Dette papiret presenterer metoder for å dyrke hjerte myocytter med forskjellige former, som representerer forskjellige patologier, og sortering av disse tilslutningshjerte myocytter basert på deres morfologi på en enkelt cellenivå. Den foreslåtte plattformen gir en ny tilnærming til høy gjennomstrømning og narkotikascreening for ulike typer hjertesvikt.
Ulike typer hjertehypertrofi har vært forbundet med økt volum av hjerte myocytter (CMs), sammen med endringer i CM morfologi. Selv om effekten av cellevolum på genuttrykk er velkjente, er effekten av celleform ikke godt forstått. Dette papiret beskriver en metode som er utformet for systematisk å analysere effekten av CM morfologi på genuttrykk. Den beskriver utviklingen av en ny encellede fangststrategi som deretter etterfølges av encellede mRNA-sekvensering. En mikropatterned chip er også designet, som inneholder 3000 rektangulære formede fibronectin mikrofiltre. Dette gjør det mulig å vokse CMs i distinkt lengde: bredde sideforhold (AR), tilsvarende ulike typer hjertesvikt (HF). Papiret beskriver også en protokoll som er utformet for å plukke opp enkeltceller fra deres mønster, ved hjelp av en halvautomatisk mikropipetteringscellevelker, og individuelt injisere dem i en egen lysisbuffer. Dette har gjort det mulig å profilere transkripsjonsomene til enkelt-CMs med definerte geometriske morfotyper og karakterisere dem i henhold til en rekke normale eller patologiske forhold: hypertrofisk kardiomyopati (HCM) eller etterbelastning / konsentrisk versus dilatert kardiomyopati (DCM) eller preload / eksentrisk. Oppsummert presenterer dette papiret metoder for å dyrke CMs med forskjellige former, som representerer forskjellige patologier, og sortering av disse tilslutnings-CMs basert på deres morfologi på encellet nivå. Den foreslåtte plattformen gir en ny tilnærming til høy gjennomstrømning og narkotikascreening for ulike typer HF.
Ifølge Verdens helseorganisasjon er kardiovaskulær sykdom (CVD) en viktig årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. CVD påvirker dramatisk kvaliteten på folks liv og har en stor sosioøkonomisk innvirkning. Kardiomyopatier, som HCM og DCM, er primære lidelser i hjertemuskelen og hovedårsakene til HF har vært forbundet med høy sykelighet og dødelighet. Det er mange årsaker til HF, inkludert miljøeffekter, som infeksjoner og eksponering for giftstoffer eller visse legemidler8. HF kan også være forårsaket av genetisk predisposisjon, nemlig mutasjoner9. Det antas at endringene i genetisk sammensetning som påvirker ekstracellulærmatrisemolekyler (ECM), integriner eller cytoskeletale proteiner kan være ansvarlige for nedsatt mekanensasjon og ulike typer hjertesykdom10.
Hovedtrekket i HCM er uforklarlig hypertrofi av venstre ventrikkel11, og noen ganger av høyre ventrikkel12, og dette presenterer ofte med dominerende involvering av interventricular septum. HCM er også preget av diastolisk dysfunksjon og myocyte disarray og fibrose13. I de fleste tilfeller påvirkes hjertets kontraktile apparat av mutasjoner i sarkomeriske proteiner, noe som fører til økt kontraktilitet av myocytter14. I motsetning er DCM preget av dilatasjon av en, eller begge, ventrikler og har en familiær etiologi i 30% til 50% avtilfellene 15. DCM påvirker et bredt spekter av cellulære funksjoner, noe som fører til nedsatt sammentrekning av myocytter, celledød og fibrotisk reparasjon16.
Genetikk har vist at visse typer mutasjoner tvinger enkelt-CMs til å vedta spesifikke formegenskaper under HCM 3 ,nemligfirkantformede celler med en lengde: bredde AR som er nesten lik 1: 14 (AR1). Det samme gjelder for DCM, med langstrakte celler med en AR som er nesten lik 11:1 (AR11). I tillegg kan HF skyldes økt etterbelastning (f.eks. i hypertensjon). I disse tilfellene tvinger heodynamiske krav CMs til å ta på seg firkantede former, i henhold til Laplaces lov, og AR endres fra 7:15 (AR7) til 1:16,7. HF kan også skyldes en økning i forhåndsbelastning (f.eks. i forhold som fører til overbelastning av volum). Når dette skjer, tvinger de biofysiske begrensningene CMs til å forlenge og AR endres fra 7:1 til 11:1.
Signalaktivitet ved membraner avhenger av globale cellegeometriparametere, for eksempel cellulær AR, størrelse, membranoverflaten og membrankrumningen18. Når neonatal rotte CMs ble belagt på substrater som var mønstret for å begrense cellene i en bestemt lengde: bredde AR, de viste den beste kontraktile funksjonen når forholdene var lik cellene i et sunt voksent hjerte. Derimot utførte de dårlig når forholdene var lik myocytter i sviktende hjerter19. I de tidlige stadiene av hypertrofi blir cellene bredere, noe som gjenspeiles av en økning i tverrsnittsområdet. HF forekommer i de senere stadiene av hypertrofi og celler vises vanligvis langstrakt. Derfor er det ikke overraskende at in vivo rottemodeller av kronisk hypertrofi har rapportert en økning i venstre ventrikulær myocyttlengde på rundt 30%20,men voksne CMs fra transgen musemodell som ble akutt behandlet med hypertrofiske stimuli in vitro viste lignende økninger i cellebredde istedet 21.
Encellede RNA-sekvensering, som tillater presis analyse av transkripsjonen av enkeltceller, revolusjonerer for tiden forståelsen av cellebiologi. Denne teknologien var den foretrukne metoden når det gjaldt å svare på spørsmålet om hvordan enkelte celleformer påvirket genuttrykk. Vi sammenlignet enkeltceller med forskjellige former, spesielt med ARs på 1:1, 7:1 eller 11:1. Dette ble gjort ved å så neonatal rotte ventrikulære CMs på en spesialdesignet chip fylt med fibronectin-belagtemikropapirer 2 med definerte ARs av 1:1, 7:1 eller 11:1. Mikropapirene ble fabrikkert ved hjelp av fotolitografiteknologi. Mikropapirene ble belagt av fibronectin, omgitt av cytofob overflate. Derfor vil CMs feste, spre og fange opp den definerte AR av mikropapirer ved utelukkende å vokse på fibronectin substratet, samtidig som det unngår det cytofobe området. Mikropapirene er ikke i et velformet format. I stedet er fibronectinnivået nøyaktig i samme høyde av det omkringliggende cytofobe området. Dette ga lignende forhold til voksende celler i en petriskål, da det ikke er stress fra de omkringliggende veggene. I tillegg er overflatearealet av mikropapirer med forskjellige AR-er like.
Det var to spesielt viktige aspekter ved eksperimentell design, noe som førte til bruk av encellede RNA sekvensering i stedet for bulk RNA sekvensering. For det første kan bare noen få prosenter av mikropapirene okkuperes av en enkelt celle. For det andre, noen ganger opptar en enkelt celle ikke mikropapiroverflaten. Enkeltceller som fullstendig dekker en mikropapiroverflate, må plukkes for encellede RNA-analyse. Fordi bare en undergruppe av de belagte cellene på en chip oppfylt begge kriteriene, var det ikke mulig å bare trypsinize hele brikken og samle alle cellene for bulk RNA sekvensering. Kvalifiserte celler måtte plukkes individuelt ved hjelp av en halvautomatisk cellevelker.
Det er foreløpig ukjent om CM-formen i seg selv har en intrafunksjonell innvirkning på myokardsynkronytiumet. Hovedformålet med metodene som ble foreslått i dette papiret var å utvikle en ny plattform for å studere om celleform per se hadde innvirkning påtranskripsjonen 17. Selv om in vitro-studier er forskjellige fra in vivo-studier, var hensikten med denne studien å undersøke effekten av forskjellige celleformer på genuttrykk, med tanke på at det er svært krevende å sammenligne celler med forskjellige former in vivo. Disse eksperimentene var inspirert av Kuo et al.19, som brukte en lignende tilnærming og rapporterte at de observerte endringer i fysiologiske parametere på grunn av endringer i celleform.
Denne studien brukte encellede RNA sekvensering, som er en ny og kraftig teknologi som kan oppdage transkripsjon av enkeltceller. Det ble kombinert med en innovativ tilnærming til å kultere enkelt-CMs, slik at de tok på seg forskjellige ARs som ellers bare kunne ha blitt observert in vivo.
Studien hadde noen begrensninger. For eksempel måtte neonatale CMs brukes til å generere forskjellige morfotyper, da det er usedvanlig utfordrende å kultur nok viktige voksne CMs i 72 timer i definerte former. Videre ble CMs dyrket i 72 timer ex vivo, som kan ha hatt innvirkning på genuttrykksmønsteret. Imidlertid var denne kulteringen nødvendig, slik at cellene kunne danne bestemte morfotyper. Videre ble bare enkeltceller som var mononucleated og fullt dekket fibronectin mikropapir valgt for sortering. Mønstrede celler på hver brikke må sorteres bare i en runde med sortering. Til slutt ble ca 50 celler som er omtrent en tredjedel av de valgte cellene plukket opp fra hver brikke. Det er to grunner til at begrenset antall vellykkede valgte celler. Først var noen celler for tett festet til fibronectin mønsteret og pickup flyten var ikke tvang nok til å lykkes plukke dem opp. For det andre, på grunn av trypsinbehandlingen, ble vedlegget mellom noen celler og fibronectin for løs. Følgelig ble disse cellene skjøvet bort fra sine fibronectin mikropapirer, da mikrokapillæret nærmet seg dem, og de ble ikke plukket opp. Forfatterne hevder ikke at dette oppsettet er det samme som et in vivo-miljø, men det viste seg å være en levedyktig tilnærming til å svare på forskningsspørsmålet.
Den foreslåtte metoden gjelder for ulike celletyper (f.eks. for hiPS-CMs). Følgende faktorer bør imidlertid optimaliseres for å studere andre celletyper. Egnede ECM-klebende molekyler for vedlegg av den spesifikke celletypen bør brukes til belegg av mikropapirene. Mikropapirenes geometri bør endres i henhold til studiespørsmålet og celletypen. Kulteringsperioden kan endres basert på studiespørsmålet. Løsrivelsesreagensen og inkubasjonstiden bør optimaliseres nøyaktig for studiecelletypen. For eksempel kan Accutase brukes i stedet for TryplE for løsrivelse av embryonale og nevronale stamceller. Åpningstidsparametrene til ventilene bør granskes for å plukke celler vellykket, men forsiktig. Oppsummert utviklet vi en ny plattform for å studere celleform som kan gi en verdifull ressurs for forskere på feltet. I denne sammenheng designet vi en eksperimentell tilnærming som etterlignet in vitro karakteristiske former pålagt CM in vivo av hemododynamiske begrensninger for å identifisere samspillet mellom cellulær arkitektur og genuttrykk. Vi rapporterer også utviklingen av en ny plattform for å studere HF in vitro og identifisering av celleform som en kraftig determinant for genuttrykk. Dette er en ny observasjon med vidtrekkende implikasjoner for biologi og medisin.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |