Summary
이 논문은 다른 병리를 나타내는 다양한 모양의 심장 심근세포를 성장시키고 단일 세포 수준에서 자신의 형태에 따라 이러한 부착 된 심장 심근세포를 분류하는 방법을 제시합니다. 제안 된 플랫폼은 심부전의 다른 모형을 위한 높은 처리량 및 약 검열에 새로운 접근을 제공합니다.
Abstract
심장 비대의 다른 모형은 CM 형태에 있는 변경과 더불어 심장 심근세포 (CMs)의 증가한 부피와 연관되었습니다. 유전자 발현에 대한 세포 부피의 효과는 잘 알려져 있지만 세포 모양의 효과는 잘 이해되지 않습니다. 이 논문은 CM 형태가 유전자 발현에 미치는 영향을 체계적으로 분석하도록 설계된 방법을 설명합니다. 그것은 다음 단세포 mRNA 시퀀싱 다음에 새로운 단세포 트래핑 전략의 개발을 자세히 설명합니다. 마이크로패턴 칩은 3000개의 직사각형 모양의 섬유네틴 마이크로패턴을 포함하는 설계되었습니다. 이를 통해 다양한 유형의 심부전(HF)에 해당하는 뚜렷한 길이:너비 종횡비(AR)로 CM을 늘릴 수 있습니다. 이 논문은 또한 반자동 마이크로 파이펫 팅 셀 피커를 사용하여 패턴에서 단일 셀을 픽업하고 개별적으로 별도의 용해 버퍼에 주입하도록 설계된 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 단일 심용의 전사체를 정의된 기하학적 형태형으로 프로파일롬을 프로파일레이션하고 비대성 심근병증(HCM) 또는 증액/동심 대 엽전증(DCM) 또는 전하/편이의 범위에 따라 이를 특성화할 수 있게 되었습니다. 요약하자면, 이 백서는 서로 다른 형상을 가진 CM을 성장시키는 방법을 제시하며, 이는 서로 다른 병리를 나타내고, 단일 셀 수준에서 그들의 형태에 따라 이러한 부착된 CM을 분류합니다. 제안된 플랫폼은 HF의 다른 모형을 위한 높은 처리량 및 약 검열에 새로운 접근을 제공합니다.
Introduction
세계 보건 기구에 따르면, 심장 혈관 질병 (CVD) 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인. CVD는 사람들의 삶의 질에 극적으로 영향을 미치고 사회 경제적 영향을 미칩니다. HCM과 DCM과 같은 심근병증은 심장 근육의 1 차적인 무질서이고 HF의 주요 원인은 높은 이환율 및 사망과 연관되었습니다. 감염 및 독소 또는 특정 약물에 노출과 같은 환경 효과를 포함한 HF의 많은 원인이 있습니다8. HF는 또한 유전 적 소인, 즉 돌연변이9에의해 발생할 수 있습니다. 세포외 매트릭스 (ECM) 분자, 통합 또는 시토 셀레탈 단백질에 영향을 미치는 유전 구성의 변화가 손상된 메카노센감각 및 다양한 유형의 심장질환(10)에대한 책임이 있다고 믿어진다.
HCM의 주요 특징은 좌심실(11)과 때로는 오른쪽심실(12)의설명할 수 없는 비대이며, 이것은 종종 심실 중격의 지배적인 관여를 제공합니다. HCM은 또한 확장기 기능 장애 및 근세포 혼란 및섬유증(13)을특징으로 한다. 대부분의 경우, 심장의 수축 장치는 육종 단백질의 돌연변이에 의해 영향을 받아 심근세포(14)의수축도 증가한다. 대조적으로, DCM은 1개, 또는 둘 다, 심실의 팽창을 특징으로하며, 15의케이스의 30%에서 50%에 가족 병인학을 갖는다. DCM은 근구세포의 수축, 세포사멸 및 섬유성수리(16)의수축을 초래하는 광범위한 세포 기능에 영향을 미친다.
유전학은 특정 유형의 돌연변이가 HCM3,즉 길이가 있는 사각형 모양의 세포 인 1:14 (AR1)에서 특정 형상 특성을 채택하도록 단일 CM을 강제하는 것으로 나타났습니다. 11:1(AR11)과 거의 동일한 AR을 가진 길쭉한 세포가 있는 DCM도 마찬가지입니다. 또한, HF는 증가된 후부하(예를 들어, 고혈압)에 의해 야기될 수 있다. 이러한 경우, 혈역학적 요구는 LAplace의 법칙에 따라 CM이 사각형 모양에 걸릴 강제로, AR은 7:15 (AR7)에서 1:16,7로변경됩니다. HF는 또한 프리로드의 증가(예: 부피 과부하로 이어지는 조건)에 의해 발생할 수 있습니다. 이 경우 생물학적 제약으로 인해 CM이 길게 변하고 AR이 7:1에서 11:1로 변경됩니다.
멤브레인의 시그널링 활동은 세포 AR, 크기, 멤브레인 표면적 및 멤브레인곡률(18)과같은 글로벌 세포 형상 파라미터에 의존한다. 신생아 쥐 CM이 특정 길이에서 세포를 제한하기 위해 패턴이 된 기판에 도금되었을 때: 너비 AR, 그들은 비율이 건강한 성인 심장의 세포와 유사할 때 최고의 수축 기능을 입증하였다. 대조적으로, 그 비율은 실패한 심근세포의 것과 유사할 때 제대로 수행되지 않았습니다19. 비대의 초기 단계에서, 세포는 단면 영역의 증가에 의해 반영된 바와 같이, 넓어집니다. HF는 비대증의 후반 단계에서 발생하며 세포는 전형적으로 길쭉한 것으로 나타난다. 따라서, 만성 비대의 생체내 쥐 모델에서 좌심실 심낭 길이의 증가를 약 30%20%증가보고한 것은 놀라운 일이 아니지만, 시험관내에서 비대성 자극으로 급성으로 치료된 형질전환 마우스 모델의 성인 CM은대신세포 폭이 유사한 증가를 보였다.
단일 세포의 전사체의 정밀한 분석을 허용하는 단세포 RNA 염기서열 분석은 현재 세포 생물학의 이해를 혁신하고 있습니다. 이 기술은 개별 세포 모양이 유전자 발현에 어떻게 영향을 미쳤는지에 대한 질문에 대답할 때 바람직한 방법이었습니다. 우리는 다른 모양의 단일 세포를 비교, 특히 1:1, 7:1 또는 11:1의 AR. 이것은 1:1, 7:1 또는 11:1의 정의된 AR을 가진 fibronectin 코팅 된 마이크로 패턴2로 채워진 특별히 설계된 칩에 신생아 쥐 심실 CM을 파종하여 수행되었습니다. 마이크로 패턴은 포토리소그래피 기술을 사용하여 제작되었습니다. 마이크로 패턴은 섬유 네틴에 의해 코팅되었다, 사이토 포빅 표면에 둘러싸여. 따라서, CM은 섬유넥틴 기판에서만 성장함으로써 마이크로패턴의 정의된 AR을 부착, 확산 및 캡처하는 동시에 세포공포증 부위를 피한다. 마이크로 패턴은 모양이 잘 된 형식이 아닙니다. 대신, fibronectin 수준은 주변 세포 공포증 영역의 동일한 높이에 정확 하 게. 이것은 주변 벽에서 아무 스트레스가 없기 때문에 Petri 접시에 있는 성장 세포에 유사한 조건을 제공했습니다. 또한, 다른 AR을 가진 마이크로 패턴의 표면적은 동일합니다.
실험 설계의 두 가지 특히 중요한 측면이 있었다, 이는 대량 RNA 시퀀싱 대신 단세포 RNA 시퀀싱의 사용을 주도. 첫째, 마이크로패턴의 몇 퍼센트만 단일 셀에 의해 점유될 수 있다. 둘째, 때로는 단일 셀이 마이크로패턴 표면을 완전히 차지하지 못하는 경우가 있습니다. 마이크로패턴 표면을 완전히 덮는 단일 세포는 단세포 RNA 분석을 위해 선택해야 합니다. 칩에 도금 된 세포의 하위 그룹만이 두 기준을 모두 만족시키기 때문에, 단순히 전체 칩을 트립시닝하고 대량 RNA 시퀀싱을 위해 모든 세포를 수집하는 것이 가능하지 않았다. 자격을 갖춘 세포는 반자동 셀 피커를 사용하여 개별적으로 선택되어야 했습니다.
CM 형상이 심근 싱크리티움에 기능적 영향을 미치는지 여부는 현재 알려지지 않았습니다. 이 논문에서 제안된 방법의 주요 목적은 세포 모양이전사17에영향을 미쳤는지 여부를 연구하는 새로운 플랫폼을 개발하는 것이었습니다. 시험관 내 연구는 생체 내 연구에서 다르지만, 이 연구의 목적은 유전자 발현에 대한 다른 세포 모양의 효과를 조사하는 것이었고, 생체 내의 다른 모양과 세포를 비교하는 것은 매우 까다롭다는 것을 염두에 두는 것이었습니다. 이 실험은 Kuo 외19에서영감을 받았으며, 이들은 비슷한 접근법을 사용하고 세포 모양의 변화로 인해 생리적 매개 변수의 변화를 관찰했다고 보고했습니다.
Protocol
동물과 관련된 모든 절차는 스웨덴 스톡홀름의 카롤린스카 연구소의 동물 윤리위원회의 규정에 따라 발생했습니다.
1. 마이크로 패턴 칩 레이아웃
- 맞춤형칩(재료표)(그림1A):19.5mm x 19.5mm 커버슬립을 활성 마이크로패턴으로 사용하며, 보로실리케이트 유리의 포토리소그래피에 의해 인쇄됩니다.
참고: 이러한 미세 패턴은 세포 공포증 부위로 둘러싸여 있습니다. 따라서 시드 셀은 이러한 미세 패턴 중 하나에서만 부착하고 성장하여 해당 마이크로패턴의 AR을 캡처할 수 있습니다. 칩은 세 개의 영역으로 나뉘며 각 영역은 특정 AR을 사용하는 마이크로 패턴으로 구성됩니다. 칩 레이아웃은 그림 1B에표시됩니다. 정의된 ARs의 형상은 표 1에표시됩니다. 섬유넥틴 마이크로패턴의 상이한 형상의 확대형 형광 이미지는 도 1B의하부 이미지에 도시된다.
2. 코팅 마이크로 패턴 칩
- 인산염 완충식식염(PBS-/-)의 2mL에 80μg의 섬유네틴을 추가하여 각칩에 대해 2배 코팅 단백질 용액을 준비한다.
- 칩을 35mm 그리너 페트리 접시에 옮기고 즉시 PBS-/-2mL를 추가합니다. 그런 다음 2x 코팅 단백질 용액의 2mL를 추가합니다.
- 2 시간 동안 실온에서 칩을 배양하십시오.
- PBS-/-로연속 희석 단계로 코팅 용액을 세척한다. 칩 표면은 항상 젖어야 합니다. 이어서, PBS를 파종 세포까지 37°C에서 도금 배지 및 인큐베이션의 2mL로 교체한다.
3. CM 의 격리
- DMEM:M199(4:1)를 말 혈청 10%, 태아소 혈청 4%, HEPES(1M), 1% 페니실린/연쇄절제술(10,000 U/mL)22로보충하여 도금 매체를 준비한다.
- 2일 된 신생아 쥐 하트의 왼쪽 심실에서 조직을 해부하고 PBS를 포함하는 10cm 접시로 옮직다. 조직을 약 1mm3개로 자른다.
- 수확된 조직을 조직해리(재료표)에대한 캡에 로터를 장착한 로터 캡 튜브로 옮킨다. 조직이 정착한 다음 상체를 조심스럽게 제거하십시오.
- 효소 믹스 1 과 2의 혼합물2.5 mL을 첨가하고, 신생아 심혼 해리키트(재료 표)를사용하여 제조하여 C 튜브에 단단히 닫습니다.
- 히터(도 2 A 및 B)(재료표)가 장착된 소각기의 슬리브에 로터 캡튜브를삽입합니다. 인큐베이션 프로그램37C_mr_NHDK_1(그림 2C)를실행하여 약 1시간 동안 지속됩니다.
- 인큐베이션 프로그램이 실행되는 동안 PBS, pH 7.2에서 2mM EDTA 및 0.5% 소 세럼 알부민(BSA)을 포함하는 PEB 버퍼를 준비하고 4°C로 유지한다.
- 인큐베이션 프로그램의 종료 후 로터 캡튜브(도 2D)를분리하고 7.5mL의 사전 데운 도금 매체를 추가한다.
- 샘플을 다시 중단하고 70 μm 스트레이너를 사용하여 셀 서스펜션을 필터링합니다.
- 스트레이너를 도금 매체의 또 다른 3mL로 씻으세요.
- 5 분 동안 600 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 슈퍼 네티퍼를 완전히 흡인.
- 차가운 PEB 버퍼의 60 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 비 CM을 대상으로 미크론 크기의 구슬을 포함하는 신생아 심근 세포 절연 칵테일(재료의 표)의20 μL을 추가합니다.
- 적혈구 구슬20μL(재료표)를 추가합니다.
- 서스펜션을 혼합하고 4°C에서 15분 동안 인큐베이션을 합니다.
- PEB 버퍼 400 μL을 추가합니다.
- 자석 스탠드에 수직으로 삽입되어 PEB 버퍼로 잘 세척된 LD 컬럼(재료표)에셀 서스펜션을 적용합니다.
- 라벨이 없는 셀을 수집하고 PEB 버퍼0.5mL로 컬럼을 세척합니다.
- 도금 매체8mL을 추가하고 세포 현탁액을 75cm2 코팅되지 않은 배양 플라스크로 옮기고 37°C에서 1.5h로 배양한다. 나머지 비-CM은 코팅되지 않은 세포 배양을 고수하기 시작하고 세포 현탁액은 CM 인구에 의해 농축될 것이다.
4. 패턴 화 CM
참고: 단일 CM을 1:1, 7:1 또는 11:1의 AM과 비교했습니다. 이것은 1:1, 7:1 또는 11:1의 정의된 AR을 가진 fibronectin 코팅 된 마이크로 패턴으로 채워진 특별히 설계된 칩에 고립 된 신생아 쥐 CM을 시드하여 수행됩니다. 마이크로 패턴은 섬유 네틴에 의해 코팅되었다, 사이토 포빅 표면에 둘러싸여. 따라서, CM은 섬유넥틴 기판에서만 성장시킴으로써 마이크로패턴의 정의된 AR을 부착, 확산 및 포획한다. 다음 단계에 따라 격리된 CM을 패턴화합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 튜브로 옮기고, 세포를 계산하고 적절한 도금 매체를 추가하여 mL당 100,000세포의 농도로 희석한다.
- 칩에 셀 서스펜션 2mL를 추가하면 35mm Greiner Petri 접시 내부에 2mL의 따뜻한 도금 매체에 이미 침수되었습니다.
- 37°C에서 5%CO2로 접시를 배양하여 CM이 섬유네틴 코팅 마이크로패턴에 부착하고 각 CM이 기판 마이크로패턴의 AR을 획득할 수 있도록 합니다.
- 18h 후 칩을 확인합니다. 대부분의 세포가 부착된 경우 패턴 셀에 부착된 파편과 죽은 세포를 분리하고 제거합니다. 도금 매체를 제거하고 칩 의 중심에서 시작하여 측면을 향해 이동하여 PBS-/-dropwise를 부드럽게 추가하여이 작업을 수행하십시오. 2번 반복합니다.
- DMEM:M199(4:1)를 4% 말 세럼, 4% 태아 소 혈청, 2% HEPES(1M), 1%페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL)으로 보충하여 PBS를 신선한 유지 보수 매체로 흡인합니다.
5. 신봉성 CM 따기
참고: 72시간의 배양 기간 이후에, 패턴단일 심암술은 반자동 셀 피커(재료표)(도3)를이용하여 섬유네틴 마이크로패턴으로부터 수확된다. 셀 피커는소프트웨어(23)를 사용하여 전동스테이지(그림 3A)를제어한다. 70 μm 유리 미세 모세관(도 3B)은패턴 신생아 쥐 CM을 선택하고 주입하는 데 사용됩니다. 세포 피커는 진공을 생성하고 압력을 가하여 세포를 주입하여 부착 세포를 정렬합니다. 주사기 번호 1의 진공은 주사기펌프(도 3C)를사용하여 주사기를 당겨 가적용됩니다. 수압은 중력에 기초하고 현미경 책상 위에 87cm의 거리에 주사기 번호 2를 배치하여 유도된다. 주사기 1과 2는 각각 PTFE 튜브를 통해 제어부(도 3D)에내장된 밸브 1 과 2에 연결됩니다. PTFE 튜브는 RNase가 없는 물로 완전히 채워져 있습니다. 고른 단일 셀은 리시스 버퍼의 3.55 μL을 포함하는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 튜브에 주입된다.
- 72 시간의 배양 기간 후, 오래된 매체를 제거하고 부드럽게 따뜻한 DPBS와 칩 표면을 플러시-/-.
- 접시를 평평하게 유지하고 접시의 한쪽에서 1000 μL 파이펫으로 오래된 매체를 부드럽게 흡인하십시오. 칩이 항상 젖은 상태로 유지되는지 확인합니다.
- DPBS의 2mL를 추가-/- 부드럽게 드롭 와이즈 칩의 중심에서 시작하여 측면으로 이동, 패턴 된 세포에 부착 된 죽은 세포의 대부분을 분리.
- DPBS의 대부분을 흡인하여 칩의 중심에서 시작하여 측면으로 이동하여 가능한 한 많은 분리된 부동 셀을 제거합니다.
- 5.1.2 및 5.1.3 단계를 다시 한 번 반복합니다.
- 각진 집게를 사용하여 칩의 가장자리를 잡고 즉시 새로운 멸균 35mm Greiner Petri 접시로 전송하여 따기 동안 부동 셀의 수를 줄입니다.
- 칩이 건조하지 않도록 즉시 DPBS-/-의 1.5 mL를 추가합니다.
- 살아있는 세포의 핵을 시각화하기 위하여 활기찬 염료 주기 녹색의 1.5 μL를 추가합니다.
- 집게 의 끝을 사용하여 그리너 페트리 접시의 중앙에 칩을 배치합니다.
- 챔버(재료의 테이블)를칩 위에 놓습니다. 챔버는 셀 패턴에 대한 액세스를 차단하지 않고, 접시의 바닥에 칩을 고정합니다.
- Greiner Petri 접시를 셀 피커 스테이지의 접시 홀더에 장착하고 마그네틱 캡을 삽입합니다.
- 자동 주입을 교정합니다.
- 라이브 뷰 창에서 이미지 중간에 전동 스테이지에 새겨진 십자선을 찾습니다.
- 십자선에 집중하고 스캔 및 정렬 창에서 자동 주입 버튼에 대한 교정을 선택합니다.
- DPBS-/-를 DPBS/trypsin의 1.5mL로 교체 -/- 접시가 무대에 있는 동안-/- (1:1) 섬유네틴에서 세포를 풀어 유체 진공이 세포를 선택하는 데 사용될 수 있도록 한다.
- 스캔 및 정렬 창에서 스캐닝 탭을 사용하여 전체 칩을 스캔합니다. 시야에서 칩의 왼쪽 상단 모서리를 찾아 왼쪽 상단 모서리 열의 현재 현미경 위치 받기를 클릭합니다.
- 그런 다음 전동 스테이지를 칩의 오른쪽 하단 모서리로 이동합니다. 현미경에 초점을 맞추고 오른쪽 하단 모서리 행에서 현재 현미경 위치를 가져옵니다 클릭합니다.
- 가장 날카로운 평면 설정 버튼을 클릭하고 팝업 창에서 오른쪽 상단 모서리로 이동을 클릭합니다. 현미경에 초점을 맞추고 왼쪽 하단 모서리로 이동을 클릭하고 초점을 설정합니다. 완료되면 완료 버튼을 클릭하고 스캔을 시작합니다.
- 스캔이 종료되면 분석 탭으로 이동하여 학습 기준을 통과하는 단일 셀을 선택합니다.
- 유리 미세 모세관이 현미경의 라이브 보기의 중간에 있는지 확인하십시오.
- 소프트웨어의 펌프 창을 사용하여 주사기 펌프를 제어합니다. 직경 27mm의 50mL 넘버 1 주사기에서 4mL를 인출하여 진공을 만듭니다.
- 정렬 탭에서
- 밸브의 사출 매개변수를 설정합니다. 고른 단일 셀을 전달한 사출 부피는 1 μl이고, 밸브 2가 120밀리초 동안 개봉한 다음 밸브 1을 200밀리초 동안 연 후 200밀리초 의 시간 경과 후 밀리초가 되었다고 계산되었다. 튜브의 탄력으로 인해, 오픈 밸브 1은 흐름을 주입 중지합니다.
- 밸브의 픽업 매개 변수를 설정합니다. 밸브 1이 20밀리초 동안 개봉한 다음 밸브 2가 10밀리초 동안 열리면 10밀리초의 경과 후 대부분의 패턴 셀을 픽업할 수 있다고 계산하였다. 이것은 그들의 fibronectin 바인딩 트립신에 의해 처리 된 후 완화 되었기 때문이다.
- 경로 계산 단추를 클릭합니다. 이 소프트웨어는 셀에서 셀로 가장 빠른 경로를 계산하여 칩 전체에 선택한 셀을 픽업하고 주입합니다.
- 칩 표면에 패턴 셀에 현미경을 집중시합니다.
- 조이스틱을 사용하여 미세 카세필을 조심스럽게 움직여 미세 모세관 끝의 가장 선명한 이미지를 세포에 건드리지 않고 얻을 수 있도록하십시오.
- 마이크로피펫 오프셋 섹션에서 설정 단추를 클릭합니다. 마이크로모세필리 단면을 표시하여 새 창이 나타납니다. 모세관의 정확한 중심을 클릭합니다. 그런 다음 소프트웨어는 x, y 및 z 좌표에서 모세관의 팁 오프셋을 기록합니다.
- 시작 정렬 단추를 사용하여 정렬을 시작합니다.
Representative Results
조직은 2일 된 신생아 쥐 심장의 좌심실에서 해부되고 단일 세포로 나뉘었다. 그런 다음 농축 된 CM은 뚜렷한 AR을 가진 섬유 네틴 패턴을 포함하는 칩에 시드되었습니다. 배양 72시간 후, 배지는 DPBS에서 1:1000 의 생생한 염료 주기 녹색으로대체되었다-/-2분 동안 살아있는 세포의 핵을 시각화하였다. 다음으로, 세포는 세포 따기를 용이하게 하기 위해 유체 진공을 사용할 수 있도록, 섬유네틴으로부터 세포를 느슨하게하기 위해 DPBS-/-/trypsin(1:1)으로 처리되었다. 한편, 전체 칩은 세포 피커에 연결된 반전 된 현미경을 사용하여 10 배율로 스캔되었습니다. 이것은 세포가 트립신 처리 때문에 반올림되기 전에 수행되었습니다. 검증된 셀은 스캔된 이미지에 따라 선택되었으며, 좌표는 셀 피커 소프트웨어에 저장되었습니다. 마이크로패턴은 단핵단 세포를 포함하고 세포가 완전히 섬유네틴 마이크로패턴을 덮을 때만 선택되었다. 세포 선별기는 선택된 세포를 하나씩 하나씩 골랐고 성공적으로 수확된 각 단일 세포는 즉시 개별 PCR 튜브에 주입되어 현미경 단계에 배치되었다. 각 PCR 튜브에는 리시스 버퍼3.55μL(표 2)이포함되어 있습니다. 미디어 제거로 시작된 정렬 프로세스는 40분 이내에 완료되었습니다. 보완탈옥시리보핵산(cDNA) 합성, PCR 사전 증폭 및 정제는 스마트-세크2프로토콜(24)에 기초하여 리세드 단일 세포상에서 수행되었다(표3). 정제된 cDNA의 품질은 자동화된 전기전도 분석기에 의해 확인되었다. 선택된 단일 셀의 사전 증폭 된 cDNA의 전엽은 도 4에제시된다. RNA-Seq 라이브러리는 스마트-Seq2프로토콜(24)에따라 제조되었다.
패턴 CM의 사코메 구조를 관찰하기 위해 패턴 CM은 육종 α 액티닌 항체로 염색되었다. 세포는 당나귀 안티 마우스 IgG 알렉사 플루어 488 1:800 이차 염색을위한 실온에서 1 시간 동안 배양되었다. 핵은 1 μg/mL DAPI로 염색되었다. 면역형성 심은 63배 오일 침수(NA 1.4)목표(그림 5)를사용하여 반전된 공초점 현미경으로 획득하였다.
그림 1: 섬유네틴 마이크로패턴으로 칩의 레이아웃.
(A)맞춤 설계된 칩의 이미지. 칩은 19.5mm x 19.5mm 커버슬립으로 섬유네틴 마이크로패턴이 있으며, 보로실리케이트 유리에 포토리소그래피가 인쇄합니다. (B)칩 레이아웃. 칩은 3개의 영역으로 나뉘며 각 영역은 특정 AR을 가진 섬유네틴 마이크로패턴으로 구성됩니다. 이 수치는"보충 재료 1"에서수정되었습니다 하프바라라단 에스파하니 등2,http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ 에서 사용 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 히터 장치가 장착된 해리시어터.
(A)2일 된 신생아 쥐 좌심실의 완전 자동화된 해리에 사용되는 전체 해리기 기기. (B)가열 장치. (C)로터 캡 튜브. (D)조직 해리의 완전 자동화 된 워크플로우를위한 즉시 사용 프로그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 셀 피커 장치.
(A)셀 피커의 전동 단계의 확대보기. 페트리 접시 홀더와 10 개의 PCR 스트립을위한 80 홀과 교정 십자선구멍이 무대에 내장되어 있습니다. (B)유리 미세 모세관의 확대 보기. (C)주사기 펌프. (D)밸브 1과 2의 개폐 시간 창을 제어하는 제어 유닛이 제어 장치 내부에 장착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 1개의 고른 단세포의 사전 증폭된 cDNA의 전엽.
19개의 PCR 사이클의 사전 증폭은 1 ng/μL 정제 된 cDNA 수율의 15 μL을 얻기 위해 사용되었다. 겔과 같은 밀도 플롯의 명확한 밴드는 전동체의 1852 bp에서 피크에 해당하는 것으로 관찰된다. 조각의 평균 크기는 1588 bp입니다. 더욱이, 300 bp보다 짧은 소량의 단편은 좋은 cDNA 라이브러리를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 다른 ARs를 가진 패턴 CM의 α 액티닌 육종 구조 (녹색) 및 핵 (파란색)의 면역 형광 염색.
크로마틴은 DAPI에 의해 얼룩졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 형태형 | 아칸소 | 길이(μm) | 너비(μm) | 섬유네틴 영역(μm2) |
| AR1 | 1:1 | 47 | 47 | 2209 |
| AR7 | 7:1 | 126 | 18 | 2268 |
| AR11 | 11:1 | 155 | 14 | 2170 |
표 1: 패턴 이면된 CM의 형상입니다.
| 구성 요소 | 부피(μL) |
| 뉴클레아스 가 없는 물 | 0.65 |
| (0.4% vol/vol) 트리톤 X-100 | 1.8 |
| dNTP 믹스 (25mM) | 0.8 |
| RNase 억제제 (40 U μL-1) | 0.1 |
| 올리고 dT30VN 올리고뉴클레오티드 (100 μM) | 0.1 |
| ERCC RNA 스파이크 인 믹스 (2.5 x 105 희석) | 0.1 |
| 주입된 단하나 셀 | 1 |
| 총 볼륨 | 4.55 |
표 2: 단일 셀 사용자 지정 리시스 버퍼입니다.
| 구성 요소 | 부피(μL) |
| 슈퍼스크립트 II 첫 번째 가닥 버퍼(5배) | 2 |
| DTT (100mMM) | 0.5 |
| 베타인 (5M) | 2 |
| Mgcl2 (1 M) | 0.1 |
| RNase 억제제 (40 U μL-1) | 0.25 |
| 슈퍼스크립트 II 역전사 (200 U μL-1) | 0.5 |
| TSO (100 μM) | 0.1 |
| 총 볼륨 | 5.45 |
표 3: 단일 CM의 용액으로부터 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하기 위해 하나의 RT 반응에 대한 역전사(RT) 혼합.
Discussion
이 연구는 단일 세포의 전사를 검출할 수 있는 참신하고 강력한 기술인 단세포 RNA 시퀀싱을 사용했습니다. 단일 CM을 배양하는 혁신적인 접근 방식과 결합되어 다른 AM을 채택하여 생체 내에서만 관찰할 수 있었습니다.
연구 결과는 몇몇 한계가 있었습니다. 예를 들어, 신생아 심산기 는 정의된 모양에서 72시간 동안 충분히 중요한 성인 CM을 배양하는 것이 매우 어렵기 때문에 다른 형태를 생성하는 데 사용해야 했습니다. 더욱이, CM은 유전자 발현 패턴에 영향을 미쳤을 지도 모르다 72 시간 ex vivo를 위해 배양되었습니다. 그러나, 세포가 특정 형태형을 형성할 수 있도록 이 배분이 필요했습니다. 더욱이, 단핵및 완전히 커버된 단일 세포만이 분류를 위해 선택되었다. 각 칩의 패턴 셀은 한 라운드의 정렬에서만 정렬되어야 합니다. 마지막으로, 선택된 세포의 약 1/3인 약 50개의 세포가 각 칩에서 성공적으로 포착되었다. 성공적으로 선택된 셀의 수를 제한하는 데는 두 가지 이유가 있습니다. 첫째, 일부 세포는 fibronectin 패턴에 너무 단단히 부착되었고 픽업 흐름은 성공적으로 그들을 데리러 충분히 강제되지 않았습니다. 둘째, 트립신 치료로 인해 일부 세포와 섬유네틴 사이의 부착이 너무 느슨해졌습니다. 결과적으로, 이 세포는 그들의 fibronectin micro패턴에서 멀리 밀려났습니다, microcapillary가 그(것)들에 접근할 때, 그리고 그(것)들은 포착되지 않았습니다. 저자는이 설정이 생체 내 환경과 동일하다고 주장하지 않지만 연구 질문에 대답하는 실행 가능한 접근 법으로 입증되었습니다.
제안된 방법은 다른 세포 유형(예: hiPS-CM)에 적용됩니다. 그러나, 다음 요인은 그밖 세포 모형을 공부하기 위하여 최적화되어야 합니다. 특정 세포 유형의 부착을 위한 적합한 ECM 접착제 분자는 마이크로 패턴을 코팅하기 위해 사용되어야 한다. 마이크로 패턴의 형상은 연구 질문 및 세포 유형에 따라 수정되어야합니다. 배양 기간은 연구 질문에 따라 수정될 수 있습니다. 분리 시약및 배양 시간은 연구 세포 유형에 대해 정확하게 최적화되어야 합니다. 예를 들어, Accutase 배아와 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 TryplE 대신 사용할 수 있습니다. 밸브의 오프닝 시간 매개 변수는 성공적으로 셀을 선택하지만 부드럽게 면밀히 조사해야합니다. 요약하자면, 우리는 현장에서 연구자에게 귀중한 자원을 제공할 수 있는 세포 모양을 연구하기 위한 새로운 플랫폼을 설계했습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 세포 구조와 유전자 발현 사이의 상호 작용을 식별하기 위해 혈역학적 제약에 의해 생체 내 CM에 부과된 체외 특성 모양을 모방한 실험적 접근법을 설계했습니다. 우리는 또한 유전자 발현의 강력한 결정자로 체외에서 HF를 연구하고 세포 모양의 식별을 연구하는 새로운 플랫폼의 개발을 보고합니다. 이것은 생물학과 의학을 위한 광범위한 연루를 가진 새로운 관측입니다.
Disclosures
없음.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
| Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
| Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
| Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
| CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
| CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
| CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
| dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
| DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
| Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
| LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
| NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
| Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
| Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
| RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
| sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
| SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
| Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
| TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
| Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |
References
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