체내 쥐 모델에서 좌심실 심낭 길이의 증가를 약 30%20%증가보고한 것은 놀라운 일이 아니지만, 시험관내에서 비대성 자극으로 급성으로 치료된 형질전환 마우스 모델의 성인 CM은대신세포 폭이 유사한 증가를 보였다.
단일 세포의 전사체의 정밀한 분석을 허용하는 단세포 RNA 염기서열 분석은 현재 세포 생물학의 이해를 혁신하고 있습니다. 이 기술은 개별 세포 모양이 유전자 발현에 어떻게 영향을 미쳤는지에 대한 질문에 대답할 때 바람직한 방법이었습니다. 우리는 다른 모양의 단일 세포를 비교, 특히 1:1, 7:1 또는 11:1의 AR. 이것은 1:1, 7:1 또는 11:1의 정의된 AR을 가진 fibronectin 코팅 된 마이크로 패턴2로 채워진 특별히 설계된 칩에 신생아 쥐 심실 CM을 파종하여 수행되었습니다. 마이크로 패턴은 포토리소그래피 기술을 사용하여 제작되었습니다. 마이크로 패턴은 섬유 네틴에 의해 코팅되었다, 사이토 포빅 표면에 둘러싸여. 따라서, CM은 섬유넥틴 기판에서만 성장함으로써 마이크로패턴의 정의된 AR을 부착, 확산 및 캡처하는 동시에 세포공포증 부위를 피한다. 마이크로 패턴은 모양이 잘 된 형식이 아닙니다. 대신, fibronectin 수준은 주변 세포 공포증 영역의 동일한 높이에 정확 하 게. 이것은 주변 벽에서 아무 스트레스가 없기 때문에 Petri 접시에 있는 성장 세포에 유사한 조건을 제공했습니다. 또한, 다른 AR을 가진 마이크로 패턴의 표면적은 동일합니다.
실험 설계의 두 가지 특히 중요한 측면이 있었다, 이는 대량 RNA 시퀀싱 대신 단세포 RNA 시퀀싱의 사용을 주도. 첫째, 마이크로패턴의 몇 퍼센트만 단일 셀에 의해 점유될 수 있다. 둘째, 때로는 단일 셀이 마이크로패턴 표면을 완전히 차지하지 못하는 경우가 있습니다. 마이크로패턴 표면을 완전히 덮는 단일 세포는 단세포 RNA 분석을 위해 선택해야 합니다. 칩에 도금 된 세포의 하위 그룹만이 두 기준을 모두 만족시키기 때문에, 단순히 전체 칩을 트립시닝하고 대량 RNA 시퀀싱을 위해 모든 세포를 수집하는 것이 가능하지 않았다. 자격을 갖춘 세포는 반자동 셀 피커를 사용하여 개별적으로 선택되어야 했습니다.
CM 형상이 심근 싱크리티움에 기능적 영향을 미치는지 여부는 현재 알려지지 않았습니다. 이 논문에서 제안된 방법의 주요 목적은 세포 모양이전사17에영향을 미쳤는지 여부를 연구하는 새로운 플랫폼을 개발하는 것이었습니다. 시험관 내 연구는 생체 내 연구에서 다르지만, 이 연구의 목적은 유전자 발현에 대한 다른 세포 모양의 효과를 조사하는 것이었고, 생체 내의 다른 모양과 세포를 비교하는 것은 매우 까다롭다는 것을 염두에 두는 것이었습니다. 이 실험은 Kuo 외19에서영감을 받았으며, 이들은 비슷한 접근법을 사용하고 세포 모양의 변화로 인해 생리적 매개 변수의 변화를 관찰했다고 보고했습니다.
이 연구는 단일 세포의 전사를 검출할 수 있는 참신하고 강력한 기술인 단세포 RNA 시퀀싱을 사용했습니다. 단일 CM을 배양하는 혁신적인 접근 방식과 결합되어 다른 AM을 채택하여 생체 내에서만 관찰할 수 있었습니다.
연구 결과는 몇몇 한계가 있었습니다. 예를 들어, 신생아 심산기 는 정의된 모양에서 72시간 동안 충분히 중요한 성인 CM을 배양하는 것이 매우 어렵기 때문에 다른 형태를 생성하는 데 사용해야 했습니다. 더욱이, CM은 유전자 발현 패턴에 영향을 미쳤을 지도 모르다 72 시간 ex vivo를 위해 배양되었습니다. 그러나, 세포가 특정 형태형을 형성할 수 있도록 이 배분이 필요했습니다. 더욱이, 단핵및 완전히 커버된 단일 세포만이 분류를 위해 선택되었다. 각 칩의 패턴 셀은 한 라운드의 정렬에서만 정렬되어야 합니다. 마지막으로, 선택된 세포의 약 1/3인 약 50개의 세포가 각 칩에서 성공적으로 포착되었다. 성공적으로 선택된 셀의 수를 제한하는 데는 두 가지 이유가 있습니다. 첫째, 일부 세포는 fibronectin 패턴에 너무 단단히 부착되었고 픽업 흐름은 성공적으로 그들을 데리러 충분히 강제되지 않았습니다. 둘째, 트립신 치료로 인해 일부 세포와 섬유네틴 사이의 부착이 너무 느슨해졌습니다. 결과적으로, 이 세포는 그들의 fibronectin micro패턴에서 멀리 밀려났습니다, microcapillary가 그(것)들에 접근할 때, 그리고 그(것)들은 포착되지 않았습니다. 저자는이 설정이 생체 내 환경과 동일하다고 주장하지 않지만 연구 질문에 대답하는 실행 가능한 접근 법으로 입증되었습니다.
제안된 방법은 다른 세포 유형(예: hiPS-CM)에 적용됩니다. 그러나, 다음 요인은 그밖 세포 모형을 공부하기 위하여 최적화되어야 합니다. 특정 세포 유형의 부착을 위한 적합한 ECM 접착제 분자는 마이크로 패턴을 코팅하기 위해 사용되어야 한다. 마이크로 패턴의 형상은 연구 질문 및 세포 유형에 따라 수정되어야합니다. 배양 기간은 연구 질문에 따라 수정될 수 있습니다. 분리 시약및 배양 시간은 연구 세포 유형에 대해 정확하게 최적화되어야 합니다. 예를 들어, Accutase 배아와 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 TryplE 대신 사용할 수 있습니다. 밸브의 오프닝 시간 매개 변수는 성공적으로 셀을 선택하지만 부드럽게 면밀히 조사해야합니다. 요약하자면, 우리는 현장에서 연구자에게 귀중한 자원을 제공할 수 있는 세포 모양을 연구하기 위한 새로운 플랫폼을 설계했습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 세포 구조와 유전자 발현 사이의 상호 작용을 식별하기 위해 혈역학적 제약에 의해 생체 내 CM에 부과된 체외 특성 모양을 모방한 실험적 접근법을 설계했습니다. 우리는 또한 유전자 발현의 강력한 결정자로 체외에서 HF를 연구하고 세포 모양의 식별을 연구하는 새로운 플랫폼의 개발을 보고합니다. 이것은 생물학과 의학을 위한 광범위한 연루를 가진 새로운 관측입니다.
The authors have nothing to disclose.
없음.
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |