Summary
We beschrijven een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van mucociliarie epitheelorganoïden uit diepe ectoderm cellen geïsoleerd van Xenopus laevis embryo's. De multipotige voorlopers regenereren epitheel bekercelprecursoren en laten live tracking van de initiatie en progressie van de celovergangen op het oppervlak van organoïden toe.
Abstract
Mucociliary epitheel biedt de eerste verdedigingslinie door het verwijderen van vreemde deeltjes door de werking van slijmproductie en cilia-gemedieerde klaring. Veel klinisch relevante gebreken in het mucociliary epitheel worden afgeleid als ze diep in het lichaam voorkomen. Hier introduceren we een kanseerbare 3D-model voor mucociliary epitheel gegenereerd door multipotente voorlopers die microchirurgisch geïsoleerd waren van Xenopus laevis embryo's. De mucociliary epitheelorganoïden zijn bedekt met nieuw gegenereerd epitheel uit diepe ectoderm cellen en later versierd met verschillende patroon multiciliated cellen, secretoire cellen, en slijm-producerende bekercellen die niet te onderscheiden zijn van de inheemse opperhuid binnen 24 uur. De volledige sequenties van dynamische celovergangen van mesenchymale naar epitheliale die ontstaan op het apicale oppervlak van organoïden kunnen worden gevolgd door hoge resolutie live beeldvorming. Deze in vitro gekweekte, zelforganiserende mucociaire epitheel organoïden bieden duidelijke voordelen bij het bestuderen van de biologie van mucociënie epitheel met een hoog rendement in de generatie, gedefinieerde cultuuromstandigheden, controle over aantal en grootte, en directe toegang voor live beeldvorming tijdens de regeneratie van de gedifferentieerde epitheel.
Introduction
Letsel, infectie, en ziekte van mucociliaire epitheel worden geassocieerd met verminderde productie en klaring van slijm die vaak wordt gevonden in longaandoeningen zoals chronische obstructieve longziekte, astma, cystische fibrose, bronchiectasis, en primaire ciliary dyskinesie1,2,3,4. Een recente vooruitgang in organoïde technologie, bijvoorbeeld, de basale cel afgeleide long organoïde genaamd tracheosfeer die recapituleert de regeneratie van mucocieleïteit epitheel ontstaan als een veelbelovend model met therapeutisch potentieel1,5,6. Het gebruik ervan is momenteel echter beperkt, deels door gebrek aan de gedefinieerde cultuuromstandigheden en de lage efficiëntie in organoïde producties. Mucociliary epitheel in de menselijke luchtwegen en kikker opperhuid zijn opmerkelijk vergelijkbaar in weefselmorfologie, cellulaire samenstelling, en de functie7,8,9,10,11,12. In beide organismen biedt mucociliary epitheel eerstelijnsverdediging door slijm en antimicrobiële stoffen te afscheiden en schadelijke deeltjes en ziekteverwekkers te wissen door de gesynchroniseerde werking van trilharen.
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om mucociliarie epitheelorganoïden te genereren met behulp van de multipotige voorlopers van Xenopus laevis embryo's13,14. Eerder meldden we14 dat bij afwezigheid van exogene groeifactoren en de extracellulaire matrix, de microchirurgisch geïsoleerde diepe cellen uit het vroege gastrulastadium ectoderm spontaan assembleren in aggregaten, epitheel regenereren op het oppervlak en rijpen tot mucociliary epitheel door multiciliated en andere accessoirecellen binnen 24 uur te intercalating. Naast de snelle ontwikkeling biedt dit protocol een duidelijke mogelijkheid om rechtstreeks toegang te krijgen tot de overgangen van multipotente diepe ectodermcellen naar epitheelbletcelverervers die de regeneratiestappen van een verstoord epitheel14 samenvatten die niet beschikbaar zijn uit intacte embryo's en ectoderm (ook bekend als de dierencap)15,16,17. Het aantal en de grootte van de geproduceerde organoïden zijn schaalbaar met een hoge efficiëntie door het controleren van de uitgangsmaterialen van Xenopus embryo's. Organoïden in drijvende cultuur kunnen gemakkelijk worden gesorteerd en overgebracht in het gewenste stadium voor verdere analyses, waaronder hoge resolutie beeldvorming, mechanische testen, medicamenteuze behandeling en genetische karakterisering14. Deze spontane, weefselmechanica-gedreven regeneratie van het epitheel op het oppervlak van embryonale celaggregaten resulteert in mucociliary epitheel organoïden en bieden een nieuw driedimensionaal (3D) model om de biologie van het mucociliarie epitheel te bestuderen.
Protocol
Dierlijk gebruik en experimentele protocollen werden goedgekeurd door de institutional animal care and use committee (IACUC) van het Institute for Basic Science (IBS 18-01) en Korea Advanced Institute of Science and Technology (KA2017-22).
1. Embryo's
- Verkrijg X. laevis embryo's met behulp van een standaardprocedure: verzamel handmatig eieren van gestimuleerde vrouwelijke kikkers en voer in vitro fertilisatieuit 18,19.
- Ontgeidigd embryo's met zachte agitatie voor ongeveer 5 min in 2% cysteïne in 1/3x gemodificeerde Barth's zoutoplossing (MBS; zie het recept voor 1X MBS hieronder) op pH 819.
- Optionele stap voor live beeldvorming: om fluorescerend specifieke eiwitten te labelen en hun dynamiek in de organoïde te observeren, ga dan door naar sectie 5.
- (Optioneel) Om de verontreiniging van oppervlakkige ectodermcellen in organoïden te controleren, labelt u het apicale oppervlak van de embryo's met NHS-rhodamine in fase 914. Incubeerembryo's in 1 mg/mL NHS-Rhodamine in 1/3x MBS (pH 9.0) gedurende 30 minuten met zachte nootvorming. Was embryo's drie keer door over te dragen op een petrischaal gevuld met 1/3x MBS gedurende 15 minuten.
- Kweek het embryo in 1/3x MBS bij de gewenste temperatuur (14-26 °C) tot de eerste tekenen van fase 10 worden gedetecteerd (d.w.z. het verschijnen van donkere gepigmenteerde cellen rond de blastopore bij de plantaardige weergave).
2. Voorbereiding van microchirurgische instrumenten, oplossingen en kweekvaten
- Bereid de benodigde gereedschappen voor, waaronder een paar chirurgische grade tangen en haargereedschappen (haarlus en haarmes) voor microchirurgie20.
- Bereid de volgende kweekmedia voor op embryo's: 1/3X MBS, waarbij 1X MBS wordt gemaakt met NaCl (88 mM), KCl (1 mM), NaHCO3 (2,4 mM), MgSO4 (0,82 mM), Ca(NR3)2 (0,33 mM), CaCl2 (0,41 mM) en HEPES (10 mM). Pas de pH aan op 7,4 met 10 M NaOH.
LET OP: Optioneel: voeg druppels fenolrood toe om pH aan te geven. - Bereid de volgende kweekmedia voor op embryonale weefsels en organoïden: Danilchik's for Amy (DFA)21 aangevuld met verse 1% antibiotica en antimycotische oplossing. Bereid DFA voor met NaCl (53 mM), Na2CO3 (5 mM), kaliumgluconaat (4,5 mM), natriumgluconaat (32 mM), CaCl2 (1 mM) en MgSO4 (1 mM). Pas de pH aan op 8,3 met korrelige Bicine. Filter DFA (0,2 μm bottle-top filter), aliquot en bewaar het op -20 °C.
- Bereid calcium- en magnesiumvrije DFA voor het scheiden van diepe cellen van ectoderm met behulp van het bovenstaande recept en het weglaten van CaCl2 en MgSO4. Aliquot en bewaren op-20 °C.
- Bereid niet-klevende PCR-buizen voor op embryonale celaggregatie.
- Om spontane aggregatie van de geïsoleerde embryonale cellen te induceren, bereidt u niet-klevende PCR-buizen door pcr-buizen met ronde bodem te coaten met 200 μL van 1% BSA (1 g BSA in 100 mL gedestilleerd water) 's nachts bij 4 °C of voor 2 uur bij kamertemperatuur. Elke buis zal worden gebruikt om een organoïde te monteren.
- Spoel BSA-gecoate PCR-buizen drie keer met DFA om eventuele resterende BSA te verwijderen.
- Vul PCR-buizen met 200 μL DFA.
3. Isolatie van diepe ectodermcellen
- Selecteer en verzamel embryo's als ze in een vroeg stadium 10 met behulp van haargereedschappen onder een stereoscoop.
- Breng met behulp van een wegwerptransferpipet de geselecteerde embryo's over in een met DFA gevuld petrischaaltje.
- Verwijder het vitelline membraan van de embryo's met behulp van scherpe tangen van de plantaardige kant zonder de dierlijke kant van het embryo te verstoren.
LET OP: Wees voorzichtig om te voorkomen dat embryo's aan de lucht worden blootgesteld. Het introduceren van luchtbellen in de oplossing of het brengen van embryo's aan de oppervlakte zal leiden tot het embryo te barsten. - Om de dierenkap te isoleren, plaatst u de dierlijke kant van het embryo omhoog.
- Visually schatten de omvang van de dierlijke dop worden uitgesneden en maak de eerste incisie langs de rand van het dier dop met een haarmes. Trek het haarmes naar buiten om een snede te maken.
- Herhaal stap 3.5 om een keten van kleine sneden te creëren om de dierenkap weg te snijden.
- Trim de dik gelaagde rand van de dierendop met behulp van een haarmes om de opname van mesoderm precursoren te voorkomen.
OPMERKING: Om te voorkomen dat de genezing en aggregatie van geïsoleerde dierenkappen, ga naar de volgende stap binnen 10 min. Typisch, isoleren we 5-10 dierlijke caps op een moment om meerdere organoïden te monteren. - Om diepe ectodermcellen te scheiden van de dierendop, breng je de uitgesneden dierendoppen over naar een petrischaaltje gevuld met calcium- en magnesiumvrije DFA met een wegwerptransferpipet. Let erop dat u tijdens de overdracht geen luchtbellen introduceert.
- Om voldoende ruimte te houden voor de volgende stappen, met behulp van de haargereedschappen, plaats de dierlijke doppen om de dierlijke kant naar boven gezicht en handhaven van een royale afstand van andere explants.
- Wacht 5-10 min en controleer vervolgens de explants onder een stereoscoop. Zodra losgemaakte diepe cellen zijn gevonden vanaf de rand van de donker gepigmenteerde oppervlakkige laag, beginnen met het opheffen van de oppervlakkige laag uit de buurt van de lichtgekleurde diepe ectoderm cellen met behulp van een haarmes onder de stereoscoop.
- Maak de oppervlakkige laag voorzichtig los (afpellen) met een haarmes, te beginnen aan de rand.
- Verzamel de diepe ectodermcellen met minimale aspiratie (10\u201215 μL) om de hoeveelheid calcium- en magnesiumvrije DFA te beperken die in de volgende stap naar de aggregatiemedia wordt overgebracht.
OPMERKING: Losstaande oppervlakkige cellen kunnen uit de media worden verwijderd om te voorkomen dat de resterende diepe ectodermcellen worden besmet.
4. Generatie van mucociele epitheelorganoïden
- Breng verzamelde diepe ectodermcellen over naar een niet-klevende PCR-buis met 200 μL DFA. Voorzichtig pipette de media (2\u20123 keer) om overgebrachte cellen in de PCR-buis te verspreiden.
LET OP: De timing aangewezen als uren na aggregatie (hpa) begint bij deze stap. De grootte van de resulterende organoïden wordt gecontroleerd door het aantal diepe ectodermcellen dat aan een PCR-buis wordt toegevoegd. Diepe ectodermcellen van een of meer dierendoppen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de gewenste grootte van de organoïde. - Sluit de PCR-buis. Houd PCR-buizen rechtop om spontane aggregatie aan de onderkant te induceren.
- Controleer het aggregatieproces onder een stereoscoop. Cellen verzamelen zich meestal binnen een uur onder aan de PCR-buis en assembleren binnen 2-3 uur in bolvormige aggregaten, afhankelijk van de grootte.
- Verzamel aggregaten bij 2 hpa met behulp van een pipet van 200 μL met vergrote tips (gesneden met gesteriliseerde schaar) om schade aan de aggregaten tijdens het verzamelen te voorkomen.
- Om aggregaten te laten uitgroeien tot de mucociliarie epitheel organoïde in de cultuur, verzamel sferische aggregaten uit de PCR buis op 5 hpa en breng ze over naar een DFA-gevulde petrischaal.
- Plaats de aggregaten ver van anderen om te voorkomen dat ze fuseren. Binnen 24 uur van de cultuur bij kamertemperatuur zonder toegevoegde factoren, volwassen mucociaire epitheelorganoïden kunnen worden waargenomen te draaien met de werking van het kloppen van trilharen die het oppervlak van de gedifferentieerde epitheel
5. (Optionele) live beeldvorming met hoge resolutie van de ontwikkeling van organoïden
- Bereid mRNA voor op microinjectie.
- Om de epithelialisatie te visualiseren die optreedt in het beginstadium van organoïde vorming, bereid mRNA voor op het epitheliaal-specifieke zonula occludens eiwit-1 (ZO-1) en voor het schetsen van de celmembranen door pCS2-ZO1-RFP en pCS2-mem-GFP plasmids (een geschenk van Lance Davidson) te versterken.
- Haal het plasmide DNA uit en lineariseer en transcribeer het afgetopte mRNA met behulp van een SP6/T7 in vitro transcriptiekit.
- Aliquot de getranscribeerde mRNA en bewaar het op -80 °C.
- Microinjecteren het mRNA in een bevrucht embryo
- Plaats bevruchte embryo's in 3% Ficoll in 1x MBS.
- Laad 3–4 μL mRNA met behulp van een microlader tip in een getrokken glazen naald (een lange en fijne taps toelopende naald tip met binnendiameter van 10\u201230 μm).
- Bevestig de naald aan een microinjector en pas de tijd en druk aan om een constant volume mRNA voor microinjectie te leveren.
- Injecteer het mRNA net onder het apicale oppervlak van de dierenpaal. Een duidelijke lichtgekleurde cirkelvormige patch die wordt veroorzaakt door de uitbreiding van de cortex is zichtbaar op het moment van microinjectie.
- Breng de geïnjecteerde embryo's over naar 1/3X MBS en kweek ze naar stadium 9.5.
- Verzamel de fluorescerende embryo's onder een fluorescentiesteroscoop (excitatie/emissie-instellingen voor GFP (488/510) en RFP (532/588)).
- Ga verder met stap 1.3.
- Verzamel en cultuur de organoïde (secties 3 en 4) tot het gewenste ontwikkelingsstadium.
- Voer live beeldvorming uit.
- Maak een glasbodem beeldkamer door het lijmen van een cover glas aan een op maat gefreesde acrylkamer met behulp van silicium vet.
LET OP: Sluit de kamer goed af om lekkage van de cultuurmedia te voorkomen. - Vul de beeldkamer met DFA.
- Kies een zeshoekige transmissie elektronenmicroscopie (TEM) raster (75 mesh) uit een container met behulp van tangen en breng een kleine hoeveelheid vet aan op de rand van het raster.
OPMERKING: De grootte van het gaas moet kleiner zijn dan de diameter van het aggregaat, zodat het aggregaat zich op het rooster bevindt. - Druk licht naar beneden om het TEM-raster aan de onderkant van de beeldkamer te beveiligen.
- Breng de aggregaten over naar de beeldkamer en plaats ze binnen het raster.
OPMERKING: Plaats de aggregaten niet naast het vet. Gedurende het hele experiment moeten de aggregaten op het TEM-raster zitten zonder contact op te nemen met de onderkant van de kamer om fysieke compressie te voorkomen. - Vul de beeldkamer met DFA en sluit deze af met een afdekglas en vet.
OPMERKING: De kamer moet luchtdicht zijn zonder luchtbellen om turbulentie of beweging tijdens de beeldvorming te voorkomen. - Om de progressie van mucociliarie epitheel organoïde vorming te volgen, verzamelen time-lapse z-stack beelden van aggregaten (van 2 hpa) met behulp van een confocale microscoop.
OPMERKING: We verzamelen meestal ~ 120 μm-dikke z-stacks om de 15 minuten met behulp van een 20X doelstelling om het dynamische celgedrag te volgen, maar deze specificaties moeten worden geoptimaliseerd voor het doel van experimenten.
- Maak een glasbodem beeldkamer door het lijmen van een cover glas aan een op maat gefreesde acrylkamer met behulp van silicium vet.
6. (Facultatief) Beeldvorming die organoïden ontwikkelt door fixatie en immunostaining
- Fix organoids in het gewenste stadium van ontwikkeling door ze over te brengen naar een glazen flacon gevuld met een fixatieve oplossing.
OPMERKING: Voeg een volume fixatieve oplossing toe dat >20 keer zo groot is als die van de monsters om volledige fixatie te garanderen. Voer de volgende processen uit op een nutator, tenzij anders vermeld. In het algemeen worden organoïden gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Er kunnen echter verschillende fixatiemiddelen nodig zijn om specifieke eiwitten te detecteren. Zo gebruikten we 4% PFA met 0,25% glutaraldehyde in PBS om F-actine en acetylated tubuline te detecteren. Om intelectine (ITLN) en ZO-1 te detecteren, worden organoïden gefixeerd met de oplossing van ijskoud Dent (4:1 methanol:dimethylsulfoxide) voor overnachting bij -20 °C. De vaste organoïden van Dent moeten voor het wassen serieel worden uitgedroogd (stap 6.3). Duur voor antilichaam incubatie en wassen kan worden geoptimaliseerd voor specifieke behoeften. - Fix organoids gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT) of 's nachts bij 4 °C.
- Was 3 keer met PBST (PBS met 0,1% Triton X-100) gedurende 15 minuten bij RT.
- Blokkeer niet-specifieke binding met 10% geitenserum in PBST (PBSGT) voor 1 uur bij RT.
- Incubeer met primair antilichaam (1:200) in PBSGT 's nachts bij 4 °C.
- Was 3 keer met PBST gedurende 15 minuten bij RT.
- Incubeer met secundair antilichaam (1:200) in PBSGT 's nachts bij 4 °C.
- Was 3 keer met PBST gedurende 15 minuten bij RT.
- Breng de vaste en immunobevlekte organoïden over naar een beeldvormingskamer en ga verder met confocale beeldvorming.
Representative Results
Dit gestandaardiseerde protocol genereert een mucociliary epitheelorganoïde van multipotente voorouders geïsoleerd van het vroege gastrula stadium X. laevis embryo's binnen 24 uur van de teelt14. Verzamelde diepe ectodermcellen assembleren zich zelf om een aggregaat te vormen in een niet-klevende PCR-buis en ondergaan oppervlakteeptheelisatie en bekerceldifferentiatie. Het nieuw epitheel geïmcipaliseerde oppervlak van aggregaten biedt een substraat vergelijkbaar met het inheemse epitheel dat in vivo wordt gevonden voor het intercalereren van binnencellen (bijvoorbeeld multiciliated en andere accessoirecellen) en ontwikkelt zich tot mucociliaire epitheliale organoïden(figuur 1A,B). Binnen 24 uur na aggregatie regenereren zelfgeorganiseerde mucociciaire epitheelorganoïden een volwassen opperhuid die niet te onderscheiden is van de opperhuid van een kikkervis. De organoïden bestaan uit volledig gedifferentieerd epitheel (keratine), slijm-afscheidende bekercellen (ITLN), multiciliated cellen (geacetyleerde tubuline), en kleine secretoire cellen (pinda agglutinine, PNA) (Figuur 1C).
Naast het bevestigen van de ontwikkeling van verschillende celtypen met immunostaining, kan de dynamiek van organoïde ontwikkeling worden gevolgd door live imaging(figuur 2A). Om de epithelialisatie te onderzoeken die in het vroege stadium van organoïde vorming ontstaat(figuur 1B),labelden we embryo's door fluorescerende strakke verbindingeiwitten (ZO-1-RFP) en membraanlokalisatie-eiwitten (mem-GFP) uit te drukken. Met dual-labeling kunnen de opeenvolgende stappen van ZO-1-positieve strakke verbindingsvorming worden gemarkeerd en kwantitatief worden geanalyseerd tijdens epithelialisatie(figuur 2). Voor cellen(figuur 2B, groengekleurd) in verschillende stadia van epithelialisatie (op 0 min) hebben sommige gebieden van celcelhechting bijvoorbeeld puncta van ZO-1(figuur 2B, groene pijlen) verspreid. In tegenstelling, andere gebieden hebben volledig geassembleerd, aaneengesloten ZO-1 expressie (Figuur 2B, gele pijlen). Na verloop van tijd, de puncta samensmelten en aansluiten op aaneengesloten strakke knooppunten(Figuur 2B, groene pijlen), en aaneengesloten strakke knooppunten behouden hun morfologie, zelfs tijdens de celdeling (Figuur 2B, gele pijlen). Naarmate de strakke knooppunten rijpen, bewegen cellen zich dynamisch in en uit het oppervlak langs de apicale vlakken van de organoïden(figuur 2C,D). Bovendien is multi-scale analyse mogelijk door cellen te volgen op het oppervlak van differentiërende organoïden(figuur 2B, kleurgecodeerde cellen), multi-scale analyse, variërend van individuele puncta tot aaneengesloten strakke verbindingen, celcelgrenzen en subsets van celpopulaties binnen organoïden.
Figuur 1: Generatie van mucociliarie epitheelorganoïden.
a) een schema met het protocol voor het assembleren van diepe ectodermaggregaten van X. laevisembryo's. (B) Een schema voor een model van mucociciaire epitheelorganoïde vorming afkomstig van multipotente diepe ectodermcellen (dwarsdoorsnede). Oppervlakte-gepositioneerde cellen gaan over in epitheliale cellen en onderscheiden zich in bekercellen. Differentiërende ciliated cellen, secretoire cellen, en ionocyten radiaal intercalate in het oppervlak en regenereren een volwassen opperhuid. (C) Maximale z-projectie van mucocivaarnisepelium immunosperkt voor ITLN (slijmproducerende bekercellen), acetylated tubuline (gestiliated cellen), PNA (kleine secretoire cellen) en keratine (epitheelcellen) in organoïden bij 24 hpa (bovenste paneel) en kikkervisopperhuid (lager paneel). Schaalbalk = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Live beeldvorming van het ontwikkelen van organoïden.
(A) Een schema van de beeldkamer voor levende organoïden (niet op schaal). (B) Time-lapse sequenties van confocale stapels verzameld uit diepe ectoderm cel aggregaten uitdrukken ZO-1-RFP en mem-GFP van 2,5 hpa. Schaalbalk = 20 μm. Cellen zijn pseudo-gekleurd voor het bijhouden na verloop van tijd. Groengekleurde cel hebben verschillende celhechtingsstatussen, waaronder een geleidelijk ontwikkelende ZO-1 positieve hechting (groene pijlen) en een handhaven aaneengesloten ZO-1 positieve hechting (gele pijlen) na verloop van tijd. C, D) Time-lapse confocale beelden van ZO-1-RFP-uitdrukkende diepe ectodermcelaggregaten tonen de radiaal intercalating cellen die zich naar het oppervlak bewegen (C, gele ster) en bewegen in de aggregaten (D, blauwe ster). Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Mucociliary epitheelorganoïden gegenereerd uit diepe ectodermcellen van X. laevis embryo zijn een krachtig hulpmiddel om de epitheelialisatie en differentiatie van multipotende voorlopers in vitro te bestuderen. In tegenstelling tot de breed aangenomen pettest16 die wordt gebruikt voor in vitro organogenese13 en de ontwikkeling van mucociiliary epithelia15,17,22 die gebruik maken van de intacte ectoderm, bieden de in dit protocol gepresenteerde diep ectoderm-afgeleide organoïden een duidelijke kans om de weefselmechanica-aangedreven regeneratiefasen van het oppervlakteeppitheel14te controleren. Op ongeveer 2 hpa beginnen de nieuw gegenereerde ZO-1 positieve epitheelcellen (figuur 2) te verschijnen op het apicale oppervlak van organoïden en hun populatie te verhogen om de gehele organoïde te bedekken als het weefsel stollen of vermindert de naleving14. De regeneratie van het epitheel en de daaropvolgende afstammingsspecificaties voor slijmproducerende bekercellen gaan spontaan in een chemisch gedefinieerde kweekmedia binnen een dag. Deze zich snel ontwikkelende mucociaire epitheelorganoïden bieden een platform om dynamisch celgedrag in real-time, in hoge resolutie, te onderzoeken tijdens progressieve stappen van epitheliale regeneratie. Ze maken ook onderzoek mogelijk naar fundamentele vragen die zich voordoen tijdens de ontwikkeling van mucociërkunde epitheel, homeostase en bijbehorende ziekten2,9,23. In het bijzonder kan de mechanische gevoeligheid van de diepe voorlopercellen tijdens de overgang naar epitheliale bekercelprecursoren die in de organoïden14 zijn geïdentificeerd, dienen om ademhalingsziekten in verband met abnormale basale differentiatie te koppelen wanneer slijmafscheidende bekercellen over- of onderproductie zijn23.
Hoewel dit protocol een eenvoudige aanpak biedt om deze organoïden te genereren, zijn er verschillende kritieke stappen voor succes in experimenten. Om besmetting van oppervlakkige epitheelcellen tijdens de isolatie van diepe ectodermcellen van de dierlijke dop te voorkomen, moet men de dierendop in calcium- en magnesiumvrije DFA onder een stereoscoop controleren en het juiste moment detecteren om de scheiding van de donkergeigmenteerde oppervlakkige laag van de dierendop te starten. Als het weefsel te lang in calcium- en magnesiumvrije DFA wordt bewaard, zal het hele weefsel zich afscheiden en onderscheid maken tussen diepe en oppervlakkige cellen zou dan onmogelijk zijn voor diepe ectodermaggregaten. Om de afwezigheid van oppervlakkige cellen in diepe ectodermaggregaten te bevestigen, raden we aan fluorescerend het apicale oppervlak van het embryo te labelen met NHS-rhodamine (stap 1.414) voorafgaand aan microchirurgie; dit zou een gemakkelijke identificatie van oppervlaktecellen mogelijk maken als ze in de resulterende organoïden voorkomen. Aangezien epitheelregeneratie wordt gereguleerd door weefselmechanica14,is het essentieel om onbedoelde krachtgeneratie voor zelforganiserende organoïden te voorkomen. In het bijzonder raden we aan contact met de glazen bodem van de beeldkamer tijdens live beeldvorming te vermijden door aggregaten aan de randen van de TEM-rasters te plaatsen, omdat dit vrij contact met het beeldvenster van live aggregaten mogelijk maakt (stap 5.1.2.). Dit in vitro-gekweekte, zelfgeorganiseerde 3D-model voor mucociliary epitheel zal dienen als een aaneenbaar instrument om de fundamentele vragen die zich voordoen tijdens de regeneratie van epitheel en de afstamming specificatie van bekercellen te beantwoorden.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken leden van Kim lab en Lance Davidson voor hun opmerkingen en steun. Dit werk werd ondersteund door Young Scientist Fellowship aan HYK van Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dual-stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-100 | |
| Picoliter microinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Confocal Laser Microscope | |||
| Stereoscope | |||
| Tools | |||
| Forcep | Dumont | Dumont #5 | |
| Hair knife | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
| Hair loop | Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991) | ||
| hCG injection | |||
| human chorionic gonadotropin | Sigma | cg10-10vl | |
| MBS solution | |||
| 10M Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
| Phenol-red | Sigma | P0290 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g | Sigma | 655104 | |
| dejellying solution | |||
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| Sodium hydroxide 10M | Sigma | 72068 | |
| Ficoll solution | |||
| Ficoll | Sigma | F4375 | |
| DFA solution | |||
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| 0.22mm Filter | Millipore | S2GPT05RE | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | |
| Bicine | Sigma | B3876 | |
| Calcium chloride | Sigma | C3881 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | 230391 | |
| Potassium gluconate | Sigma | G4500 | |
| Sodium carbonate | Sigma | 222321 | |
| Sodium gluconate | Sigma | G9005 | |
| mRNA in vitro transcription | |||
| SP6/T7 in vitro transcription kit | Invitrogen | AM1340 | |
| mRNA microinjection | |||
| Borosilicate glass capillary tubes | Harvard Apparatus | GC100-10 | |
| Eppendorf microloader pipette tips | ThermoFisher | A25547 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| PCR tube coating | |||
| BSA | Thermofisher | 26140079 | |
| PCR tubes | SSI | SSI-3245-00 | |
| Imaging | |||
| Custom-milled acrylic chamber | |||
| Coverglass 24mmX50mm | Duran | B01_001650 | |
| SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh) | SPI | 275HGN-XA | |
| SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh) | SPI | 2775GN-XA | |
| Silicone grease | Shinetsu | HIVAC-G | |
| Fixation | |||
| 20ml screw top-cap vial | Wheaton | WH.986580 | |
| 2ml screw top-cap vial | |||
| Benzyl alcohol | Sigma | 305197 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sgima | D4540 | |
| Glutaraldehyde 10% EM GRADE | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Goat serum | Jackson | 005-000-121 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Paraforlamdehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | LPS Solution | CBP007B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Primary antibody (1:200) | |||
| acetylated tubulin | Sigma | clone 6-11B-1 | |
| Itln1 | Proteintech | 11770-1-AP | |
| Keratin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1h5 | |
| ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| Vectors | |||
| pCS2-mem-GFP | Gift from Dr. Lance Davidson | ||
| pCS2-ZO1-RFP | Gift from Dr. Lance Davidson |
References
- Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Tournier, J. M., Coraux, C. Airway Epithelial Repair, Regeneration, and Remodeling after Injury in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 726-733 (2006).
- Tilley, A. E., Walters, M. S., Shaykhiev, R., Crystal, R. G. Cilia dysfunction in lung disease. Annual Review of Physiology. 77, 379-406 (2015).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The Airway Epithelium: Soldier in the Fight against Respiratory Viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Dubaissi, E., et al. A secretory cell type develops alongside multiciliated cells, ionocytes and goblet cells, and provides a protective, anti-infective function in the frog embryonic mucociliary epidermis. Development. 141 (7), 1514-1525 (2014).
- Hayes, J. M., et al. Identification of novel ciliogenesis factors using a new in vivo model for mucociliary epithelial development. Developmental Biology. 312 (1), 115-130 (2007).
- Walentek, P., Quigley, I. K. What we can learn from a tadpole about ciliopathies and airway diseases: Using systems biology in Xenopus to study cilia and mucociliary epithelia. Genesis. 55 (1-2), (2017).
- Werner, M. E., Mitchell, B. J. Understanding ciliated epithelia: The power of Xenopus. Genesis. 50 (3), 176-185 (2012).
- Dubaissi, E., Papalopulu, N. Embryonic frog epidermis: a model for the study of cell-cell interactions in the development of mucociliary disease. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 179-192 (2011).
- Walentek, P., et al. A novel serotonin-secreting cell type regulates ciliary motility in the mucociliary epidermis of Xenopus tadpoles. Development. 141 (7), 1526-1533 (2014).
- Asashima, M., et al. In vitro organogenesis from undifferentiated cells in Xenopus. Developmental Dynamics. 238 (6), 1309-1320 (2009).
- Kim, H. Y., Jackson, T. R., Stuckenholz, C., Davidson, L. A. Tissue mechanics drives regeneration of a mucociliated epidermis on the surface of Xenopus embryonic aggregates. Nature Communications. 11 (1), 665 (2020).
- Haas, M., et al. DeltaN-Tp63 Mediates Wnt/beta-Catenin-Induced Inhibition of Differentiation in Basal Stem Cells of Mucociliary Epithelia. Cell Reports. 28 (13), 3338-3352 (2019).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. Guille, M. , Humana Press. 1-13 (1999).
- Stubbs, J. L., Davidson, L., Keller, R., Kintner, C. Radial intercalation of ciliated cells during Xenopus skin development. Development. 133 (13), 2507-2515 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Joshi, S. D., Kim, H. Y., Davidson, L. A. Microscopy tools for quantifying developmental dynamics in Xenopus embryos. Methods in Molecular Biology. 917, 477-493 (2012).
- Sater, A. K., Steinhardt, R. A., Keller, R. Induction of neuronal differentiation by planar signals in Xenopus embryos. Developmental Dynamics. 197 (4), 268-280 (1993).
- Sedzinski, J., Hannezo, E., Tu, F., Biro, M., Wallingford, J. B. Emergence of an Apical Epithelial Cell Surface In Vivo. Developmental Cell. 36 (1), 24-35 (2016).
- Rock, J. R., Randell, S. H., Hogan, B. L. M. Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling. Disease Models & Mechanisms. 3 (9-10), 545-556 (2010).
