Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

FLIM-FRET Målinger af protein-protein interaktioner i levende bakterier.

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61602
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3, 1, 2,3, 1, 1, 2,3, 1, 1,4
1Université de Strasbourg, Laboratoire de Bioimagerie et Pathologies, UMR CNRS 7021, 2Université de Strasbourg, UMR 7242, ESBS, 3CNRS, UMR 7242, ESBS, 4Groupe Méthode Recherche Clinique, Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

Summary

Vi beskriver her en protokol til at karakterisere protein-protein interaktioner mellem to meget forskelligt udtrykt proteiner i levende Pseudomonas aeruginosa ved hjælp af FLIM-FRET målinger. Protokollen omfatter bakterier stamme konstruktioner, bakterier immobilisering, billeddannelse og post-imaging dataanalyse rutiner.

Abstract

Proteinproteininteraktioner (PPI) styrer forskellige nøgleprocesser i celler. Fluorescens livslang billeddannelse mikroskopi (FLIM) kombineret med Förster resonans energioverførsel (FRET) giver præcise oplysninger om PPI i levende celler. FLIM-FRET er afhængig af at måle fluorescens levetid henfald af en FRET donor på hver pixel i FLIM billedet, giver kvantitative og præcise oplysninger om PPI og deres rumlige cellulære organisationer. Vi foreslår her en detaljeret protokol for FLIM-FRET målinger, som vi har anvendt til at overvåge PPI i levende Pseudomonas aeruginosa i det særlige tilfælde af to interagerende proteiner udtrykt med meget forskellige kopinumre for at demonstrere kvaliteten og robustheden af teknikken til at afsløre kritiske træk ved PPI. Denne protokol beskriver i detaljer alle de nødvendige trin til PPI karakterisering - startende fra bakteriel mutant konstruktioner op til den endelige analyse ved hjælp af nyligt udviklede værktøjer, der giver avancerede visualisering muligheder for en enkel fortolkning af komplekse FLIM-FRET data.

Introduction

Proteinproteininteraktioner (PPI) styrer forskellige nøgleprocesser i celler1. PPI'ernes roller varierer afhængigt af proteinsammensætning, tilhørsforholdsfunktioner og placeringer i celler2. PPI kan undersøges ved hjælp af forskellige teknikker3. For eksempel er co-immunoprecipitation en forholdsvis enkel, robust og billig teknik, der almindeligvis anvendes værktøj til at identificere eller bekræfte PPI. Det kan dog være en udfordring at studere PPI, når de interagerende proteiner har lave udtryksniveauer, eller når interaktionerne kun er forbigående eller kun relevante i specifikke miljøer. Undersøgelse af PPI mellem de forskellige enzymer på pyoverdinvejen i P. aeruginosa kræver,at undertrykkelsen af den generelle jern-co-factored repressor Fur er lettet over at tillade ekspression af alle proteiner fra pyoverdinvejen, der skal udtrykkes i celle4,5,6. Denne fælles forordning for alle proteiner i vejen resulterer i rettidige udtryk i cellen forventes at fremme deres interaktioner. Mangfoldigheden med hensyn til størrelse, natur, udtryksniveauer og antallet af proteiner i denne metaboliske vej gør det vanskeligt at studere i rekonstituerede systemer6. Udforskning af PPI i deres cellulære miljø er derfor afgørende for yderligere at forstå de biologiske funktioner af proteiner i deres oprindelige sammenhæng.

Kun få metoder, herunder fluorescens, gør det muligt at udforske PPI i levende celler7. Blandt de forskellige fluorescens parametre, der kan måles, fluorescens levetid (dvs. den gennemsnitlige tid en fluorophore forbliver i sin ophidset tilstand, før udsender en foton) er sandsynligvis en af de mest interessante parametre at udforske i levende celler. Fluorescenslevetid for en fluorfil er meget følsom over for omgivelserne, og FLIM kan derfor give kemiske eller fysiske oplysninger om fluorophoreomgivelserne 8. Dette omfatter tilstedeværelsen af Förster resonans energioverførsel (FRET), der kan forekomme i nærværelse af en "acceptor" af fluorescens placeret i en kort afstand af en fluorescens "donor". Energioverførsel resulterer i en betydelig afkortning af donorfluorescenslevetid(figur 1A),hvilket gør Fluorescens Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) til en effektiv tilgang til at udforske proteinproteininteraktioner direkte i levende celler. FLIM kan desuden give rumlige oplysninger om , hvor interaktionerne finder sted icellerne 7,8. Denne tilgang er yderst stærk til at undersøge PPI i situationer, hvor mærkning med fluorophores af de to interagerende partnere er mulig.

For at FRET kan forekomme - skal der være kritiske forhold på afstanden mellem to fluorophores8,9. De to fluorophores bør ikke være fjernt fra hinanden med mere end 10 nm. Derfor skal der udvises forsigtighed ved udformningen af FLIM-FRET-forsøg for at sikre, at donoren og acceptoren af fluorescens har en chance for at blive placeret tæt på hinanden i det interagerende kompleks. Selv om dette kan synes begrænsende, er det faktisk en sand fordel, da frets afstande sikrer, at to mærkede proteiner, der gennemgår FRET, skal interagere fysisk (figur 1A). Vanskelighederne med at få klare svar om PPI i colocalization eksperimenter (to colocalized proteiner kan ikke nødvendigvis interagere) er derfor ikke et problem ved hjælp af FLIM-FRET.

Figure 1
Figur 1: FLIM-FRET-analyseprincip . Hver pixel i det flerdimensionale FLIM-FRET-billede indeholder oplysninger om fluorescens henfald registreret på dette bestemte sted (#counts = antal registrerede fotoner i kanalen t). (A)Den klassiske repræsentation af FLIM billedet er normalt en falsk farve levetid kodet 2D-billede (venstre). Et fald i donorens gennemsnitlige fluorescenslevetid - som det ses af en ændring i farveskalaen - kan observeres i nærværelse af FRET og er informativ om tilstedeværelsen af PPI i dette rumlige område. B)Overlapningmellem donoremissionsspektret og acceptorabsorptionsspektret er nødvendig for, at FRET kan forekomme. Klik her for at se en større version af dette tal.

Et andet krav til FRET er, at donorens emissionsspektrum og acceptorens absorptionsspektre skal overlappe8 (figur 1B). Den fluorescens excitation af donor bør være på bølgelængder, der bidrager meget lidt til den direkte fluorescens excitation af acceptoren. Ikke alle kombinationer af fluorophores er mulige, og vi anbefaler desuden at fortrinsvis bruge donorer med monoexponential fluorescens henfalder for at lette FLIM-FRET fortolkninger10. Flere par fluorescens proteiner opfylder disse krav, herunder den populære eGFP-mCherry par11 (for en gennemgang af paletten af tilgængelige fluorescerende protein FRET par se12,13).

FLIM-FRET gør det muligt at måle fluorescenslevetids henfaldet for en FRET-donor ved hver pixel i et FLIM-billede (Figur 1A). Der er to vigtige teknikker til at bestemme fluorescens levetid, der adskiller sig i erhvervelse og analyse: frekvens-domæne (FD)14 og tid-domæne (TD). TD FLIM er mere udbredt og udføres ved hjælp af en pulserende belysning kombineret med forskellige mulige detektionskonfigurationer, herunder gating metoder15, streak kamera16 eller tid-korreleret enkelt foton tælling (TCSPC) teknikker8. For både FD- og TD-teknikker måles fluorescenslevetid ikke direkte, men kræver en analyse af de målte data for at vurdere levetiden eller resultaterne af interaktioner. For TCSPC-teknikker er den mest udbredte analyse afhængig af at montere henfald med enkelte eller multiponentielle funktioner ved hjælp af mindst firkantede iterative re-convolutions, der minimerer den vægtede sum af resterne.

Endelig kan FLIM-FRET udføres både ved hjælp af enkelt foton eller multiphoton excitationer. Den seneste har flere fordele som at reducere autofluorescens og fotoskader ud af brændplanet. Multiphoton excitationer tillader også en længere excitation dybde, hvis der arbejdes i tykke 3D-prøver8. Tværtimod, enkelt foton excitation er normalt mere effektiv som de to-foton absorption tværsnit af fluorescerende proteiner er begrænset17.

Her foreslår vi en protokol for FLIM-FRET-målinger af PPI i levende P. aeruginosa i det særlige tilfælde af to interagerende proteiner (PvdA og PvdL) udtrykt med meget forskellige antal kopier for at demonstrere kvaliteten og robustheden af teknikken til at afsløre kritiske egenskaber ved PPI. PvdA og PvdL proteiner er involveret i pyoverdine biosyntese. PvdA er en L-ornithin N5-oxygenase og syntetiserer L-N5-formyl-N5-hydroxyornithin fra L-ornithin ved hydroxyylation (PvdA) og formylation (PvdF)18. PvdL er et ikke-ribosomal peptidsyntese (NRPS) enzym, der består af fire moduler. Det første modul katalyserer acylation af myristisk syre. Det andet modul katalyser aktivering af L-Glu og dens kondens til myristiske-coA. Derefter kondenserer det tredje modul en L-Tyr aminosyre, der derefter isomerized i D-Tyr. Endelig det fjerde modul binder en L-Dab (Diaminobutyric syre) aminosyre til at danne acylated tripeptid L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL er således ansvarlig for syntesen af de tre første aminosyrer i pyoverdinprækursoren. Samspillet mellem PvdA-protein og PvdL er overraskende, da PvdL, i modsætning til PvdI og PvdJ, ikke har et modul, der er specifikt for L-N5-formyl-N5-hydroxyornithin. Denne interaktion tyder på , at alle de enzymer , der er ansvarlige for pyoverdine-prækursorbiosyntesen , er arrangeret i store forbigående og dynamiske multienzymatiskekomplekser 19,20.

I denne rapport forklarer vi i detaljer, hvordan man konstruerer de bakteriestammer, der udtrykker de to interagerende eGFP og mCherry mærkede proteiner. Vi beskriver også prøveforberedelse og betingelser for effektiv FLIM-FRET cellebilleddannelse. Endelig foreslår vi en trin-for-trin tutorial til billedanalyse, herunder et nyligt udviklet værktøj, der giver avancerede visualiseringsmuligheder for enkel fortolkning af komplekse FLIM-FRET data. Med denne betænkning vil vi gerne overbevise ikke blot eventyrlystne, men de fleste biologer om, at FRET-FLIM er en tilgængelig og kraftfuld teknik, der er i stand til at behandle deres spørgsmål om PPI direkte i det oprindelige cellemiljø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid konstruktion

  1. Forstærkes af to PCR (PCR1 og 3) DNA-sekvenserne (brug genomisk DNA af P. aeruginosa PAO1) af de 700 basispar opstrøms og nedstrøms for de regioner, der svarer til indsætningsstedet i P. aeruginosa-genomet med high-fidelity DNA polymerase. Tilføj begrænsningswebsteder til primere i blåt og grønt, og tilføj en overlappende sekvens med mCherry til primere i rødt (Figur 2).
    1. For PvdA mærket på C-endestation med eGFP, forstærke 700 bp region opstrøms i forhold til stop codon af primere i blå, og forstærke 700 bp downstream region, der indeholder stop codon med primere i grøn.
    2. For PvdL mærket på N-endestation med mCherry, forstærke 700 bp region opstrøms til PvdL genet, herunder start codon, af primere i blå, og forstærke 700 bp downstream region med primere i grøn.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over PCR-strategi og plasmiderkonstruktion, der anvendes til opførelse af PvdA-mCherry. Se tekst for detaljer - pvdA koder et enzym involveret i biosyntesen af siderophore pyoverdin, en sekundær metabolit involveret i jern erhvervelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Forstærke eGFP kodning DNA (uden start og stop codons) med primere i rødt med High-Fidelity DNA polymerase.
  2. Rens PCR-produkterne på en PCR-oprydningskolonne (Materialetabel).
  3. Bland overlappende PCR-produkter i equimolar-forhold, og udfør en anden PCR ved hjælp af primere med begrænsningssted, der anvendes til PCR 1 og 3 (grøn og blå i figur 2).
  4. Overfør PCR-produktet i agarose-1x TAE (Tris-Base Aceta EDTA pH 8.0) gel, skær det tilsvarende bånd og ekstrakt ampliconen med et PCR-oprydningssæt (Materialetabel).
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
  5. Digest PCR amplicon og pEXG2 plasmid ved hjælp af de tilsvarende restriktionsenzymer21.
  6. Ligat plasmid og skær med T4 DNA ligase ved hjælp af 90 ng plasmid og molekylærforhold 1:1 (plasmid:insert).
  7. Transformer plasmider konstruktion i kemisk kompetente celler E. coli TOP10 celler ved at blande ligation produkt og 100 μL top10. Inkuber den kompetente bakterie/plasmidblanding på is i 30 minutter, før der fortsættes med et 42 °C varmestød i 60 s. Derefter sætte røret på is i 10 min.
  8. Tilsæt 1 ml lysogen bouillon (LB) til bakterierne og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
  9. Plade 100 μL bakterier på LB agar indeholdende 15 μg/ml gentamicin.
  10. Inkuber natten over ved 37 °C.
  11. Screen tilstedeværelsen af indsatsen ved koloni PCR: fra en isoleret transformant koloni, afhente et minut mængde bakterier, der skal føjes til en PCR mix, der indeholder primere hybridisering på plasmid på en sådan måde, at tilstedeværelsen af amplicon kunne påvises ved at køre produktet på en agarose gel (DNA polymerase). Fra samme koloni, der anvendes til PCR, overføres en lille mængde bakterier på en frisk plade indeholdende 15 μg/ml gentamicin, der skal isoleres og anvendes til plasmidekstraktion. Endelig isolere og rense plasmid (Tabel af Materialer) og kontrollere indsætte ved sekventering.
  12. TOP10-bakterier, der indeholder plasmid i LB med 20 % glycerol i 1,5 ml mikrorør ved -80 °C og den rensede plasmid ved -20 °C i 1,5 ml rør.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her

2. Fluorescerende tag indsættelse i kromosomale genom af P. aeruginosa (Figur 3)

  1. Grow P. aeruginosa, TOP10 og E. coli hjælperbakterier, hver i 5 ml LB uden antibiotikum ved 30 °C under orbital rysten natten22. Der genereres fluorescerende indføring i genomet af P. aeruginosa ved at overføre plasmid fra E. coli TOP10 til PAO1-stammen og integrere plasmid i genomet ved homolog rekombination. En anden overfartshændelse, der udstråler vektoren, genererer den tilsvarende mutant.
  2. Den optiske massen ved 600 nm (OD600 nm) af bakteriekulturen måles, og der blandes en tilsvarende mængde P. aeruginosa (500 μL OD600 nm = 1,0) med E. coli TOP10 pEXG2 (500 μL, OD600 nm = 1,0) og E. coli HB101 pRK600 hjælper (500 μL, OD600 nm = 1,0) i 1,5 ml mikrorør.
  3. Centrifuge 5 min ved 9.300 x g til pellet bakterierne.
    BEMÆRK: Onlineværktøjer kan bruges til at konvertere centrifugalgkraft til rotation pr. minut (omdr./min.) for at justere centrifugehastigheden.
  4. Hold bakteriepellet og kassér supernatanten.
  5. Opslæm pellet indeholdende bakterier i 50 μL LB.
  6. En plet (~50 μL) af blandingen på midten af LB agar (forvarmning ved 37 °C) og inkuberes 5 timer ved 37 °C.
  7. Skrot stedet med en steril inokuleringsløkke og resuspenderet i 1 ml LB.
  8. Plade 100 μL af denne bakterielle suspension på LB agar indeholdende 10 μg/mL chloramphenicol for at eliminere E. coli (E. coli TOP10 pEXG2 og E. coli HB101 pRK600-hjælperen er følsomme over for chloramphenicol, men P. aeruginosa er naturligt resistent) og 30 μg/ml gentamicin og inkuberes 2 dage ved 37 °C.
  9. Resuspend en koloni i 1 ml LB og inkubere ved 37 °C under orbital ryste 4h.
  10. Centrifuge 3 min ved 9.300 x g og kassér 950 μL supernatant. Pelletsuspendret pellet i 50 μL LB og isoler blandingen på LB agar indeholdende saccharose og uden NaCl.
  11. Inkuber natten over ved 30 °C.
  12. Spot isolerede kolonier på LB agar og LB agar indeholdende 15 mg/ml gentamicin for at kontrollere gentamicin følsomhed.
  13. Kontroller eGFP- eller mCherry-indsættelsen ved HJÆLP AF PCR-kolonier (DNA-polymerase) og sekvensering ved hjælp af specifikke primere.

Figure 3
Figur 3: Protokol for konstruktion af P. aeruginosa stammer ved fluorescerende tag indsættelse. Se tekst for detaljer. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Pyoverdine måling

  1. Vokse bakterier i 5 ml LB ved 30 °C under orbital ryste natten over.
  2. Pelletbakterier ved centrifugering, vask og dyrkning af dem i 5 ml SM (Succinate Medium, sammensætning: 6 g∙L−1 K2HPO4,3 g∙L−1 KH2PO4,1 g∙L−1 (NH4)2 SO4, 0,2 g∙L−1 MgSO4, 7 H2O og 4 g∙L−1 natriumsuccinate med pH justeret til 7,0 ved tilsætning af NaOH) ved 30 °C under orbital omrystning natten over. SM er et jern dårligt stillet medium - fraværet af jern vil aktivere ekspressionen af proteinerne i pyoverdinvejen, der normalt undertrykkes i nærvær af jern.
  3. OD600 nm måles og fortyndes igen bakterier i frisk SM-medium ved OD600 nm = 0,1, og dyrk dem ved 30 °C under orbitalryser natten over.
  4. OD600 nm måles for at bestemme mængden af bakterier i hver prøve.
  5. Der klargørs en kvartsknille med 100 μL P. aeruginosa-kultur og komplet til 1 ml SM (900 μL). Forbered en kvarts cuvette indeholdende 1 ml SM medium (blank).
  6. Ved hjælp af et UV-synligt spektrofotometer måles absorbansen ved det maksimale absorptionstoppen. Ved pH 7.0 vil det maksimale antal pyoverdinabsorbering forekomme ved ~400 nm. Pyoverdin -koncentrationen (apoform) bestemmes i prøven ved hjælp af Beer-Lambert-loven ved hjælp af en molære udryddelseskoefficient ved 400 nm e = 19 000 M-1∙cm-1.
    BEMÆRK: Pyoverdine kan kvantificeres i absorbansområdet fra ~0,1 til ~1 (afhængigt af UV-synligt spektrofotometer), hvor absorbansen lineært øges med koncentration.

4. Bakterier kultur og betingelser for celler til at udtrykke PvdA, PvdL og PvdJ

  1. På dag 1, vaccinere et rør med 5 ml LB fra den relevante glycerol bestand af bakterier og vokse bakterier i løbet af natten ved 30 °C ved 200 rpm i en orbital shaker inkubator.
  2. På dag 2, pellet celler ved centrifugering ved 3.000 x g i 3 min og kassér supernatant.
  3. Opslæm cellerne i 10 ml SM.
  4. Gentag trin 4.2-4.3 én gang og vokse bakterier i SM natten over ved 30 °C 200 rpm.
  5. På dag 3 fortyndes 1/10 bakteriekulturen i frisk SM.
  6. Vokse fortyndede bakterier igen natten over på samme betingelser.
    BEMÆRK: Tilstedeværelsen af pyoverdin kan detekteres visuelt, da det farver i gul-grøn vækstmediet. Den viser, at ekspressionen af proteinerne på pyoverdinvejen er blevet aktiveret, og at interesseenzymer udtrykkes i cellerne.

5. Forberedelse af agarosepude (Figur 4)

  1. Placer et mikroskopglas på en flad vandret overflade. Arranger to glas-slides toppet med to lag af tape på hver side af den oprindelige dias.
    BEMÆRK: Hold en afstand på 1-2 mm mellem de tre justerede objektglas for at forhindre, at den meleterede agarose i sidste ende spredes på objektglassene med tape.
  2. Pipette og hæld en dråbe på 70 μL på 1% smeltet agarose på glas-dias. Tilføj et fjerde dias på toppen for at flade agarosedråbetet og tryk forsigtigt ned. Vent et øjeblik.
  3. Tag den øverste rutsjebane af og slip med en pipette omkring 3 μL bakterier i 3 til 4 steder på forskellige steder på agarosepuden.
  4. Dæk med en mikroskopi glas coverslip (for eksempel en 22x22 mm #1,5 tykkelse).
    BEMÆRK: Fladhed og tykkelse af coverslips er vigtige for at arbejde med to-foton excitationer. Præcisionsdæksler med kontrolleret ensartet fladhed og lav autofluorescens er normalt et godt valg.
  5. Fastgør dækslæbet med smeltet paraffin for at forsegle dækslæbet på glasrutsjebanen. Start med at fastgøre de fire hjørner af coverslip.

Figure 4
Figur 4: Forberedelse af Agarose pad. Klik her for at se en større version af dette tal.

6. Billedbehandling med en mikroskopiopsætning med to foton

BEMÆRK: Vi bruger en hjemmelavet to-foton excitation scanning inverteret mikroskop med en 60x 1.2NA vand nedsænkning mål, der opererer i de-scannet fluorescens indsamling tilstand. Bølgelængden med to foton er sat til 930 nm. Det leveres af en Ti:Sapphire laser (80 MHz gentagelseshastighed, ≈ 70 fs pulsbredde) arbejder ved 10-20 mW. Fluorescens fotoner blev indsamlet gennem en 680 nm kort pass filter og en 525/50 nm band-pass filter, før de dirigeres til en fiber-koblet lavine foto-diode forbundet til en tid-korreleret enkelt foton tælle (TCSPC) modul. Mikroskopet er også udstyret med en transmissionfluorescenslampe. Flere FLIM-FRET mikroskoper er nu kommercielt tilgængelige, og mange billedbehandlingsfaciliteter er udstyret med opsætninger, der kan udføre FLIM-FRET-målinger.

  1. Brug fluorescenslampen til at fokusere målet på etelaget af bakterier i prøven og udvalgte interesseområder.
  2. Kontroller, at excitation laser lukkeren er lukket, og at det infrarøde lys, der kommer fra laseren er blokeret og ikke kommer ind i mikroskopet.
    Forsigtig: Omhyggelig opmærksomhed og konstant årvågenhed bør gives arbejde med IR pulserende lasere som laserlys kan ikke ses af øjnene, men enhver og endda forbigående direkte redegørelse eller laser refleksion kan være yderst skadelige og skabe uoprettelige øjenskader. Der henvises til de lokale lasersikkerhedsprocedurer og træning, før du bruger mikroskopiopsætninger.
  3. Placer mikroskopidiaset på scenen med dækslerne vendt mod målet.
  4. Kontroller, at fluorescenslampen er tændt.
  5. Drej filterkubetårnet for at vælge eGFP-terningen og åbne fluorescenslampelukkeren.
  6. Send fluorescenslyset mod mikroskopets okular.
    Forsigtig: Sørg for, at der bortskaffes passende filtre i lysvejen for at kassere direkte excitationslys fra fluorescenslampen, som kan beskadige øjnene.
  7. Fokuser målet på bakterier ved hjælp af mikroskopknappen.
  8. Vælg et område af interesse i prøven ved at oversætte den ved hjælp af joysticket, der styrer den motoriserede fase
    BEMÆRK: Fokusering er lettere med meget fluorescerende prøve, så fluorescensen kan ses direkte med øjnene.
  9. Skift excitationen for 2PE laseren for FLIM-FRET målinger.
  10. Send fluorescensemissionsvejen tilbage mod detektoren.
  11. Vend filterterningtårnet tilbage for at vælge den dichroic terning til 930 nm laseren.
  12. Indstil lasereffekten til 20 mW.
  13. Indstil størrelsen af den pågældende region til 30 μm. Denne operation justerer den spænding, der driver galvo-spejlene, og definerer deres bevægelsers rækkevidde (Figur 5).
  14. Tænd for detektoren og begynd at scanne prøven - start- og stopknapperne, der styrer scanningen, styrer også åbningen og lukningen af laserdodderen både af sikkerhedsmæssige årsager og for at begrænse fotobleaching af prøven (Figur 5).

Figure 5
Figur 5: Skematisk repræsentation af grænsefladen af mikroskop kontrol software. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Hvis det er nødvendigt, justere fokus ved lidt at flytte mikroskop fine fokus knop.
  2. Vælg synsfeltet til billedbehandling ved at flytte fasen fra computergrænsefladen fint. Dette kan gøres på opsætningen ved at flytte korset på billedet i mikroskop kontrol software (Figur 5), der vil definere det nye centrum af billedet og trykke på Move Stage. Et godt synsfelt for erhvervelse svarer til et billede med 10-30 immobile bakterier, alle korrekt fokuseret (alle bakterier er på samme plan). Hvis interesseret i at udtrække enkelte celler FLIM-FRET data, sikre, at bakterier er godt individualiseret (billede segmentering vil være meget lettere).
  3. Åbn SPCM-softwaren (kommerciel software til dataindsamling), og kontroller, at antallet af fotoner ikke er for høj til at undgå en oppæleeffekt, der kan påvirke levetidsmålingerne. Hvis det er nødvendigt, lavere ned laser intensitet for at holde foton tælle sats lav (omkring 1% af laser gentagelse sats).
    BEMÆRK: Pile-Up effekt beskriver virkningerne af fotoner tabt ved høje foton tælle satser på grund af død tid af Time Korreleret Single Photon Counting (TCSPC) enheder. Hvis Pile-Up opstår, bliver den målte gennemsnitlige levetid kunstigt kortere med muligvis en ekstra kortere komponent, der kan vises i forfaldet på grund af oversampling af hurtigt udsendende fotoner.
  4. Juster anskaffelsesparametre, herunder indsamlingstiden for anskaffelse (typisk 60 s til 180 s er påkrævet for at indsamle nok fotoner).
  5. Tryk på knappen Start, og vent på, at anskaffelsen fuldføres.
  6. Gem dataene.
  7. Stop scanningen af prøven, og sluk for detektoren.
  8. Vælg et andet synsfelt i eksempel, og gentag trin 6.14-6.22, eller billede et nyt mikroskopidiase ved at gentage trin 6.1-6.22.
    BEMÆRK: P. aeruginosa kan leve og dele sig i op til 6-8 timer ved stuetemperatur på agarosepuden (svarende til endelig ~4 fordoblingstid ved 20°C). Ideelt set skal du ikke vente for længe med at udføre FLIM-FRET måling for at undgå at observere en pude helt dækket med bakterier.

7. Dataanalyse

Figure 6
Figur 6: Hovedpanelet i dataanalysevinduet for SPCImage-software. Intensitetsbillede (blå boks), levetidsbillede (lilla boks), levetidshistogram (øverst til højre), henfaldskurve ved valgt position (grøn boks) og henfaldsparametre ved valgt position (cyanboks) af et repræsentativt PvdA-eGFP-henfald registreret i live P. aeruginosa ved hjælp af et bh SPC830-anskaffelseskort på et hjemmelavet To-Foton Excitation-FLIM-FRET-setup. Den eksperimentelle henfald kurve af pixel pegede i ovenstående billede, dens mono-eksponentiel pasform (rød kurve) deconvoluting henfaldet fra sin beregnede instrumental respons funktion (grøn kurve) kan ses i det grønne panel. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Grundlæggende analyse
    1. Kør SPCImage-softwaren.
    2. Importer den gemte SPCM-fil. Intensitetsbilledet vises på softwarens venstre øverste panel(Figur 6 blå boks).
    3. Undersøg henfaldskurvevinduet(Figur 6 grøn boks), som viser henfaldsdataene, der svarer til den pixel, der er valgt i intensitetsbilledet(Figur 6 blå boks). Fotonnumrene for hver tidskanal vises som blå prikker, og forfaldets pasform tegnes som en rød linje. Bemærk, at efter indlæsning af data viser softwaren den klareste pixel i billedet. Flyt det blå kryds hen over billedet for at undersøge pixel med lavere intensitet. Henfaldsvinduet opdateres automatisk på hver ny pixelposition.
      BEMÆRK: Det er meget vanskeligt at måle den instrumentale reaktionsfunktion (IRF) i et laserscanningssystem. En IRF beregnet ud fra den stigende kant af fluorescens henfald kurver i FLIM data kan bruges til henfald deconvolution. Dette er den mulighed, der er gjort som standard i SPCimage (Figur 6 grøn kurve).
    4. Juster tilpasningsområdet ved at flytte monteringsboksens start- og slutkanaler (T1 og T2 i den grønne boks). T1 bør starte på de første par kanaler af den stigende forfald og T2 definere den sidste kanal i slutningen af forfaldet og kan vælges som en af de sidste kanaler i forfaldet med en række fotoner over fotoner tælle offset (dvs. niveauet af fotoner tælles før henfaldet stiger).
    5. Vælg placering ved at ændre placeringsværdien. Kurvehenfald integrerer fotontællingen af den valgte pixel sammen med et område med i-pixel omkring markørpositionen, der er defineret af bin-parameteren (hvis du øger biningen, øges antallet af fotoner i henfaldet, og det kan være nyttigt at nå de fotontællinger, der kræves til multieksponentielle modeller).
    6. Juster tærskelværdien. Pixel, der ikke har mindst én kanal med et antal fotoner, der er højere end tærskelværdien, medtages ikke i tilpasningsproceduren. Selvfølgelig jo højere antallet af pixels til at passe, jo længere analyse.
      BEMÆRK: FLIM-data kan indeholde et enormt antal pixels og tidskanaler. De sidste versioner af softwaren tillader brug af GPU (Graphics Processor Unit) til at behandle et stort antal pixel parallelt, hvilket reducerer behandlingstiden betydeligt. Det kan være interessant at justere binning og tærskel parametre ved hjælp af billeder, der svarer til bakterier konstruktioner udviser den laveste fluorescens intensitet (f.eks med bakterielle stammer med de laveste udtryksniveauer). Dette vil sikre, at de relevante henfald, der er observeret i disse prøver, opfylder filtreringskriterierne og vil blive medtaget i analysen. Disse parametre kan derefter bruges til alle billeder.
    7. Juster om nødvendigt henfaldsparametrene (cyanboks). Lad skiftet variere, det meste af tids scatter og offset kan fastsættes til nul, hvis et kig på henfaldsfunktioner viser, at deres bidrag er ubetydelig. Forskydningen kan estimeres at se på de første kanaler i henfaldet - bemærk, at billeddannelse i lang tid på grund af lav fluorescens i prøven normalt resulterer i ikke-nul offset. Spredning forekommer for det meste i tykke prøver og kan betragtes som ubetydelig ellers.
    8. Før du kører pasformen, skal du vælge tilpasningsalgoritmen. Åbn vinduet algoritmeindstillinger i Vis/skjul modelindstillinger. Vælg algoritme til estimering af maksimal sandsynlighed (MLE) (Figur 7A).
    9. Kør tilpasningen af billedet ved at klikke på Beregn | Decay-matrix. Når det er fuldført, vises det levetidskodede FLIM-billede i livstidsbilledets panel(Figur 6 lilla boks).
      BEMÆRK: I henfaldskurvevinduet(Figur 6 grøn boks) er det muligt at se den levetidsværdi, der svarer til hver pixel i billedet, ved at flytte det blå kors.
      BEMÆRK: For at behandle et stort antal lignende FLIM-datafiler automatisk kan der bruges en batchbehandlingstilstand.
    10. Kontroller kvaliteten af pasformen og se på resterne (ideelt fordelt tilfældigt omkring 0) og en Chi-kvadratværdi tæt på 1.
    11. Monterede data kan eksporteres i forskellige formater. Hvis du vil eksportere filer i txt-filer, skal du gå til | Eksporter. Vælg Alle i vinduet Eksportindstillinger (Figur 7B), og klik derefter på Eksportér.
    12. Endelig gemme analysefilen. Analysefiler gemmes som *.img filer og kan genåbnes direkte i SPCImage.
      BEMÆRK: I særlige tilfælde af uafbalancerede donor-/acceptormængder kan FLIM-FRET afsløre delpopulationer i en blanding af samspilde proteinkomplekser - især når koncentrationerne af de to partnere er meget forskellige, hvilket resulterer i blandinger af komplekse og frie arter. Ikke-interagerende arter (karakteriseret ved et forfald, der minder meget om donoren kun henfald) kan diskrimineres fra interagerende dem under forudsætning af en rumlig invariance af donor levetid komponenter på tværs af datasættet. Tilsvarende, ikke-støkiometriske interagere komplekser med enten flere donorer eller mere acceptor af fluorescens kan dannes. Fluorescens henfald af sådanne komplekser er normalt vanskeligt at fortolke. Et FLIM-diagramplot kan bruges til at give vigtige oplysninger om støkiometri og bindingstilstand for PPI20,23. FLIM diagramplottet er en grafisk gengivelse af den korteste levetidskomponent som en funktion af dets amplitude. Det kan bruges til at visualisere pixel med lignende henfaldssignaturer. For at kunne tegne sådanne fremstillinger skal eksperimentelle fluorescens henfald være udstyret med en to eksponentiel model. Følgende trin kan være en vejledning gennem denne proces.
    13. Start med at analysere data fra donoren eneste konstruktion. Det vil gøre det muligt at bestemme donorens levetidsværdi. Ideelt set måle denne værdi over flere billeder optaget under de samme betingelser som donor / acceptor konstruktioner for at hente en robust levetid værdi for donor.
    14. Når bestemt, passer fluorescens henfald af donor / acceptor konstruktioner med en to-eksponentiel model. I parameterboksen cyan henfald (figur 6) skal du indstille antallet af komponenter til 2. Ret t2(ps) parameteren til donorens robuste levetidsværdi, der er bestemt i trin 1, og markér afkrydsningsfeltet for at rette denne parameter.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at fastsætte levetiden τ2 med lang levetid for at begrænse overmontering, forbedre tilpasningskonvergensen og opnå mere pålidelige toponentielle pasformsparametre24,25,26.
    15. Gem *img-filen, og eksportér data som *.asc-filer som i trin 7.1.11.

Figure 7
Figur 7: (A) Algoritmeindstillinger til montering af henfald med eksponentielle modeller. Valg af MLE (maksimal sandsynlighedsalgoritme eller maksimal sandsynlighedsestimering, MLE) som fit-model og (B) eksportindstillinger vindue. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Avanceret analyse af FLIM-billederne i R
    1. Installer R (https://cran.r-project.org) og RStudio (https://rstudio.com), hvis det er nødvendigt.
    2. Åbn RStudio, og opret et nyt projekt.
    3. Flyt al analyse *.asc-fil i en mappe med titlen "data" i projektets hovedmappe.
    4. Åbn en ny scriptfil (eller åbn det supplerende script FLIM_analysis. R).
    5. Installer den dedikerede flimDiagRam-pakke til flim dataanalyse https://github.com/jgodet/flimDiagRam. Ring til pakken i arbejdsområdet. (Se meddelelsen HowTo_FlimDiagRam)
      BEMÆRK: Installation af pakker skal kun ske én gang. Når det er installeret, kan pakker kaldes fra enhver ny R-session. Download af R-pakker fra github kræver installation af 'devtools'-pakke. Installationen af 'devtools' kan tage flere minutter. FlimDiagRam-pakken kan bruges til at repræsentere parametrene og fordelingen af FLIM-dataene, til at udtrække FLIM-data på niveau med enkelte individuelle celler, til at sammenligne FLIM-resultater på tværs af forhold eller stammer og til at udforske FLIM-data ved hjælp af avancerede visualiseringsværktøjer som FLIM-diagramplottet.
    6. Brug den trinvise kommenterede kode, og dataene stilles til rådighed for uafhængigt at gengive alle de undertal, der er vist i afsnittet Repræsentative resultater nedenfor. Dette selvstudium kan findes i HowTo_FlimDiagRam på https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf. Koden kan nemt transponeres for at analysere dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Empiriske kumulative fordelingsfunktioner (ecdf) af fluorescenslevetiderne målt for de forskellige bakteriestammer er vist i figur 8. Hvis FRET opstår, flyttes ecdf'erne mod de kortere levetid (figur 8A,8B). Bemærk, at når samspillet mellem de to proteiner resulterer i en lang afstand mellem de to fluorophores, ingen FRET kan forekomme (Figur 8C). Denne situation kan ikke adskilles fra den manglende interaktion mellem de to partnere i FLIM. Det er derfor vigtigt, når der ikke kan forudsiges interfarvningsafstand fra molekylære modeller eller kendte arkitekturer i komplekset, at overveje at mærke proteinerne i forskellige positioner for at maksimere chancerne for at undersøge interaktionen. På samme måde resulterer det samme PvdA/PvdL-kompleks ikke i lignende FLIM-FRET-data på grund af den store forskel i proteinudtryk mellem PvdA (højt udtrykt) og det ikke-ribosomale peptidsyntetase PvdL (få kopier pr. celler). Faktisk kan ubalancerede støkiome poster komplicere fortolkningen af FLIM-FRET data. Afhængigt af hvilket protein der er mærket med donoren, fører ubalancerede støkiome indgange til forskelle i bidraget fra det frie i forhold til de bundne donormærkede proteiner i den registrerede fluorescenslevefordeling (figur 8A,8B).

Figure 8
Figur 8: Illustration af ændringer, der forekommer i donoren, betyder, at der sker en fordeling af fluorescenslevetiden som reaktion på FRET (enkelt eksponentiel model). Repræsentation af samspillet mellem PvdL (grå form) med PvdA (blå form) (A og B) eller PvdJ (gul form)(C)proteiner mærket med eGFP (grøn) eller mCherry (rød) fluorescerende proteiner. De empiriske kumulative fordelingsfunktioner (lavere grafer) kan tydeligt fremhæve forskellene mellem fluorescenslevefordelingen. a)I nærværelse af et overskud af PvdA mærket med donor af fluorescens, er den gennemsnitlige levetid distribution af eGFP donorer domineret af donorer, der ikke gennemgår FRET, men også integrere levetiden for de få donorer, der gennemgår FRET med mCherry-PvdL. I denne situation er blandingens levetidsfordeling (grøn-orange kurve) tæt på levetidsfordelingen af den samme blanding, der kun dannes med ikke-mærket PvdL (grøn kurve). b) Hvis mærkningsrækkefølgen ændres, og der er et overskud af PvdA mærket med acceptorer til stede, reguleres den gennemsnitlige levetidsfordeling af de overførende arter, herunder eventuelt donorer, der gennemgår FRET med flere acceptorer (orange kurve). Denne fordeling er derfor meget forskellig fra det samme kompleks dannet med umærket PvdA (grøn kurve). (C)Hvis der ikke opstår nogen FRET, fordi proteiner ikke interagerer, eller fordi afstanden mellem farvestoffet er for stor i komplekset, er ændringer i levetidsfordelingen næsten superimposable som donorens (sammenlign den lysegrønne kurve, der svarer til fluorescenslevefordelingen for PvdJ-eGFP/mCherry-PvdL, med den grønne kurve, der svarer til PvdJ-eGFP). Klik her for at se en større version af dette tal.

Diagramplottet kan bruges til at give kritiske oplysninger om støkiometrien som vist i figur 9. I PvdA-eGFP/mCherry PvdL-mutanten er mængden af donormærket PvdA meget højere end mængden af mCherry PvdL. Blandt alle donorer, der er til stede i stikprøven, er det kun nogle få af dem, der interagerer med PvdL. I modsætning til den gennemsnitlige FLIM-værdifordeling giver FLIM-diagramplottet kun de specifikke oplysninger, der er indeholdt i henfaldskomponenten hos de donorer, der gennemgår FRET. I figur 9Akan der observeres en enkelt tau1-værdi centreret ved ~ 2,3 ns, svarende til ca. 30-40% af arten i blandingen. Den enkelte tau1 værdi tyder på, at hver PvdA-eGFP donor kun kan overføre med en mCherry PvdL acceptor.

Fra den omvendte mærkning (PvdA-mCherry/eGFP PvdL) forventes de fleste eGFP PvdL-proteiner at interagere med PvdA-mCherry på grund af det lave antal PvdL sammenlignet med PvdA. Dette bekræftes af de alfa1-værdier, der flyttes mod højere værdier. Desuden blev tau1-værdierne meget mere fordelt (figur 9B) med genfærd af kortlivede arter med levetider så lavt som ~ 1,5 ns. Dette tyder på, at der forekommer yderligere overførsler i forhold til situationen i figur 9A, og at flere PvdA-proteiner derfor kan binde sig til et enkelt PvdL-protein. Som følge heraf vil eGFP's levetid for hvert kompleks afhænge af antallet og fordelingen af mCherry-proteiner, som eGFP overfører energi med. Samlet set tyder dataene på, at hvert PvdL-protein kan interagere med flere PvdA-proteiner

Figure 9
Figur 9: FLIM-diagramområder i tilfælde af overskridelse af donorer (A) eller acceptorer (B) og flere bindingssteder. FLIM-diagramplottet giver de specifikke oplysninger, der er indeholdt i henfaldskomponenten af den donor, der gennemgår FRET, der hentes ved hjælp af en toponentiel pasform. I PvdA-eGFP/mCherry-PvdL mutant (A) observeres en enkelt tau1-værdi, og dens amplitude, der er angivet ved den spredte position af datapunkterne på den vandrette akse, er informativ om populationen af donorer, der er beskæftiget med FRET. I PvdA-mCherry/eGFP-PvdL-systemet (B)er tau1-værdierne meget mere fordelt, hvilket indikerer, at et PvdL (grå form) protein kan interagere med flere PvdA -proteiner (blå form). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FLIM-FRET giver nogle vigtige fordele i forhold til intensitetsbaseret FRET-billedbehandling. Fluorescens levetid er en iboende parameter af fluorophore. Som følge heraf er det ikke afhængig af lokale koncentrationer af fluorofre hverken af intensiteten af lys excitation. Fluorescens levetid er desuden også dårligt påvirket af foto-blegning. Det er især interessant at dokumentere PPI i celler, hvor lokale proteiner koncentrationer kan være meget heterogene i hele de subcellulære rum eller regioner. FLIM-FRET er også interessant i alle situationer, hvor koncentrationen af komplekse er lav, fordi ekspressionsniveauet for både proteiner eller et af proteinerne er lave.

I forbindelse med PPI er det vanskeligt at udlede de FRET-mekanismer, der er ansvarlige for afkortning af levetiden, og derfor oplysninger om interaktionernes art, kun i betragtning af den gennemsnitlige levetid. En afkortning af den gennemsnitlige levetid kan skyldes en høj andel af arter, der interagerer med moderat FRET, eller på det modsatte af en lav andel af donorer, der interagerer på kort afstand med acceptoren. Denne situation er endnu mere kompliceret, når komplekser med ubalanceret støbeforme. Grafiske visualiseringsværktøjer, der gør det muligt at repræsentere flere dimensioner (i forbindelse med diagramplottet tau1, alfa og ) kan være nyttige til at give vigtige oplysninger om arten af de komplekser, der udgør den pågældende formular. Alternative grafiske fremstillinger af data, ligesom phasor baseretanalyse 27,28 foreslår en grafisk repræsentation af de rå FLIM data i en vektor rum, er også interessant i denne sammenhæng.

