Xenopus भ्रूण कोशिकाओं से म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड: पीढ़ी, संस्कृति और उच्च संकल्प लाइव इमेजिंग

म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम हमारे शरीर के आंतरिक अंगों को लाइन करता है और विदेशी कणों को साफ करके रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल 24 घंटे में भ्रूणीय कोशिका व्युत्पन्न म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करना संभव बनाता है। हमारी विधि का प्रमुख लाभ यह है कि हम ऑर्गेनॉइड की सतह पर सेल संक्रमण की लाइव प्रगति की निगरानी कर सकते हैं।

विकासशील ऑर्गेनॉइड के लिए यह प्रजनन योग्य, स्केलेबल और रैपिड प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम के जीव विज्ञान के लिए बुनियादी सवालों का समाधान करने की अनुमति देगा। शुरू करने के लिए, उत्तेजित मादा मेंढकों से मैन्युअल रूप से अंडे एकत्र करके और विट्रो निषेचन में प्रदर्शन करके X.Laevis भ्रूण प्राप्त करें। डी-जेली 2% सिस्टीन में कोमल आंदोलन के साथ निषेचित भ्रूण, एक तिहाई एक्स में संशोधित है Barth खारा के बारे में पांच मिनट के लिए ।

संस्कृति पसंदीदा तापमान पर एक तिहाई XMBS में भ्रूण जब तक चरण 10 के पहले संकेत का पता चला रहे हैं, जैसे वनस्पति दृश्य में ब्लास्टोपोर के आसपास अंधेरे वर्णक कोशिकाओं की उपस्थिति के रूप में । चुनें और भ्रूण इकट्ठा के रूप में वे एक स्टीरियोस्कोप के तहत बाल उपकरण का उपयोग कर प्रारंभिक चरण 10 तक पहुंचने । चयनित भ्रूण को डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट के साथ डीएफए से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।

फिर भ्रूण के जानवर पक्ष को बाधित किए बिना वनस्पति पक्ष से तेज संदंश का उपयोग करके भ्रूण की विटेललाइन झिल्ली को हटा दें। पशु टोपी को अलग करने के लिए, भ्रूण के जानवर पक्ष को स्थिति में रखें। नेत्रहीन पशु टोपी की सीमा का अनुमान है और एक बाल चाकू के साथ किनारे के साथ पहला चीरा बनाने के लिए, चाकू जावक खींच कटौती करने के लिए ।

पशु टोपी को उत्पादित करने के लिए छोटी कटौती की एक श्रृंखला बनाने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। मेसोडर्म अग्रदूतों को शामिल करने से रोकने के लिए बाल चाकू का उपयोग करके पशु टोपी के मोटे स्तरित किनारे को ट्रिम करें। एनिमल कैप से डीप एक्टोडेर्म सेल्स को अलग करने के लिए, एक्साइज्ड एनिमल कैप्स को डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट के साथ कैल्शियम और मैग्नीशियम-फ्री डीएफए से भरे पेट्री डिश में ट्रांसफर करें ।

पशु की ओर का सामना करने के लिए पशु टोपियां स्थिति, अन्य explants से एक उदार दूरी बनाए रखने। पांच से दस मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर एक स्टीरियोस्कोप के नीचे एक्सप्लांट की निगरानी करें। एक बार ढीली गहरी कोशिकाओं को अंधेरे-वर्णक सतही परत के किनारे से जारी किया गया है, तो सतही परत को हल्के रंग की गहरी एकोडर्म कोशिकाओं से दूर उठाना शुरू करें।

ध्यान से एक बाल चाकू के साथ सतही परत अलग, किनारे पर शुरू। फिर जितना संभव हो उतना कम कैल्शियम और मैग्नीशियम-मुक्त डीएफए के साथ गहरी एक्टोडेर्म कोशिकाओं को इकट्ठा करें। डीएफए के 200 माइक्रोलीटर युक्त गैर-चिपकने वाली पीसीआर ट्यूबों में गहरी ectoderm कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और स्थानांतरित कोशिकाओं को तितर-बितर करने के लिए मीडिया को दो से तीन बार धीरे से पिपेट करें।

ट्यूबों को बंद करें और नीचे सहज एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए उन्हें सीधा रखें। स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एकत्रीकरण प्रक्रिया की निगरानी करें। कोशिकाएं आम तौर पर एक घंटे के भीतर पीसीआर ट्यूब के तल पर इकट्ठा होती हैं और आकार के आधार पर दो से तीन घंटे के भीतर गोलाकार समुच्चय में इकट्ठा होती हैं।

म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड के विकास के दौरान लाइव इमेजिंग या दवा परीक्षण करने के लिए, बढ़े हुए सुझावों के साथ लगे 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके दो घंटे के बाद एकत्रीकरण पर एकत्र करें। एग्रीगेट्स को संस्कृति में म्यूकोसिलिएरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड में विकसित करने की अनुमति देने के लिए, उन्हें पीसीआर ट्यूब से पांच घंटे बाद एकत्र करें और उन्हें डीएफए से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। फ्यूजिंग को रोकने के लिए एक दूसरे से दूर समुच्चय की स्थिति।

कमरे के तापमान पर संस्कृति के 24 घंटे के भीतर, किसी भी अतिरिक्त कारकों के बिना, परिपक्व म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड को पिटाई सिलिया के कारण घूर्णन देखा जा सकता है जो विभेदित एपिथेलियम की सतह को कवर करता है। सिलिकॉन तेल के साथ एक कस्टम मिल्ड ऐक्रेलिक कक्ष में कवर ग्लास चिपकाकर एक ग्लास-बॉटम इमेजिंग चैंबर तैयार करें, संस्कृति मीडिया के रिसाव को रोकने के लिए कक्ष को कसकर सील करें, फिर डीएफए के साथ इमेजिंग चैंबर को भरें। एक हेक्सागोनल ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या TEM ग्रिड संदंश का उपयोग कर उठाओ और ग्रिड के किनारे करने के लिए तेल की एक छोटी राशि लागू होते हैं ।

इमेजिंग चैंबर के नीचे करने के लिए TEM ग्रिड सुरक्षित करने के लिए हल्के से नीचे दबाएं। एग्रीगेट्स को इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरित करें और उन्हें ग्रिड के भीतर रखें। डीएफए के साथ चैंबर भरें और इसे कवर ग्लास और तेल से सील करें।

म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड गठन की प्रगति का पालन करने के लिए, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकत्रित होने वाले सीक्वल-स्टैक छवियों को एकत्र करें। म्यूकोसिलियरी एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड प्रारंभिक गैस्ट्रुला चरण X.Laevis भ्रूण के बहुपेंट प्रोजेनिटर से उत्पन्न हुए थे। ऑर्गेनॉइड में एक परिपक्व एपिडर्मिस होता है जो एक टैडपोल से अविवेच्य होता है जिसमें पूरी तरह से विभेदित एपिथेलियम, बलगम स्राव गोब्लेट कोशिकाएं, बहुसांश कोशिकाएं और छोटी गुप्त कोशिकाएं शामिल हैं।

लाइव इमेजिंग के बाद ऑर्गेनॉइड विकास की गतिशीलता। ऑर्गेनॉइड गठन के प्रारंभिक चरण में उभरने वाले एपिथेलिलाइजेशन की जांच करने के लिए, भ्रूण को फ्लोरोसेंटली टैग किए गए तंग जंक्शन प्रोटीन और झिल्ली स्थानीयकरण प्रोटीन के साथ लेबल किया गया था। दोहरी लेबलिंग के साथ जेडओ-1 सकारात्मक तंग जंक्शन गठन के अनुक्रमिक चरणों को चिह्नित किया जा सकता है और एपिथेलिलाइजेशन के दौरान मात्रात्मक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है।

सेल-सेल आसंजन के कुछ क्षेत्रों में एपिथेलिलाइजेशन के विभिन्न चरणों में जेडओ-1 का समय्टा बिखरा हुआ है। इसके विपरीत, अन्य क्षेत्रों ने पूरी तरह से समीपस्थ ZO-1 अभिव्यक्ति को इकट्ठा किया है। समय के साथ विराम चिह्न और समीपस्थ तंग जंक्शनों के रूप में कनेक्ट होता है, जो सेल डिवीजन के दौरान भी उनकी आकृति विज्ञान को बनाए रखते हैं।

जैसे-जैसे तंग जंक्शन परिपक्व होते हैं, कोशिकाएं गतिशील रूप से ऑर्गेनॉइड के एपिकल विमानों के साथ सतह के बाहर और बाहर जाती हैं। बहु-पैमाने पर विश्लेषण कोशिकाओं को अलग करने वाले ऑर्गेनॉइड की सतह पर स्थानिक-अस्थायी रूप से ट्रैकिंग करके संभव है। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, अलग-थलग पशु टोपी के अंधेरे-वर्णक पक्ष को सामने रखना याद रखें और इसे स्टीरियोस्कोप के नीचे मॉनिटर करें।

कैल्शियम/मैग्नीशियम मुक्त डीएफए मीडिया में सही समय पर पशु टोपी की सतही परत को अलग करना महत्वपूर्ण है । यह सरल प्रोटोकॉल गतिशील कोशिका व्यवहार के साथ-साथ म्यूकोसिलियरी एपिथेलियम को विनियमित करने वाले आणविक और भौतिक तंत्रों का अध्ययन करने के आसान तरीके प्रदान करता है।