Summary
हम ज़ेनोपस लेविस भ्रूण से अलग गहरे एक्टोडर्म कोशिकाओं से म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड विकसित करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। बहुपेंट प्रोजेनिटर एपिथेलियल गोबलेट सेल अग्रदूत को पुनर्जीवित करते हैं और ऑर्गेनॉइड की सतह पर कोशिका संक्रमण की दीक्षा और प्रगति की लाइव ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं।
Abstract
म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम बलगम उत्पादन और सिलिया-मध्यस्थता निकासी की कार्रवाई के माध्यम से विदेशी कणों को हटाकर रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है। म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम में कई चिकित्सकीय प्रासंगिक दोष अनुमानित होते हैं क्योंकि वे शरीर के भीतर गहरे होते हैं। यहां, हम मल्टीपॉटेंट प्रोजेनिटर से उत्पन्न म्यूकोसिलीरी एपिथेलियम के लिए एक ट्रैक्टेबल 3 डी मॉडल पेश करते हैं जो ज़ेनोपस लेविस भ्रूण से सूक्ष्म रूप से अलग थे। म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड को गहरे इक्टोडर्म कोशिकाओं से नए उत्पन्न एपिथेलियम से कवर किया जाता है और बाद में अलग-अलग पैटर्न वाली बहुआयामी कोशिकाओं, गुप्त कोशिकाओं और बलगम-उत्पादक गोबलेट कोशिकाओं से सजाया जाता है जो 24 घंटे के भीतर देशी एपिडर्मिस से अविवेच्य होते हैं। मेसेन्चिमल से एपिथेलियल तक गतिशील कोशिका संक्रमण के पूर्ण दृश्यों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग द्वारा ट्रैक किया जा सकता है। ये इन इन विट्रो सुसंस्कृत, स्व-आयोजन म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड पीढ़ी में उच्च दक्षता के साथ म्यूकोसिलिएरी एपिथेलियम के जीव विज्ञान का अध्ययन करने में अलग-अलग लाभ प्रदान करते हैं, संस्कृति की स्थिति को परिभाषित करते हैं, संख्या और आकार पर नियंत्रण, और विभेदित एपिथेलियम के उत्थान के दौरान लाइव इमेजिंग के लिए सीधी पहुंच।
Introduction
म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम की चोट, संक्रमण और रोग बिगड़ा उत्पादन और बलगम की निकासी से जुड़े होते हैं जो अक्सर फेफड़े के विकारों जैसे क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज, अस्थमा, सिस्टिक फाइब्रोसिस, ब्रोंकिकेसिस, और प्राथमिक सिलियरीडाइस्किनेशिया1,2,3, 4में पायाजाताहै। ऑर्गेनॉइड तकनीक में हाल ही में एक अग्रिम, उदाहरण के लिए, बेसल सेल ने फेफड़ों के ऑर्गेनॉइड को ट्रेकोस्फीयर कहा जो म्यूकोसिलिएरी एपिथेलियम के पुनर्जननको चिकित्सीय क्षमता1,5,6के साथ एक आशाजनक मॉडल के रूप में उत्पन्न करता है। हालांकि, इसका उपयोग वर्तमान में सीमित है, क्योंकि परिभाषित संस्कृति की स्थिति की कमी और ऑर्गेनॉइड प्रोडक्शंस में कम दक्षता है। मानव वायुमार्ग और मेंढक एपिडर्मिस में म्यूकोसिलीरी एपिथेलियम ऊतक आकृति विज्ञान, सेलुलर संरचना और इसकेकार्य7,8,9,10, 11,12में उल्लेखनीय रूप से समान हैं। दोनों जीवों में, म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम बलगम और रोगाणुरोधी पदार्थों को स्रावित करके पहली पंक्ति की रक्षा प्रदान करता है और सिलिया की समकालिक कार्रवाई के माध्यम से हानिकारक कणों और रोगजनकों को साफ करता है।
यहां, हम ज़ेनोपस लेविस भ्रूण13, 14के बहुपेंट प्रोजेनिटर का उपयोग करके म्यूकोसिलीरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। पहले, हमने14 की रिपोर्ट दी थी कि बहिर्जात विकास कारकों और बाह्य मैट्रिक्स के अभाव में, माइक्रोसर्जिकल रूप से अलग-थलग गहरे कोशिकाओं को प्रारंभिक गैस्ट्रुला चरण से अनायास ही एकत्रित किया जाता है, इसकी सतह पर एपिथेलियम को पुनर्जीवित किया जाता है, और 24 घंटे के भीतर बहुसांशित और अन्य सहायक कोशिकाओं को इंटरकल करके म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम में परिपक्व होता है। तेजी से विकास के अलावा, यह प्रोटोकॉल सीधे एपिथेलियल गोब्लेट सेल जनकों में बहुपंत गहरी ectoderm कोशिकाओं के संक्रमण तक पहुंचने