At vælge, hvordan man tager proteiner af interesse er et centralt punkt for vellykkede FLIM-FRET eksperimenter.   Mest kritisk, tags bør ikke ændre eller ændre samspillet mellem proteiner. Desværre, undtagen i sjældne tilfælde, hvor strukturerne af proteiner er kendt eller kan forudsiges, i de fleste tilfælde er man tvunget til trial-and-error tilgange. Fortolkninger af FLIM-FRET uden energioverførsel skal derfor altid overveje muligheden for, at etiketter kan ændre samspillet. Derfor kan FLIM-FRET ses som en bekræftende teknik i den forstand, at hvis der observeres en interaktion, bør den eksistere uden mærkning. Bortskaffelse af en ekstern funktionel udlæsning - som at kontrollere, at produktionen af pyoverdin af de muterede stammer, der udtrykker dobbelt mærkede proteiner svarer til vilde type stammer - er særligt nyttigt at fortolke FLIM-FRET resultater.

Billeddannelse er ikke en metode med høj overførselshastighed til påvisning af PPI og er indtil videre blevet udnyttet til at bekræfte formodede eller forudsagte PPI' er. I denne bekræftende sammenhæng giver det mening at presse analysen til at udtrække så mange oplysninger som muligt fra dataene for at få en dybere forståelse af de mekanismer, der er involveret i PPI. Nogle forsøg udføres29,30,31 at vende FLIM-FRET opsætninger tilpasset screening strategier. Udvikling af avancerede let tilgængelige og automatiserede analyser vil sikre muligheden for at behandle den store mængde data, der produceres ved screeningsmetoder med høj kapacitet. I denne sammenhæng kan tilpasningsprocedurer, der anvender mindst kvadratisk metoder, der kræver statistikker med høje optællinger, være dårligt tilpasset til at anslå FRET. Der er udviklet en række alternativemetoder på 16,32,herunder ikke-monterede metoder (gennemgået i Padilla-Parra et al. 2011 33). Disse metoder varierer i beregningshastighed, minimalt antal fotoner, der kræves for korrekt analyse, nøjagtighed, kompleksitet og type data, der kan behandles effektivt. Teknikker som den minimale brøkdel af interagerende donor34 eller phasor tilgang35,36,37 har potentiale til at udføre høj hastighed opkøb i FRET-FLIM og stadig være kvantitativ til at behandle store mængder data eller endda at nå video-rate hastigheder.

Kravet om at konstruere fluorescerende mærket protein, der ikke forstyrre de oprindelige funktioner af proteiner i celler er et stort problem for at skalere hastigheden og antallet af PPI udforsket. Alternative nye mærkningsstrategier, der for eksempel er baseret på fluorgene småmolekyler 38,39 kanvære en måde at omgå denne kritiske begrænsning på. Bortskaffelse af fluorescerende sonder, der er kompatible med FLIM-FRET og i stand til at mærke andre cellekomponenter (som nukleinsyrer eller membran), vil også udvide karakteren af de interaktioner, som FLIM-FRET kan karakterisere.

I en tæt fremtid tror vi på, at det største gennembrud på FLIM-FRET-området vil være et resultat af innovation inden for databehandling. Metoder som komprimeret sensing40 bør muliggøre en effektiv og præcis rekonstruktion af FLIM-billede fra sparsomme henfaldsdata - muligvis hurtigere yderligere anskaffelseshastigheden, der vil gøre det muligt at udføre realtidSRLIM-FRET på hurtigt skiftende proces. Tilsvarende vil maskinlæring anvendt på FLIM-data vedrørende pixelklassificering eller regression, forsylning eller signalrestaurering muliggøre enestående genopbygning og analyse af billedet, som yderligere vil øge fret-flim-metodernesinteresse 41,42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender Dr. Ludovic Richert for hans værdifulde hjælp til FLIM dataindsamling og for den tekniske vedligeholdelse og udvikling af FLIM setup. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN finansieres af Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906). YM er taknemmelig for Institut Universitaire de France (IUF) for støtte og give ekstra tid til at være dedikeret til forskning. IJS og JG anerkender Instituttet for Levering af Narkotika i Strasbourg for dets finansielle støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
525/50 nm band-pass filter F37-516, AHF, Germany
680 nm short pass filter F75-680, AHF, Germany
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A4418
DreamTaq DNA polymerase 5U/μL ThermoFisher Scientific EP0714
E. coli TOP10 Invitrogen C404010
Fiber-coupled avalanche photo-diode SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm Knitel glass MS0011
High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL ThermoFisher Scientific F530S
Lysogeny broth (LB) Millipore 1.10285
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) Sigma-Aldrich 10034-99-8
Microscope slides (25×75mm) Knitel glass MS0057
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.50
NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel 740588.10
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich RES20765
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Sodium Succinate (Disodium) Sigma-Aldrich 14160
SPCImage, SPCM software Becker & Hickl
Sterile inoculating loop Nunc 7648-1PAK
T4 DNA ligase 1U/μL ThermoFisher Scientific 15224017
TCSPC module SPC830, Becker & Hickl, Germany
Ti:Sapphire laser Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL Falcon 352070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
  3. Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
  4. Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
  5. Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
  6. Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
  7. Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
  8. Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
  9. Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
  10. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
  11. Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
  12. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
  14. Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
  15. Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
  16. Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
  18. Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
  19. Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
  20. Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
  21. Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
  22. Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
  23. Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
  24. El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
  25. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
  26. Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
  27. Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  28. Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
  29. Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
  31. Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
  32. Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
  33. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
  34. Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
  35. Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
  36. Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
  37. Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
  38. Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, Elsevier Inc. (2013).
  39. Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
  40. Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
  41. Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
  42. Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).

Tags

Biologi FRET-FLIM protein-protein interaktioner Pseudomonas aeruginosa bakterier billeddannelse fluorescens
FLIM-FRET Målinger af protein-protein interaktioner i levende bakterier.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., … More

Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., Steffan, T., Gasser, V., Boutant, E., Réal, É., Schalk, I. J., Mély, Y., Godet, J. FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.. J. Vis. Exp. (162), e61602, doi:10.3791/61602 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter