Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Mucociliary Epithelial Organoids van Xenopus Embryonal Cells: Generatie, Cultuur en High-Resolution Live Imaging
Chapters
Summary July 28th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We beschrijven een eenvoudig protocol voor de ontwikkeling van mucociliarie epitheelorganoïden uit diepe ectoderm cellen geïsoleerd van Xenopus laevis embryo's. De multipotige voorlopers regenereren epitheel bekercelprecursoren en laten live tracking van de initiatie en progressie van de celovergangen op het oppervlak van organoïden toe.
Transcript
Mucociliary epitheel lijnen interne organen van ons lichaam en biedt de eerste lijn van verdediging door het opruimen van vreemde deeltjes. Dit protocol maakt het mogelijk om embryonale cel afgeleide mucociliary epitheelorganoïde genereren in 24 uur. Het belangrijkste voordeel van onze methode is dat we de live progressie van celovergangen op het oppervlak van organoïden kunnen monitoren.
Dit reproduceerbare, schaalbare en snelle protocol voor de zich ontwikkelende organoïde zal onderzoekers in staat stellen om fundamentele vragen voor de biologie van mucociliary epitheel aan te pakken. Om te beginnen, verkrijg X.Laevis embryo's door handmatig eieren te verzamelen van gestimuleerde vrouwelijke kikkers en het uitvoeren van in vitro fertilisatie. Ontgeiveerd de bevruchte embryo's met zachte agitatie in 2%cysteïne, in een derde X-gemodificeerde Barth's zoutoplossing gedurende ongeveer vijf minuten.
Kweek de embryo's in een derde XMBS bij de gewenste temperatuur tot de eerste tekenen van fase 10 worden gedetecteerd, zoals het verschijnen van donkere gepigmenteerde cellen rond de blastopore in de plantaardige weergave. Selecteer en verzamel embryo's als ze in een vroeg stadium 10 met behulp van haargereedschappen onder een stereoscoop. Breng de geselecteerde embryo's over in een met DFA gevuld petrischaaltje met een wegwerptransferpipet.
Verwijder vervolgens het vitelline membraan van de embryo's met behulp van scherpe tangen van de plantaardige kant, zonder de dierlijke kant van het embryo te verstoren. Om de dierenkap te isoleren, plaatst u de dierlijke kant van het embryo omhoog. Visueel schatten van de omvang van de dierlijke dop te worden uitgesneden en maak de eerste incisie langs de rand met een haarmes, trekken het mes naar buiten om de snede te maken.
Herhaal dit proces om een keten van kleine bezuinigingen te creëren om de dierenkap weg te snijden. Trim de dik gelaagde rand van de dierendop met behulp van een haarmes om de opname van mesoderm precursoren te voorkomen. Om diepe ectodermcellen te scheiden van de dierendop, breng je de uitgesneden dierendoppen over naar een petrischaaltje gevuld met calcium- en magnesiumvrije DFA met een wegwerptransferpipet.
Plaats de dierendoppen om de dierlijke kant omhoog te kijken, met behoud van een royale afstand tot andere explants. Wacht vijf tot tien minuten en controleer de explants onder een stereoscoop. Zodra de losgemaakte diepe cellen zijn vrijgegeven van de rand van de donker gepigmenteerde oppervlakkige laag, beginnen met het opheffen van de oppervlakkige laag uit de buurt van de lichtgekleurde diepe ectoderm cellen.
Maak de oppervlakkige laag voorzichtig los met een haarmes, beginnend aan de rand. Verzamel vervolgens de diepe ectodermcellen met zo min mogelijk calcium- en magnesiumvrije DFA. Breng verzamelde diepe ectodermcellen over naar niet-kleefbare PCR-buizen met 200 microliter DFA en pipette de media twee tot drie keer om de overgedragen cellen te verspreiden.
Sluit de buizen en houd ze rechtop om spontane aggregatie aan de onderkant te induceren. Controleer het aggregatieproces onder een stereomicroscoop. Cellen verzamelen zich meestal binnen een uur onder aan de PCR-buis en assembleren binnen twee tot drie uur in bolvormige aggregaten, afhankelijk van de grootte.
Voor het uitvoeren van live beeldvorming of drug testen tijdens de ontwikkeling van de mucociliarie epitheelorganoïden, verzamelen aggregaten op twee uur na aggregatie met behulp van een 200 microliter pipet uitgerust met vergrote tips. Om aggregaten te laten uitgroeien tot mucociërgele organoïden in de cultuur, verzamel je ze van de PCR-buis om vijf uur na aggregatie en breng je ze over naar een met DFA gevuld petrischaaltje. Plaats de aggregaten ver uit elkaar om fusing te voorkomen.
Binnen 24 uur na cultuur bij kamertemperatuur, zonder toegevoegde factoren, volwassen mucociliarie epitheelorganoïden kunnen worden waargenomen roterende als gevolg van de kloppende trilharen die het oppervlak van de gedifferentieerde epitheel bedekt. Maak een beeldkamer met glazen bodem door een afdekglas aan een op maat gemaakte acrylkamer te lijmen met siliciumvet, de kamer goed af te sluiten om lekkage van de kweekmedia te voorkomen en vul vervolgens de beeldkamer met DFA. Pak een zeshoekige transmissie elektronenmicroscopie of TEM-raster met behulp van tangen en breng een kleine hoeveelheid vet aan op de rand van het raster.
Druk licht naar beneden om het TEM-raster aan de onderkant van de beeldkamer te beveiligen. Breng de aggregaten over naar de beeldkamer en plaats ze binnen het raster. Vul de kamer met DFA en sluit deze af met een afdekglas en vet.
Om de progressie van mucociliarie epitheel organoïde vorming te volgen, verzamelen time-lapsed z-stack beelden van aggregaten met behulp van een confocale microscoop. Mucociliary epitheelorganoïden werden gegenereerd uit multipotente voorouders van het vroege gastrulastadium X.Laevis embryo's. De organoïden hebben een volwassen opperhuid die niet te onderscheiden is van die van een kikkervis, waaronder een volledig gedifferentieerd epitheel, slijm dat bekercellen scheidt, multiciliated cellen en kleine secretoire cellen.
De dynamiek van organoïde ontwikkeling werd gevolgd door live beeldvorming. Om de epithelialisatie te onderzoeken die in het vroege stadium van organoïde vorming naar voren komt, werden de embryo's gelabeld met fluorescerend gelabeld strakke verbindingeiwitten en membraanlokaliserende eiwitten. Met dubbele etikettering kunnen de opeenvolgende stappen van ZO-1 positieve strakke verbindingsvorming worden gemarkeerd en kwantitatief worden geanalyseerd tijdens epithelialisatie.
Sommige gebieden van celcelhechting hebben verspreid puncta van ZO-1 in verschillende stadia van epithelialisatie. Daarentegen hebben andere gebieden volledig geassembleerde aaneengesloten ZO-1 expressie. Na verloop van tijd de puncta samensmelten en verbinden met aaneengesloten strakke knooppunten vormen, die hun morfologie te behouden, zelfs tijdens de celdeling.
Als de strakke knooppunten rijpen, bewegen cellen dynamisch in en uit het oppervlak langs de apicale vlakken van de organoïden. Multi-scale analyse is mogelijk door het bijhouden van cellen spatio-tijdelijk op het oppervlak van het differentiëren van organoïden. Bij een poging dit protocol, vergeet niet om de donker gepigmenteerde kant van het isolaat dierlijke dop naar boven en monitor het onder een stereoscoop.
Het is van cruciaal belang om de oppervlakkige laag van de dierendop op de juiste tijd in calcium/magnesiumvrije DFA-media te scheiden. Dit eenvoudige protocol biedt handige manieren om dynamisch celgedrag te bestuderen, evenals de moleculaire en fysieke mechanismen die mucociliary epitheel reguleren.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