के लिए एक अलग अवसर प्रदान करता है जो एक बाधित एपिथेलियम14 के पुनर्जनन चरणों को पुनः प्राप्त करता है जो अक्षुण्ण भ्रूण और ectoderm (जिसे पशु कैप के रूप में भी जाना जाता है)15,16,17से उपलब्ध नहीं हैं। उत्पादित ऑर्गेनॉइड की संख्या और आकार ज़ेनोपस भ्रूण से शुरुआती सामग्रियों को नियंत्रित करके उच्च दक्षता के साथ स्केलेबल हैं। फ्लोटिंग संस्कृति में ऑर्गेनॉइड को आसानी से हल किया जा सकता है और आगे के विश्लेषण के लिए वांछित चरण में स्थानांतरित किया जा सकता है, जिसमें उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग, यांत्रिक परीक्षण, दवा उपचार और आनुवंशिक लक्षण वर्णन14शामिल हैं। भ्रूणीय कोशिका की सतह पर एपिथेलियम का यह सहज, ऊतक यांत्रिकी-चालित पुनर्जनन म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड में परिणाम देता है और म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास त्रि-आयामी (3 डी) मॉडल प्रदान करता है।
Protocol
पशु उपयोग और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को इंस्टीट्यूट फॉर बेसिक साइंस (आईबीएस 18-01) और कोरिया एडवांस्ड इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (KA2017-22) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. भ्रूण
- एक मानक प्रक्रिया का उपयोग करके एक्स. लेविस भ्रूण प्राप्त करें: मैन्युअल रूप से उत्तेजित मादा मेंढकों से अंडे एकत्र करें और इन विट्रो निषेचन18,19में करें।
- डी-जेली 1/3x संशोधित बार्थ के खारा (एमबीएस) में 2% सिस्टीन में लगभग 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ निषेचित भ्रूण; पीएच 8 19 में नीचे1Xएमबीएस के लिए नुस्खा देखें ।
- लाइव इमेजिंग के लिए वैकल्पिक कदम: फ्लोरोसेंटली रूप से विशिष्ट प्रोटीन लेबल करना और ऑर्गेनॉइड में उनकी गतिशीलता का निरीक्षण करना, सेक्शन 5 पर आगे बढ़ें।
- (वैकल्पिक) ऑर्गेनॉइड के भीतर सतही ectoderm कोशिकाओं के प्रदूषण की निगरानी करने के लिए, चरण 914पर एनएचएस-रोडामाइन के साथ भ्रूण की एपिकल सतह लेबल करें। कोमल अखरोट के साथ 30 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल एनएचएस-रोडामाइन में 1/3x एमबीएस (पीएच ९.०) में इनक्यूबेट भ्रूण । 15 मिनट के लिए 1/3x एमबीएस से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करके भ्रूण को तीन बार धोएं ।
- संस्कृति पसंदीदा तापमान पर 1/3x एमबीएस में भ्रूण (14-26 डिग्री सेल्सियस) जब तक चरण 10 के पहले संकेत का पता लगाया जाता है (यानी, वनस्पति दृश्य में ब्लास्टोपोर के आसपास अंधेरे वर्णक कोशिकाओं की उपस्थिति) ।
2. माइक्रोसर्जिकल उपकरण, समाधान और संस्कृति जहाजों की तैयारी
- माइक्रोसर्जरी20के लिए सर्जिकल ग्रेड संदंश और बाल उपकरण (हेयर लूप और हेयर नाइफ) की एक जोड़ी सहित आवश्यक उपकरण तैयार करें।
- भ्रूण के लिए निम्नलिखित संस्कृति मीडिया तैयार करें: 1/3X एमबीएस, जहां 1X एमबीएस एनएसीएल (88 एमएम), केसीएल (1 एमएम), नाएचसीओ3 (2.4 एमएम), एमजीएसओ4 (0.82 एमएम), सीए (नंबर3) 2(0.33 एमएम), सीएसीएल2 (0.41 एमएम) और एचईपी (10 एमएम) के साथ बनाया गया है। पीएच को 10 एम नाओएच के साथ 7.4 पर समायोजित करें।
नोट: वैकल्पिक: पीएच इंगित करने के लिए फिनॉल लाल की बूंदें जोड़ें। - भ्रूणीय ऊतकों और ऑर्गेनॉइड के लिए निम्नलिखित संस्कृति मीडिया तैयार करें: डैनिलिक के लिए एमी (डीएफए)21 ताजा 1% एंटीबायोटिक और एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ पूरक है। एनएसीएल (53 एमएम), एनए2सीओ3 (5 एमएम), पोटेशियम ग्लूकोनेट (4.5 एमएम), सोडियम ग्लूकोनेट (32 एमएम), सीएसीएल2 (1 एमएम) और एमजीएसओ4 (1 एमएम) के साथ डीएफए तैयार करें। दानेदार बिसिन के साथ पीएच को 8.3 पर समायोजित करें। फिल्टर डीएफए (0.2 माइक्रोन बोतल-शीर्ष फ़िल्टर), एलिकोट और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- ऊपर नुस्खा का उपयोग करके और CaCl2 और MgSO4लोप द्वारा ectoderm से गहरी कोशिकाओं को अलग करने के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त डीएफए तैयार करें । Aliquot और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- भ्रूण कोशिका एकत्रीकरण के लिए गैर चिपकने वाला पीसीआर ट्यूब तैयार करें।
- अलग भ्रूण कोशिकाओं के सहज एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए रात भर 1% बीएसए (आसुत पानी के 100 मिलीएल में बीएसए के 1 ग्राम) के 200 माइक्रोन के साथ गोल तली पीसीआर ट्यूबों को कोटिंग करके गैर-चिपकने वाली पीसीआर ट्यूब तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब का उपयोग एक ऑर्गेनॉइड को इकट्ठा करने के लिए किया जाएगा।
- किसी भी अवशिष्ट बीएसए को हटाने के लिए तीन बार डीएफए के साथ बीएसए-कोटेड पीसीआर ट्यूब कुल्ला ।
- डीएफए के 200 माइक्रोन के साथ पीसीआर ट्यूब भरें।
3. गहरी ectoderm कोशिकाओं का अलगाव
- चुनें और भ्रूण इकट्ठा के रूप में वे एक स्टीरियोस्कोप के तहत बाल उपकरण का उपयोग कर प्रारंभिक चरण 10 तक पहुंचने ।
- डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, चयनित भ्रूण को डीएफए से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- भ्रूण के जानवर पक्ष को बाधित किए बिना वनस्पति पक्ष से तेज संदंश का उपयोग कर भ्रूण की विटेललाइन झिल्ली को हटा दें।
नोट: हवा में भ्रूण को उजागर करने से बचने के लिए सावधान रहें । समाधान में हवा के बुलबुले का परिचय या सतह पर भ्रूण लाने से भ्रूण फट जाएगा। - पशु टोपी को अलग करने के लिए, भ्रूण के जानवर पक्ष को स्थिति में रखें।
- नेत्रहीन पशु टोपी की सीमा का अनुमान है और एक बाल चाकू के साथ पशु टोपी के किनारे के साथ पहला चीरा बनाते हैं । एक कट बनाने के लिए बाल चाकू को बाहर की ओर खींचें।
- पशु टोपी आबकारी करने के लिए छोटे कटौती की एक श्रृंखला बनाने के लिए कदम 3.5 दोहराएं।
- मेसोडर्म अग्रदूतों को शामिल करने से रोकने के लिए बाल चाकू का उपयोग करके पशु टोपी के मोटे स्तरित किनारे को ट्रिम करें।
नोट: अलग पशु टोपियां के उपचार और एकत्रीकरण को रोकने के लिए, 10 मिनट के भीतर अगले कदम के लिए आगे बढ़ें । आमतौर पर, हम कई ऑर्गेनॉइड को इकट्ठा करने के लिए एक समय में 5-10 पशु टोपियां अलग करते हैं। - एनिमल कैप से डीप एक्टोडेर्म सेल्स को अलग करने के लिए, एक्साइज्ड एनिमल कैप्स को डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट के साथ कैल्शियम और मैग्नीशियम-फ्री डीएफए से भरे पेट्री डिश में ट्रांसफर करें । स्थानांतरण के दौरान किसी भी हवा बुलबुले पेश करने के लिए नहीं सावधान रहें।
- अगले चरणों के लिए पर्याप्त जगह रखने के लिए, बाल उपकरणों का उपयोग करके, जानवरों की टोपियां जानवरों का सामना करने और अन्य एक्सप्लांट से उदार दूरी बनाए रखने के लिए स्थिति करें।
- 5-10 मिनट के लिए रुको और फिर एक स्टीरियोस्कोप के तहत explants की निगरानी । एक बार ढीली गहरी कोशिकाओं को अंधेरे-वर्णक सतही परत के किनारे से पाया गया है, सतही परत को स्टीरियोस्कोप के नीचे बाल चाकू का उपयोग करके हल्के रंग की गहरी ectoderm कोशिकाओं से दूर उठाना शुरू करें।
- ध्यान से अलग (छील बंद) एक बाल चाकू के साथ सतही परत, किनारे पर शुरू ।
- कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त डीएफए की मात्रा को सीमित करने के लिए न्यूनतम आकांक्षा (10\u201215 μL) के साथ गहरी ectoderm कोशिकाओं को इकट्ठा करें जो अगले चरण में एकत्रीकरण मीडिया को स्थानांतरित किया जाता है।
नोट: अलग सतही कोशिकाओं को मीडिया से हटाया जा सकता है ताकि शेष गहरी ectoderm कोशिकाओं को दूषित करने से रोका जा सके ।
4. म्यूकोसिलिएरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड का उत्पादन
- डीएफए के 200 माइक्रोन युक्त एक गैर-चिपकने वाली पीसीआर ट्यूब में गहरी ectoderm कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित कोशिकाओं को तितर-बितर करने के लिए मीडिया (2\u20123 बार) को धीरे से पिपेट करें।
नोट: घंटे के बाद एकत्रीकरण (hpa) के रूप में नामित समय इस कदम पर शुरू होता है । परिणामी ऑर्गेनॉइड का आकार पीसीआर ट्यूब में जोड़े गए गहरे एक्टोडर्म कोशिकाओं की संख्या से नियंत्रित होता है। ऑर्गेनॉइड के वांछित आकार के आधार पर एक या एक से अधिक पशु टोपियों से गहरी ectoderm कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है। - पीसीआर ट्यूब बंद करें। नीचे सहज एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए पीसीआर ट्यूबों को सीधा रखें।
- एक स्टीरियोस्कोप के तहत एकत्रीकरण प्रक्रिया की निगरानी करें। कोशिकाएं आम तौर पर एक घंटे के भीतर पीसीआर ट्यूब के नीचे इकट्ठा होती हैं और आकार के आधार पर 2-3 घंटे के भीतर गोलाकार समुच्चय में इकट्ठा होती हैं।
- म्यूकोसिलिएरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड के विकास के दौरान लाइव इमेजिंग या दवा परीक्षण करने के लिए, संग्रह के दौरान समुच्चय को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए बढ़े हुए सुझावों (निष्फल कैंची के साथ कटौती) के साथ लगे 200 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 2 एचपीए पर एकत्र करें।
- एग्रीगेट्स को संस्कृति में म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड में विकसित करने की अनुमति देने के लिए, 5 एचपीए पर पीसीआर ट्यूब से गोलाकार समुच्चय एकत्र करें और उन्हें डीएफए से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- उन्हें फ्यूजिंग से रोकने के लिए दूसरों से दूर समुच्चय की स्थिति। किसी भी अतिरिक्त कारकों के बिना कमरे के तापमान पर संस्कृति के 24 एच के भीतर, परिपक्व म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड को विभेदित एपिथेलियम की सतह को कवर करने वाले सिलिया को पीटने की कार्रवाई के साथ घुमाने के लिए देखा जा सकता है
5. (वैकल्पिक) ऑर्गेनॉइड विकसित करने की उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव इमेजिंग
- माइक्रोइंजेक्शन के लिए एमआरएनए तैयार करें।
- ऑर्गेनॉइड गठन के प्रारंभिक चरण में होने वाले एपिथेलिलाइजेशन की कल्पना करने के लिए, एपिथेलियल-विशिष्ट ज़ोनुला ओस्लुडेन्स प्रोटीन-1 (जेडओ-1) के लिए और पीसी 2-ज़ो 1-आरएफपी और पीसी2-मेम-जीएफपी प्लाज्मिड्स (लांस डेविडसन से एक उपहार) को बढ़ाना द्वारा कोशिका झिल्ली को रेखांकित करने के लिए तैयार करें।
- प्लाज्मिड डीएनए को निकालें और रैखिक करें, और फिर विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट में एक SP6/T7 का उपयोग करके छाया हुआ एमआरएनए को टाइप करें।
- लिखित एमआरएनए को अलीकोट करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एक निषेचित भ्रूण में mRNA माइक्रोइंजेक्ट
- 1x एमबीएस में 3% फिकोल में निषेचित भ्रूण रखें।
- एक माइक्रो लोडर टिप का उपयोग करके एक खींचा हुआ ग्लास सुई (10\u201230 μm के भीतरी व्यास के साथ एक लंबी और ठीक पतला सुई टिप) का उपयोग करके एमआरएनए का 3-4 माइक्रोन लोड करें।
- एक माइक्रोइंजेक्टर के लिए सुई संलग्न करें और माइक्रोइंजेक्शन के लिए mRNA की एक निरंतर मात्रा देने के लिए समय और दबाव को समायोजित करें।
- जानवरों के ध्रुव की एपिकल सतह के नीचे एमआरएनए इंजेक्ट करें। कॉर्टेक्स के विस्तार के कारण होने वाला एक अलग पीला रंग का गोलाकार पैच माइक्रोइंजेक्शन के समय दिखाई देता है।
- इंजेक्शन भ्रूण को 1/3X एमबीएस में स्थानांतरित करें और उन्हें 9.5 चरण में संस्कृति दें।
- फ्लोरोसेंटी लेबल वाले भ्रूण को फ्लोरोसेंस स्टीरियोस्कोप (जीएफपी (488/510) और आरएफपी (532/588) के लिए उत्तेजन/उत्सर्जन सेटिंग्स के तहत ले लीजिए ।
- चरण 1.3 के साथ आगे बढ़ें।
- विकास के वांछित चरण तक ऑर्गेनॉइड (धारा 3 और 4) को इकट्ठा और संस्कृति।
- लाइव इमेजिंग करें।
- सिलिकॉन तेल का उपयोग करके एक कस्टम-मिल्ड ऐक्रेलिक कक्ष में कवर ग्लास चिपकाकर ग्लास-बॉटम इमेजिंग चैंबर तैयार करें।
नोट: संस्कृति मीडिया के रिसाव को रोकने के लिए चैंबर को कसकर सील करें। - डीएफए के साथ इमेजिंग चैंबर भरें।
- एक कंटेनर से एक हेक्सागोनल ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) ग्रिड (75 जाल) उठाओ संदंश का उपयोग कर और ग्रिड के किनारे करने के लिए तेल की एक छोटी राशि लागू होते हैं।
नोट: जाल का आकार कुल के व्यास से छोटा होना चाहिए ताकि कुल ग्रिड पर बैठता है। - इमेजिंग चैंबर के नीचे करने के लिए TEM ग्रिड सुरक्षित करने के लिए हल्के से नीचे दबाएं।
- एग्रीगेट्स को इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरित करें और उन्हें ग्रिड के भीतर रखें।
नोट: तेल के बगल में समुच्चय स्थिति से बचें। प्रयोग के दौरान, समुच्चय को शारीरिक संपीड़न को रोकने के लिए कक्ष के नीचे से संपर्क किए बिना टेम ग्रिड पर बैठना चाहिए। - डीएफए के साथ इमेजिंग चैंबर भरें और इसे कवर ग्लास और तेल से सील करें।
नोट: इमेजिंग के दौरान किसी भी अशांति या आंदोलन को रोकने के लिए कक्ष को बिना हवा के बुलबुले के साथ एयरटाइट किया जाना चाहिए। - म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड गठन की प्रगति का पालन करने के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्रित होने वाले सीक्वल (2 एचपीए से) की समय-चूक जेड-स्टैक छवियों को एकत्र करें।
नोट: हम आम तौर पर गतिशील सेल व्यवहार का पालन करने के लिए 20X उद्देश्य का उपयोग करके हर 15 मिनट में ~ 120 माइक्रोन-मोटी जेड-स्टैक एकत्र करते हैं, लेकिन इन विनिर्देशों को प्रयोगों के लक्ष्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
- सिलिकॉन तेल का उपयोग करके एक कस्टम-मिल्ड ऐक्रेलिक कक्ष में कवर ग्लास चिपकाकर ग्लास-बॉटम इमेजिंग चैंबर तैयार करें।
6. (वैकल्पिक) निर्धारण और इम्यूनोदाता द्वारा ऑर्गेनॉइड विकसित इमेजिंग
- विकास के वांछित चरण में ऑर्गेनॉइड को एक स्थिर समाधान से भरे कांच की शीशी में स्थानांतरित करके ठीक करें।
नोट: पूर्ण निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए नमूनों की मात्रा और 20 गुना है कि फिक्सेटिव समाधान की मात्रा जोड़ें । एक नटेटर पर निम्नलिखित प्रक्रियाओं को करें जब तक कि अन्यथा नोट न किया जाए। सामान्य तौर पर पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ ऑर्गेनॉइड तय किए जाते हैं। हालांकि, विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए विभिन्न फिक्सेटिव्स की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, हमने एफ-ऐक्टिन और एसिटिलेटेड ट्यूबलिन का पता लगाने के लिए पीबीएस में 0.25% ग्लूटारल्डिहाइड के साथ 4% पीएफए का उपयोग किया। इंटेइलेक्टिन (आईटीएलएन) और जेडओ-1 का पता लगाने के लिए, ऑर्गेनॉइड को -20 डिग्री सेल्सियस पर रात के लिए बर्फ-कोल्ड डेंट के समाधान (4:1 मेथनॉल: डाइमेथाइल सल्फॉक्साइड) के साथ तय किया जाता है। डेंट के फिक्स्ड ऑर्गेनॉइड को धोने से पहले क्रमिक रूप से निर्जलित किया जाना चाहिए (चरण 6.3)। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन और धोने के लिए अवधि विशिष्ट जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। - कमरे के तापमान (आरटी) पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ऑर्गेनॉइड को ठीक करें।
- आरटी में 15 मिनट के लिए पीबीएसटी (0.1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पीबीएस) के साथ 3 बार धोएं।
- आरटी में 1 घंटे के लिए पीबीएसटी (पीबीएसजीटी) में 10% बकरी सीरम के साथ अविशिष्ट बाध्यकारी ब्लॉक करें।
- पीबीएसजीटी में प्राथमिक एंटीबॉडी (1:200) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
- आरटी में 15 मिनट के लिए पीबीएएसटी के साथ 3 बार धोएं।
- PBSGT में माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200) के साथ इनक्यूबेट 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
- आरटी में 15 मिनट के लिए पीबीएएसटी के साथ 3 बार धोएं।
- फिक्स्ड और इम्यूनो दाग वाले ऑर्गेनॉइड को इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरित करें और कॉन्फोकल इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें।
Representative Results
यह मानकीकृत प्रोटोकॉल14की खेती के 24 घंटे के भीतर प्रारंभिक गैस्ट्रूला चरण एक्स. लेविस भ्रूणों से अलग बहुपंतीय जनकों से एक म्यूकोसिलीरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करता है । एकत्र गहरी ectoderm कोशिकाओं को स्वयं इकट्ठा करने के लिए एक गैर चिपकने वाला पीसीआर ट्यूब में एक कुल फार्म और सतह epithelialization और goblet सेल भेदभाव से गुजरना । समुच्चय की नई एपिथेलियल सतह आंतरिक कोशिकाओं (जैसे, बहुसाइलेटेड और अन्य सहायक कोशिकाओं) को इंटरकैल्यूट करने के लिए वीवो में पाए जाने वाले देशी एपिथेलियम के समान सब्सट्रेट प्रदान करती है और म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड(चित्रा 1ए, बी)बनाने के लिए विकसित होती है। एकत्रीकरण के बाद 24 घंटे के भीतर, स्वयं-संगठित म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड एक परिपक्व एपिडर्मिस को पुनर्जीवित करते हैं जो टैडपोल के एपिडर्मिस से अविवेच्य है। ऑर्गेनॉइड में पूरी तरह से विभेदित एपिथेलियम (केराटिन), बलगम-स्राव करने वाली गोबलेट कोशिकाएं (आईटीएलएन), बहुसांश कोशिकाएं (एसिटिलेटेड ट्यूबलिन), और छोटी स्राव कोशिकाएं (मूंगफली एग्लुटिनिन, पीएनए)(चित्रा 1C)शामिल हैं।
इम्यूनोस्टेटिंग के साथ विभिन्न सेल प्रकारों के विकास की पुष्टि करने के अलावा, ऑर्गेनॉइड विकास की गतिशीलता लाइव इमेजिंग(चित्रा 2 ए)द्वारा अपनाई जा सकती है। ऑर्गेनॉइडगठन (चित्रा 1 बी)के प्रारंभिक चरण में उभरने वाले एपिथेलिलाइजेशन की जांच करने के लिए, हमने फ्लोरोसेंटली टैग किए गए टाइट जंक्शन प्रोटीन (जेडओ-1-आरएफपी) और झिल्ली स्थानीयकरण प्रोटीन (मेम-जीएफपी) को व्यक्त करके भ्रूण को लेबल किया। दोहरी लेबलिंग के साथ, जेडओ-1-सकारात्मक तंग जंक्शन गठन के अनुक्रमिक चरणों को चिह्नित किया जा सकता है और एपिथेलिलाइजेशन(चित्र 2) के दौरानमात्रात्मक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एपिथेलाइजेशन (0 मिनट पर) के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं(चित्रा 2B,हरे रंग) के लिए, सेल-सेल आसंजन के कुछ क्षेत्रों में ZO-1(चित्रा 2B,हरे तीर) का विराम्ता बिखरा हुआ है। इसके विपरीत, अन्य क्षेत्रों में पूरी तरह से इकट्ठे हुए हैं, समीपस्थ ZO-1 अभिव्यक्ति(चित्रा 2B,पीले तीर)। समय के साथ, विराम चिह्न और समीपस्थ तंग जंक्शनों(चित्रा 2B,हरे तीर) बनाने के लिए कनेक्ट, और समीपस्थ तंग जंक्शन सेल डिवीजन(चित्रा 2B,पीले तीर) के दौरान भी अपनी आकृति विज्ञान को बनाए रखते हैं। जैसे-जैसे तंग जंक्शन परिपक्व होते हैं, कोशिकाएं गतिशील रूप से ऑर्गेनॉइड(चित्रा 2सी, डी)के एपिकल विमानों के साथ सतह के बाहर और बाहर जाती हैं। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड(चित्रा 2 बी,रंग-कोडित कोशिकाओं) की सतह पर स्थानिक रूप से कोशिकाओं को ट्रैक करके, बहु-पैमाने पर विश्लेषण संभव है, जिसमें व्यक्तिगत समयकथा से लेकर समीपस्थ तंग जंक्शन, सेल-सेल सीमाएं और ऑर्गेनॉइड के भीतर सेल आबादी के सबसेट शामिल हैं।
चित्रा 1: म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड का उत्पादन।
(क) एक्स लेविस भ्रूण से गहरे ectoderm समुच्चय को इकट्ठा करने के लिए प्रोटोकॉल दिखा रहा एक योजनाबद्ध । (ख)मल्टीपॉटेंट डीप ectoderm कोशिकाओं (क्रॉस-सेक्शनल व्यू) से निकलने वाले म्यूकोसिलिएरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड गठन के मॉडल के लिए एक योजनाबद्ध। सतह पर तैनात कोशिकाएं एपिथेलियल कोशिकाओं में पारगमन करती हैं और गोबलेट कोशिकाओं में अंतर करती हैं। सिलिएटेड कोशिकाओं, गुप्त कोशिकाओं और आयनोसाइट्स को सतह में विकिरण रूप से इंटरकैलेट करना और एक परिपक्व एपिडर्मिस को पुनर्जीवित करना। (C)आईटीएलएन (बलगम उत्पादक गोबलिट कोशिकाओं), एसिटिल्टेड ट्यूबलिन (सिलिएटेड कोशिकाओं), पीएनए (छोटे गुप्त कोशिकाओं), और केराटिन (एपिथेलियल कोशिकाओं) में ऑर्गेनॉइड में 24 एचपीए (ऊपरी पैनल) और टैडपोल एपिडरमिस (लोअर पैनल) के लिए म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम इम्यूनोटांग का अधिकतम जेड-प्रोजेक्शन । स्केल बार = 30 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: ऑर्गेनॉइड विकसित करने की लाइव इमेजिंग।
(क)लाइव ऑर्गेनॉइड (स्केल करने के लिए नहीं) के लिए इमेजिंग चैंबर का एक योजनाबद्ध। (ख)डीप एक्टोडेर्म सेल से एकत्र किए गए कॉन्फोकल स्टैक के समय-चूक दृश्य 2.5 एचपीए से जेडओ-1-आरएफपी और मेम-जीएफपी को व्यक्त करते हैं। स्केल बार = 20 माइक्रोन। कोशिकाओं को समय के साथ ट्रैकिंग के लिए छद्म रंग का होता है। हरे रंग की कोशिका में विभिन्न सेल आसंजन तांतोसे होते हैं, जिनमें से एक उत्तरोत्तर विकसित होने वाले जेडओ-1 सकारात्मक आसंजन (हरे तीर) और समय के साथ समीपस्थ जेडओ-1 सकारात्मक आसंजन (पीले तीर) को बनाए रखता है। (C, D) ZO-1-RFP-व्यक्त गहरी ectoderm सेल समुच्चय की समय-चूक कॉन्फोकल छवियों को दिखाते हैं कि मूल रूप से इंटरकैलिंग कोशिकाएं सतह (सी, येलो स्टार) में चलती हैं और समुच्चय (डी, ब्लू स्टार) के अंदर चलती हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
एक्स लेविस भ्रूण की गहरी ectoderm कोशिकाओं से उत्पन्न म्यूकोसिलीरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड विट्रो में बहुपसंत जनकों के एपिथेलिलाइजेशन और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। इन विट्रो ऑर्गेनोजेनेसिस13 के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यापक रूप से अपनाए जाने वाले पशु कैप परख16 और म्यूकोसिलिएरी एपिथेलिया15,17,22 के विकास के विपरीत जो अक्षुण्ण ectoderm का उपयोग करते हैं, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत गहरे ectoderm-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड सतह एपिथेलियम14के ऊतकों के यांत्रिकी संचालित पुनर्जनन चरणों की निगरानी करने के लिए एक अलग अवसर प्रदान करते हैं। लगभग 2 एचपीए में, नए उत्पन्न जेडओ-1 सकारात्मक एपिथेलियल कोशिकाएं(चित्रा 2)ऑर्गेनॉइड की एपिकल सतह पर दिखाई देने लगती हैं और पूरे ऑर्गेनॉइड को कवर करने के लिए अपनी जनसंख्या में वृद्धि करती हैं क्योंकि ऊतक जमना या अनुपालन14को कम करता है। बलगम उत्पादक गोबलेट कोशिकाओं के लिए एपिथेलियम और बाद में वंश विनिर्देशों का पुनर्जनन एक दिन के भीतर रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति मीडिया में अनायास आगे बढ़ता है। ये तेजी से विकसित होने वाले म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड एपिथेलियल पुनर्जनन के प्रगतिशील चरणों के दौरान, उच्च-संकल्प में वास्तविक समय में गतिशील कोशिका व्यवहार की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। वे म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम विकास, होयोस्टेसिस और संबंधित रोगों2, 9, 23के दौरान उत्पन्न होने वाले मूलभूत प्रश्नोंकीजांच करने में भी सक्षम होते हैं। विशेष रूप से, ऑर्गेनॉइड14 में पहचाने गए एपिथेलियल गॉबलेट सेल अग्रदूतों में संक्रमण के दौरान गहरी जनक कोशिकाओं की यांत्रिक संवेदनशीलता असामान्य बेसल भेदभाव से जुड़े श्वसन रोगों को जोड़ने का काम कर सकती है जहां बलगम-स्राव वाली गोबलेट कोशिकाएं अधिक या कम उत्पादित23हैं।
हालांकि यह प्रोटोकॉल इन ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदान करता है, प्रयोगों में सफलता के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हैं। पशु टोपी से गहरी ectoderm कोशिकाओं के अलगाव के दौरान सतही एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रदूषण को रोकने के लिए, एक स्टीरियोस्कोप के तहत कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त डीएफए में रखा पशु टोपी की निगरानी करनी चाहिए और पशु टोपी के अंधेरे-वर्णक सतही परत के अलगाव को शुरू करने के लिए सही समय का पता लगाना चाहिए । यदि ऊतक को कैल्शियम और मैग्नीशियम-मुक्त डीएफए में बहुत लंबे समय तक रखा जाता है, तो पूरे ऊतक गहरे और सतही कोशिकाओं के बीच अलग और भेद करेंगे, फिर गहरे ectoderm समुच्चय के लिए असंभव होगा। गहरे ectoderm समुच्चय में सतही कोशिकाओं की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट रूप से माइक्रोसर्जरी से पहले एनएचएस-रोडामाइन (चरण 1.414)के साथ भ्रूण की एपिकल सतह को लेबल करने की सलाह देते हैं; यदि वे परिणामी ऑर्गेनॉइड में मौजूद हैं तो यह सतह कोशिकाओं की आसान पहचान की अनुमति देगा। चूंकि एपिथेलियल पुनर्जनन ऊतक यांत्रिकी14द्वारा विनियमित है, इसलिए स्वयं-आयोजन ऑर्गेनॉइड के लिए अनपेक्षित बल उत्पादन से बचना आवश्यक है। विशेष रूप से, हम TEM ग्रिड के किनारों पर समुच्चय रखकर लाइव इमेजिंग के दौरान इमेजिंग चैंबर के ग्लास बॉटम के साथ संपर्क से बचने का सुझाव देते हैं क्योंकि यह लाइव समुच्चय की इमेजिंग विंडो (चरण 5.1.2.) के साथ मुफ्त संपर्क के लिए अनुमति देता है। यह इन विट्रो-म्यूकोसिलीरी एपिथेलियम के लिए स्व-संगठित 3डी मॉडल एपिथेलियम के पुनर्जनन और गोबलेट कोशिकाओं के वंश विनिर्देश के दौरान उत्पन्न होने वाले मूलभूत प्रश्नों का उत्तर देने के लिए एक ट्रैक्टेबल उपकरण के रूप में काम करेगा।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम किम लैब और लांस डेविडसन के सदस्यों को उनकी टिप्पणियों और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को इंस्टीट्यूट फॉर बेसिक साइंस (आईबीएस-आर0250वाई1) से एचवाईके के लिए यंग साइंटिस्ट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
| Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Confocal Laser Microscope | |||
| Stereoscope | |||
| Tools | |||
| Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
| Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
| Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
| hCG injection | |||
| human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
| MBS solution | |||
| 10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
| Phenol-red | Sigma | P0290 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
| dejellying solution | |||
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
| Ficoll solution | |||
| Ficoll | Sigma | F4375 | |
| DFA solution | |||
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| 0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
| Bicine | Sigma | B3876 | |
| Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
| Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
| Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
| mRNA in vitro transcription | |||
| SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
| mRNA microinjection | |||
| Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
| Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| PCR tube coating | |||
| BSA | Thermofisher | 26140079 | |
| PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
| Imaging | |||
| Custom-milled acrylic chamber | |||
| Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
| SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
| SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
| Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
| Fixation | |||
| 20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
| 2ml screw top-cap vial | |||
| Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
| Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Primary antibody (1:200) | |||
| acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
| Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
| Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
| ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| Vectors | |||
| pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
| pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |
References
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