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Developmental Biology

मुरीन एक्सिसिओनल घाव हीलिंग मॉडल और हिस्टोलॉजिकल मॉर्फोमेट्रिक घाव विश्लेषण

Published: August 21, 2020 doi: 10.3791/61616
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों में द्विपक्षीय, पूर्ण मोटाई के उत्तेजना घावों को कैसे उत्पन्न करता है और बाद में मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए घावों की निगरानी, फसल और तैयार करने का तरीका बताता है। शामिल कैसे धारावाहिक हिस्टोलॉजिकल वर्गों का उपयोग करने के लिए परिभाषित करने के लिए, ठीक मात्रा और रूपोमेट्रिक दोषों का पता लगाने का एक में गहराई से वर्णन है ।

Abstract

सूजन, प्रसार और रीमॉडलिंग: घाव भरने के क्रमिक रूप से अतिव्यापी चरणों में से प्रत्येक का अध्ययन करने के लिए मुरीन एक्ससिओनल घाव मॉडल का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। मुरीन घावों में एक हिस्टोलॉजिकल रूप से अच्छी तरह से परिभाषित और आसानी से पहचानने योग्य घाव बिस्तर होता है जिस पर उपचार प्रक्रिया के ये विभिन्न चरण औसत दर्जे के होते हैं। क्षेत्र के भीतर, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषणों के लिए घाव के मनमाने ढंग से परिभाषित "मध्य" का उपयोग करना आम बात है। हालांकि, घाव एक त्रि-आयामी इकाई हैं और अक्सर हिस्टोलॉजिकल रूप से सममित नहीं होते हैं, जो एक छोटे प्रभाव आकार के साथ रूपोमेट्रिक दोषों का पता लगाने के लिए मात्राकरण की एक अच्छी तरह से परिभाषित और मजबूत विधि की आवश्यकता का समर्थन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम चूहों में द्विपक्षीय, पूर्ण मोटाई के उत्तेजनीय घावों को बनाने के साथ-साथ चुनिंदा धारावाहिक वर्गों पर एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का उपयोग करके मॉर्फोमेट्रिक मापदंडों को मापने के बारे में एक विस्तृत निर्देश का वर्णन करते हैं। घाव की लंबाई, एपिडर्मल लंबाई, एपिडर्मल क्षेत्र और घाव क्षेत्र के दो आयाम मापों का उपयोग घाव, समग्र घाव क्षेत्र, एपिडर्मल वॉल्यूम और घाव की मात्रा को कवर करने वाले तीन आयाम एपिडर्मल क्षेत्र को एक्सट्रपलेट करने के लिए वर्गों के बीच ज्ञात दूरी के संयोजन में किया जाता है। यद्यपि यह विस्तृत हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण पारंपरिक विश्लेषणों की तुलना में अधिक समय और संसाधन लेने वाला है, इसकी कठोरता स्वाभाविक रूप से जटिल घाव उपचार प्रक्रिया में उपन्यास फेनोटाइप का पता लगाने की संभावना को बढ़ाती है।

Introduction

क्यूटेनियस घाव उपचार क्रमिक रूप से ओवरलैपिंग चरणों के साथ एक जटिल जैविक प्रक्रिया है। यह सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं है कि अस्थायी और स्थानिक रूप से विनियमित कर रहे है ताकि क्षतिग्रस्त epithelium के बाधा समारोह को बहाल करने के समन्वय की आवश्यकता है । पहले चरण में, सूजन, न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज घाव में स्थानांतरित हो जाते हैं, स्थानीय और प्रणालीगत सुरक्षा1जुटाते हैं। भड़काऊ चरण के बाद और ओवरलैपिंग प्रसार चरण है। फाइब्रोब्लास्ट तेजी से बढ़ने लगते हैं और ग्रैनुलेशन ऊतक में माइग्रेट होते हैं। केराटिनोसाइट्स अग्रणी किनारे से दूर दिशात्मक रूप से घाव की ओर फैलते हैं क्योंकि अग्रणी किनारे में विभेदित केराटिनोसाइट्स घाव को फिर से एपिथेलाइज करने के लिए माइग्रेट करते हैं2। अंत में, रिमॉडलिंग और परिपक्वता चरण शुरू होता है, जिसके दौरान ग्रेनुलेशन ऊतक में फाइब्रोब्लास्ट संश्लेषण और जमा कोलेजन शुरू होते हैं। नए मैट्रिक्स का रीमॉडलिंग और संगठन चोट के बाद 1 साल तक चल सकता है3। कई सेल प्रकारों के बीच क्रॉस-टॉक से जुड़ी ओवरलैपिंग घटनाओं की जटिलता के कारण, और अनुसंधान के वर्षों के बावजूद, घाव भरने में अंतर्निहित कई सेलुलर और आणविक तंत्र खराब समझ में आते हैं।

माउस मॉडल उनके उपयोग में आसानी, अपेक्षाकृत कम लागत और आनुवंशिकमणिपुलेबिलिटी1,4,5के कारण घाव भरने के तंत्र की जांच करने के लिए प्रमुख स्तनधारी मॉडल है। यद्यपि मुरीन मॉडल में विभिन्न प्रकार के घावों का वर्णन किया गया है, लेकिन सबसे आम एक छिद्रिक घाव (या तो द्विपक्षीय पंच या प्रत्यक्ष पंच बायोप्सी) है, जिसके बाद चीरा घाव मॉडल4है। चीरा घाव मॉडल चीरा मॉडल पर एक अलग लाभ है क्योंकि यह स्वाभाविक रूप से नियंत्रण ऊतक है कि चिकित्सा प्रक्रिया से गुजरना नहीं पड़ा है उत्पन्न करता है । पंच बायोप्सी ऊतक है कि शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल के भाग के रूप में उत्पादित है घायल ऊतक के रूप में एक ही तरीके से संसाधित किया जा सकता है और एक वांछित कसौटी के लिए homeostatic शर्तों को स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया । यदि त्वचा के पूर्व उपचार के प्रभावों का आकलन करना या चोट के समय सफल जीन परिवर्तन की पुष्टि करनाहो तोउत्पादित नियंत्रण ऊतक भी उपयोगी हो सकते हैं ।

हीलिंग पैरामीटर्स का आकलन कई अलग-अलग तकनीकों द्वारा किया जा सकता है, जिसमें प्लैनिमेट्री या हिस्टोरोलॉजी शामिल हैं। हालांकि, प्लैनिमेट्री केवल घाव की दृश्यमान विशेषताओं का मूल्यांकन कर सकता है, और एक पपड़ी की उपस्थिति के कारण, अक्सर हिस्टोलॉजी द्वारा कल्पना किए गए उपचार के माप से संबंधित नहीं होता है, जिससे हिस्ट्रोलॉजी विश्लेषण 4 का "स्वर्ण मानक" बनजाताहै। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण सोने के मानक होने के बावजूद, यह अक्सर घाव6, 7के मनमाने सबसेट पर कियाजाताहै। उदाहरण के लिए, घाव को एम्बेड करने और खंडित करने से पहले "आधा" में घाव को काटना वर्तमान में सामग्री और डेटा विश्लेषण की धारा पर खर्च किए गए समय और संसाधनों को कम करने के लिए आम प्रथा है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित रूपांतर विश्लेषण की विधि को पूरे घाव ऊतक को शामिल करने, घाव की रूपात्मक विशेषताओं को सही ढंग से प्रतिबिंबित करने और एक छोटे प्रभाव आकार के साथ घाव उपचार दोषों का पता लगाने की संभावना को बढ़ाने के लिए विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, हम सबसे अधिक अध्ययन किए गए मुरीन घाव, द्विपक्षीय पूर्ण मोटाई के उत्तेजना घाव, साथ ही हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक विस्तृत और कठोर विधि पैदा करने के लिए एक शल्य चिकित्सा विधि का विस्तार करते हैं, जैसे कि क्षेत्र में शायद ही कभी उपयोग किया जाता है।

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Protocol

सभी प्रयोगों के अनुसार और संघीय नियमों और आयोवा नीति और प्रक्रियाओं के विश्वविद्यालय के अनुपालन में पूरा किया गया आयोवा IACUC विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. पशु और पशुपालन

  1. 8-10 सप्ताह की उम्र में वांछित माउस लाइन के वयस्क चूहों का उपयोग करें जब बाल कूप चरण टेलोजन में हो।
  2. सर्जरी के दिन, घाव व्यवधान को कम करने के लिए साफ पिंजरों और व्यक्तिगत रूप से घर में अलग चूहों।

2. सर्जरी

नोट: बाँझ शल्य चिकित्सा स्थितियों को बनाए रखने के लिए अनावश्यक है। जबकि जानवरों के बीच बंध्यता बनाए रखने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, पंच बायोप्सी स्वयं एक साफ, लेकिन गैर बाँझ सतह पर किया जाता है। प्रति पशु सर्जरी की अवधि 10 से 15 मिनट के बीच है।

  1. एनेस्थेटाइजेशन
    1. आइसोफ्लोरैन वाष्पीकरण सेट के साथ एक इंडक्शन चैंबर में 1-2 मिनट के लिए जानवर को एनेस्थेटाइज करें और ऑक्सीजन फ्लो मीटर 1 लीटर प्रति मिनट पर सेट करें। वैकल्पिक संज्ञाहरण विकल्पों के लिए चर्चा देखें।
    2. प्रक्रिया शुरू करने से पहले उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें। संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि एक फर्म के लिए की अंगुली चुटकी द्वारा की जा सकती है।
    3. माउस को इंडक्शन कंटेनर से नाक शंकु में स्थानांतरित करें और आइसोफ्लोरेन प्रवाह दर को 1.5% और ऑक्सीजन प्रवाह मीटर को 0.5 एल/मिनट तक कम करें।
    4. दोनों आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं क्योंकि प्रक्रिया 5 मिनट से अधिक है।
    5. थर्मल पैड का उपयोग करके सामान्य शरीर के तापमान को बनाए रखें।
  2. घाव स्थल की तैयारी
    1. कंधे के स्तर पर माउस के पीछे फर को हटाने के लिए एक कौडल रोस्ट्रल मोशन में इलेक्ट्रिक रेजर क्लिपर का इस्तेमाल करें। दो से अधिक घावों को प्रदर्शन करने पर जरूरत के अनुसार पीठ पर बालों को कम निकालें।
    2. माउस के पीछे से 20 डिग्री पर आयोजित एक रोस्ट्रल कौडल मोशन में रेजर ब्लेड का उपयोग करके शेष बालों को काट दिया गया क्षेत्र(चित्रा 1A)को बारीकी से दाढ़ी बनाने के लिए हटा दें।
    3. एक पोविडोन-आयोडीन झाड़ू के साथ मुंडा क्षेत्र को साफ करें।
    4. आयोडीन झाड़ू से संभावित कटनीस जलन को कम करने के लिए एक बाँझ 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल प्रेप पैड के साथ त्वचा को पोंछें।
  3. घायल
    1. पृष्ठीय मिडलाइन के साथ कंधे के ब्लेड के बीच त्वचा चुटकी और शरीर से दूर सैंडविच त्वचा खींच(चित्रा 1B)।
    2. एक साफ कागज आधारित तौलिया या समकक्ष के साथ लिपटी एक सपाट सतह पर खाल के साथ अपनी तरफ माउस की स्थिति । अंतर्निहित सतह को क्षति(चित्रा 1C)से बचाने के लिए तौलिया के नीचे दंत मोम की एक शीट का उपयोग करें।
    3. मनचाचाओं के बायोप्सी पंच को जितना संभव हो सके शरीर के करीब रखें और त्वचा को आराम करने दें। त्वचा को स्ट्रेच न करें, वरना घाव का आकार निर्धारित पंच आकार(चित्रा 1D)से बड़ा होगा।
    4. नीचे दबाने से त्वचा पंच, एक कमाल की गति दोनों पक्षों पर त्वचा की सभी परतों को सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है(चित्रा 1E)में प्रवेश किया गया है । प्रत्येक जानवर के लिए एक नया बायोप्सी पंच का उपयोग करें।
    5. घावों से पंच बायोप्सी निकालें(चित्रा 1F)। यदि अभी भी आस-पास की त्वचा से पंच को मुक्त करने के लिए लगाव का उपयोग बाँझ कैंची और चिमटी की साइटें हैं। घाव भरने के विश्लेषण के लिए डाउनस्ट्रीम योजनाओं के आधार पर आवश्यक पंच बायोप्सी नियंत्रण ऊतक की प्रक्रिया करें (सुझावों के लिए चर्चा देखें)।
    6. प्रारंभिक घाव क्षेत्र को मापने और विश्लेषण से आउटलर्स को खत्म करने के लिए घाव साइटों या फ्रेम में एक शासक के साथ बराबर दूरी से स्थूल तस्वीरें लें।
    7. एक अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार कम से कम 24 घंटे के लिए एनाल्जेसिया का प्रशासन करें। उदाहरण के लिए: Buprenorphine एसआर-लैब, दर्द से राहत के ४८ घंटे के लिए 0.5-2 मिलीग्राम/किलो पर एक खुराक के रूप में इंजेक्शन (वैकल्पिक सुझावों और विचारों के लिए चर्चा देखें) ।
    8. माउस की निगरानी के रूप में यह संज्ञाहरण से बाहर आता है जब तक यह एक ईमानदार मुद्रा बनाए रखता है और पिंजरे के आसपास सामांय रूप से चल रहा है ।

3. पोस्ट घाव निगरानी

  1. अन्वेषक द्वारा निर्धारित और संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार और अनुपालन के अनुसार प्रयोगात्मक अंत बिंदुओं के लिए दैनिक चूहों की निगरानी करें। उदाहरणों में शामिल हैं: संक्रमण, दिखाई वजन घटाने, या एक कूबड़ मुद्रा।
  2. नियंत्रित तरीके से दैनिक स्थूल तस्वीरों को लें जैसा कि प्रारंभिक सर्जरी के बाद किया गया था।

4. कटाई के घाव

  1. एक अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार वांछित समय बिंदु पर चूहों को घायल करने के बाद इच्छामृत्यु।
  2. पिछले फोटोग्राफ अधिग्रहण(चित्रा 2ए, सी)के अनुरूप नियंत्रित तरीके से घाव साइटों की स्थूल तस्वीरों को लें।
  3. एक स्केलपेल(चित्रा 2डी, ई)का उपयोग करके घाव साइटों के चारों ओर एक विस्तृत आयत काटें।
  4. कैंची और चिमटी का उपयोग कर ऊतक के आयताकार टुकड़ा मुक्त करने के लिए वापस छील और त्वचा अंतर्निहित ऊतक(चित्रा 2एफ) से दूर काट । पेट्री डिश(चित्रा 2G)में रखें।
  5. घावों को काटें। एक आयताकार आकार (चित्रा 2एच, मैं)में घाव के सभी पक्षों के आसपास के बिना घाव ऊतक के2 मिमी तक नीचेट्रिम करें। घाव की फसल के लिए वैकल्पिक विकल्पों के लिए चर्चा देखें।
  6. बाद के अध्ययनों के लिए आवश्यक घावों को संसाधित करें। पैराफिन एम्बेडिंग और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए प्रति माउस कम से कम एक घाव आरक्षित करें।

5. घाव निर्धारण और एम्बेडिंग

  1. घाव को ठीक करें
    1. घाव के ऊतकों को एक ताजा तैयार 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान8 में कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए ठीक करें फिर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ग्रेड पैराफॉर्मल्डिहाइड और समाधान निस्पंदन की आवश्यकता नहीं है।
    2. 1x पीबीएस में 30 मिनट के लिए घावों को दो बार धोएं।
    3. पीबीएस को 70% ईटीओएच के साथ बदलें और एम्बेड होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एंटीजन हानि से बचने के लिए या 1-2 सप्ताह के भीतर यदि केवल हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं का मूल्यांकन किया जाता है तो 24-48 घंटे के भीतर ऊतकों की प्रक्रिया करें।
  2. प्रक्रिया और घाव एम्बेड
    1. प्रत्येक घाव को एम्बेडिंग कैसेट में स्थानांतरित करें। पेंसिल में लेबलिंग कैसेट के रूप में प्रक्रिया स्याही को दूर करेगा ।
    2. ऊतक को मैन्युअल रूप से संसाधित करें या इथेनॉल प्रतिशत बढ़ाने के साथ ऊतक को निर्जलित करके स्वचालित प्रोसेसर का उपयोग करें, जाइलीन के साथ समाशोधन करें, और फिर पैराफिन वैक्स(टेबल 1)के साथ ऊतक में घुसपैठ करें।
    3. एम्बेडिंग मोल्ड(चित्रा 3ए, बी)की क्षैतिज सतह से घाव को 90 डिग्री ("खड़ा") एम्बेड करें।

6. दिन 0 घाव क्षेत्र विश्लेषण

  1. एनआईएच-इमेज जे या एनआईएच-फिजी फ्री सॉफ्टवेयर (https://imagej.net/Fiji/Downloads) डाउनलोड करें।
  2. दिन 0 घावों की तस्वीर के साथ एक फ़ाइल खोलें।
  3. विश्लेषण | के तहत"क्षेत्र"के लिए बॉक्स की जांच करें माप निर्धारित करें।
  4. विश्लेषण के तहत"सेट स्केल" का चयनकरें । पिक्सल में दूरी दर्ज करें, ज्ञात संबंधित दूरी और दूरी की इकाई (= लंबाई की इकाई) यदि स्थूल माप अध्ययन का हिस्सा हैं या केवल सापेक्ष माप की आवश्यकता होने पर इस कदम को छोड़ दें।
  5. फिजी टूलबार पर"फ्रीहैंड चयन"का चयन करें।
  6. घाव की परिधि की रूपरेखा तैयार करें।
  7. विश्लेषणके तहत उपाय पर क्लिक करें ।
  8. प्रति पशु प्रति माप का ट्रैक रखने के लिए एक स्प्रेडशीट बनाएं।
  9. स्प्रेडशीट में घाव क्षेत्र की माप की प्रतिलिपि।
  10. किसी दिए गए प्रयोग के लिए सभी घावों के मानक विचलन की गणना करें।
  11. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से मतलब के दो मानक विचलन के बाहर किसी भी घाव को बाहर करें।

7. धारावाहिक अनुभागिंग

  1. पैराफिन एम्बेडेड घाव ब्लॉक को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
  2. माइक्रोटॉम और ओरिएंट के ब्लॉक धारक पर पैराफिन ब्लॉक डालें तो ब्लेड सीधे ब्लॉक भर में कट जाएगा। ब्लॉक को इस तरह उन्मुख करें कि ऊतक 90 डिग्री पर "खड़ा" है, जिससे एपिडर्मिस और डर्मिस(चित्र 3सी, डी)के एक साथ अनुभागिंग की अनुमति दी गई है।
  3. प्रत्येक 7 माइक्रोन के 20-30 पैराफिन वर्गों के 2-4 रिबन बनाएं।
  4. एक फर्म ब्लैक प्लास्टिक शीट जैसी फर्म अभी तक जोड़-तोड़ करने योग्य सतह पर प्रत्येक रिबन को स्थानांतरित करने के लिए एक सूखे पेंट ब्रश और एक विच्छेदन चिढ़ा सुई का उपयोग करें।
  5. एक रेजर ब्लेड के साथ प्रत्येक रिबन के शीर्ष खंड को अलग करें और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें।
  6. एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत अन दाग वर्गों का निरीक्षण करने के लिए निर्धारित करने के लिए जो लोगों को घायल ऊतक होते हैं, जो बाल कूप की अनुपस्थिति, संयोजी ऊतक या एपिडर्मिस की उपस्थिति में परिवर्तन, और/या एक पपड़ी की उपस्थिति(चित्रा 4ए, बी)द्वारा पहचाना जा सकता है ।
  7. घाव की शुरुआत से पहले 20 वर्गों तक बिना घाव वाले वर्गों को त्यागें।
  8. घाव के माध्यम से चरण 7.3 और 7.4 दोहराने के माध्यम से अनुभाग जब तक कोई घाव अन दाग वर्गों में पता चला है।

8. पैराफिन वर्गों के बढ़ते

  1. एक रेजर ब्लेड के साथ हर 5 वर्गों में अलग पैराफिन सेक्शन, पहले रिबन(चित्रा 3E)से शुरू होता है।
  2. स्लाइड नंबर और सभी सेक्शन नंबर दोनों के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड लेबल करें।
  3. गीले पेंट ब्रश के साथ 5 वर्गों के समूह को पकड़ो और उन्हें समतल करने के लिए गर्म पानी के स्नान (40-45 डिग्री सेल्सियस) के पानी की सतह पर तैरें।
  4. लेबल वाले माइक्रोस्कोप स्लाइड(चित्रा 3F)में से एक का उपयोग करके पानी के स्नान से बाहर 5 वर्गों के समूह को चुनें और 24 घंटे तक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड वार्म सेट पर रखें।
  5. स्लाइड बॉक्स में सीधे स्लाइड स्टोर करें।

9. हिस्टोलॉजिकल धुंधला

  1. हर 8माइक्रोस्कोप स्लाइड (हर 40वें पैराफिन अनुभाग के बराबर) को एक धुंधला रैक और हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन के साथ दाग में स्थानांतरित करें।

10. माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग

  1. 4x उद्देश्य और डिजिटल अधिग्रहण क्षमताओं से लैस एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों का अधिग्रहण करें। छवि को किस पैमाने पर लिया जाता है, रिकॉर्ड करें।
  2. छवि प्रत्येक दाग स्लाइड के शीर्ष खंड के पूरे घाव और दोनों तरफ कुछ unwounded ऊतक शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें । घाव एक ही तस्वीर के फ्रेम से बड़ा है, तो कई अतिव्यापी चित्र ले लो।
  3. मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए अनुभाग संख्या सहित फ़ाइल को सहेजें। एक ही घाव के ओवरलैपिंग चित्रों के लिए ए, बी, सी आदि के बाद अनुभाग संख्या का उपयोग करें।

11. मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण

नोट: जब घाव कई चित्रों तक फैला है, तो स्प्रेडशीट में रिकॉर्ड करने के लिए प्रति मीट्रिक प्रति मीट्रिक एक मूल्य प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत चित्रों से लिए गए माप का योग करें।

  1. छवि जे में, एक दाग घाव तस्वीर की एक डिजिटल फ़ाइल खोलें। विश्लेषण के लिए सिले चित्रों का उपयोग न करें। बंद छोड़ने के लिए और चित्र से चित्र के लिए माप लेने के लिए स्थलों को खोजने के द्वारा ज़ूम-इन ओवरलैपिंग चित्रों पर माप करें।
  2. पैमाने और माप वरीयताओं को निर्धारित करें।
    1. विश्लेषण के तहत"सेट स्केल" का चयनकरें । पिक्सल में दूरी दर्ज करें, ज्ञात संबंधित दूरी और दूरी की इकाई (लंबाई की इकाई)। पैमाने खिड़की में दिखाई देना चाहिए और पैमाने पर छवि पर अधिग्रहीत किया गया था के अनुरूप होना चाहिए ।
    2. प्रत्येक खुली छवि के लिए पैमाने को समान रखने के लिए बॉक्स"ग्लोबल"की जांच करें।
    3. हर बार इमेज जे बंद और फिर से खोला जाता है तो हर बार चरण 11.2.1 से 11.2.2 तक दोहराएं।
    4. विश्लेषण | के तहत"क्षेत्र"के लिए बॉक्स की जांच करें माप निर्धारित करें।
  3. घाव की लंबाई को मापें
    1. फिजी टूलबार पर"फ्रीहैंड चयन"का चयन करें।
    2. घाव के एक तरफ अघायल ऊतक के अंतिम बाल कूप से शुरू उपाय घाव के दूसरी तरफ अघायल ऊतक के पहले बाल कूप(चित्रा 4ए, बी)।
    3. इन दो स्थलों तक पहुंचने के लिए डर्मो-एपिडर्मल जंक्शन के साथ ट्रेस करें। यदि एपिडर्मिस पूरे घाव को कवर नहीं करता है, तो घाव के एक तरफ डर्मो-एपिडर्मल जंक्शन का पालन करें और जहां माइग्रेटिंग जीभ समाप्त होती है दाने के ऊतकों के बेहतर पहलू या दाने के ऊतकों और पपड़ी के बीच जंक्शन का पालन करते हुए जब तक आप माइग्रेटिंग जीभ तक नहीं पहुंच जाते और फिर अंत में दूसरी तरफ अघायल ऊतक के पहले बाल कूप(चित्रा 4ई, एफ)।
    4. विश्लेषण केतहत , उपायपर क्लिक करें । माप की लंबाई पैमाने में सेट के रूप में एक ही इकाइयों में दिखाई देगा।
    5. माप(अनुपूरक तालिका 1)का ट्रैक रखने के लिए एक स्प्रेडशीट बनाएं।
    6. घाव की लंबाई को स्प्रेडशीट में कॉपी करें।
  4. एपिडर्मल लंबाई को मापें
    1. यदि एपिडर्मिस पूरे घाव को कवर करता है, तो एपिडर्मल लंबाई घाव की लंबाई के समान है।
      1. एक्सेल स्प्रेडशीट में "एपिडर्मल लेंथ" कॉलम में "घाव की लंबाई" माप को कॉपी करें और 11.5 चरण के लिए छोड़ दें।
    2. यदि एपिडर्मिस पूरे घाव को कवर नहीं करता है, तो"फ्रीहैंड चयन"का चयन करें और दाने ऊतक के बेहतर पहलू या दानेदार ऊतक और पपड़ी के बीच जंक्शन के बाद प्रत्येक एपिडर्मल लीडिंग एज के बीच की दूरी को पहले बाल कूप(चित्रा 4सी, डी)में मापें।
      1. विश्लेषण केतहत , उपायपर क्लिक करें ।
      2. घाव की लंबाई से इस माप को घटाएं और एक्सेल स्प्रेडशीट में "एपिडर्मल लेंथ" के तहत संख्या रिकॉर्ड करें।
  5. घाव क्षेत्र को मापें
    1. फिजी टूलबार पर"फ्रीहैंड चयन"का चयन करें।
    2. घाव के एक तरफ अघायल ऊतक के अंतिम बाल कूप से शुरू उपाय घाव के दूसरी तरफ अघायल ऊतक के पहले बाल कूप(चित्रा 4ए, बी, ई, एफ)।
    3. एपिडर्मिस के बेहतर पहलू के साथ ट्रेस करें (स्कैब शामिल नहीं है) या ग्रैनुलेशन ऊतक का बेहतर पहलू यदि घाव पूरी तरह से एपिडर्मिस द्वारा कवर नहीं किया जाता है।
    4. बालों के कूप के साथ खड़ी का पता लगाना जारी रखें एक बार विपरीत बाल कूप पहुंच जाता है और जब तक आदिपोस ऊतक या मांसपेशियों तक नहीं पहुंच जाता है। घाव के विपरीत दिशा में दानेदार ऊतक की अवर सीमा का पालन करें और क्षेत्र को बंद करने के लिए बाल कूप के साथ शुरुआती बिंदु में शामिल हों(चित्रा 4ई, एफ)।
    5. विश्लेषण केतहत , उपायपर क्लिक करें ।
    6. "घाव क्षेत्र मापा" के तहत स्प्रेडशीट में घाव क्षेत्र की नकल करें ।
  6. एपिडर्मल क्षेत्र को मापें
    1. फिजी टूलबार पर"फ्रीहैंड चयन"का चयन करें।
    2. घाव पूरी तरह से एपिथेलाइज्ड है:
      1. एपिडर्मिस के बेहतर पहलू के साथ ट्रेस करें जब तक कि विपरीत बाल कूप तक पहुंच न जाए और एपिडर्मिस और डर्मिस(चित्रा 4D)के बीच डर्मो-एपिडर्मल जंक्शन के बाद शुरुआती बिंदु पर "रिटर्निंग" करके क्षेत्र को पूरा करें।
      2. विश्लेषण केतहत , उपायपर क्लिक करें ।
      3. "एपिडर्मल एरिया मापा" के तहत एक्सेल स्प्रेडशीट में एपिडर्मल एरिया कॉपी करें और 11.7 कदम तक छोड़ दें।
    3. यदि घाव पूरी तरह से एपिथेलाइज्ड नहीं है:
      1. अग्रणी किनारे तक एपिडर्मिस के बेहतर पहलू के साथ ट्रेस करें और डर्मो-एपिडर्मल जंक्शन(चित्रा 4 सी)के बाद शुरुआती बिंदु पर लौटें।
      2. विश्लेषण केतहत , उपायपर क्लिक करें ।
      3. घाव के विपरीत दिशा में 11.6.3.1 और 11.6.3.2 दोहराएं।
      4. विश्लेषण के तहत, उपाय पर क्लिक करें।
      5. चरणों में प्राप्त दो नंबरों को 11.6.3.2 और 11.6.3.4 पर प्राप्त करें और स्प्रेडशीट में "एपिडर्मल एरिया मापा" के तहत परिणाम दर्ज करें।
  7. हर 40 सेक्शन (हर 8 स्लाइड) पर11.3 से11.6 तक रिपीट करें।
  8. पूरे घाव के एपिडर्मल क्षेत्र की गणना करें।
    1. स्प्रेडशीट में एक नया कॉलम बनाएं "एपिडर्मल लंबाई" के बगल में "एपिडर्मल एरिया की गणना" करें।
    2. पिछले एक (7 माइक्रोन मोटी अनुभाग x 40 वर्गों) को छोड़कर प्रत्येक खंड के लिए 280 तक "एपिडर्मल लंबाई" के लिए संख्या गुणा करें।
    3. पिछले खंड (अनुभाग की मोटाई) के लिए "एपिडर्मल लंबाई" के लिए संख्या को 7 से गुणा करें।
    4. पूरे घाव के एपिडर्मल क्षेत्र को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक खंड के लिए "एपिडर्मल क्षेत्र की गणना" का मूल्य राशि।
  9. पूरे घाव के घाव क्षेत्र की गणना करें।
    1. घाव की लंबाई माप का उपयोग करके चरण 11.8.1 से 11.8.4 तक दोहराएं।
  10. पूरे घाव के एपिडर्मल वॉल्यूम की गणना करें।
    1. "एपिडर्मल एरिया मापा" माप का उपयोग करके 11.8.1 से 11.8.4 तक दोहराएं।
  11. पूरे घाव के घाव की मात्रा की गणना करें।
    1. "घाव क्षेत्र मापा" माप का उपयोग करते हुए 11.8.1 से 11.8.4 तक दोहराएं।
  12. घाव में एपिडर्मल वॉल्यूम के प्रतिशत की गणना करें।
    1. कुल घाव की मात्रा से कुल एपिडर्मल वॉल्यूम को विभाजित करें और प्रतिशत प्राप्त करने के लिए 100 से गुणा करें (प्रत्येक अनुभाग के लिए यह अनुपात न करें)।
  13. घाव क्षेत्र के बीच एपिडर्मल क्षेत्र के प्रतिशत की गणना करें।
    1. कुल घाव क्षेत्र द्वारा कुल एपिडर्मल क्षेत्र को विभाजित करें और प्रतिशत प्राप्त करने के लिए 100 से गुणा करें। यदि कोई घाव पूरी तरह से एपिथेलाइज्ड है, तो यह संख्या 100 होनी चाहिए।

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Representative Results

चित्र 5 में कई सर्जनों द्वारा विभिन्न माउस उपभेदों में उत्पन्न जंगली प्रकार के घावों पर मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण करके प्राप्त मापा और गणना मूल्यों में सीमा को दर्शाया गया है और विभिन्न व्यक्तियों द्वारा विश्लेषण किया गया है। विभिन्न उपभेदों से जंगली प्रकार के चूहे सांख्यिकीय मतभेदों को प्रदर्शित कर सकते हैं जैसा कि हमारे अध्ययनों और साहित्य9,10दोनों में वर्णित है। इन प्रतिनिधि परिणामों के आधार पर, हम अनुशंसा करते हैं कि, एक अध्ययन के भीतर, केवल एक तनाव से चूहों का उपयोग किया जाए। यद्यपि हम अनुशंसा करते हैं कि एक ही व्यक्ति एक विशेष अध्ययन के भीतर सभी घावों का प्रदर्शन करता है, कई व्यक्ति सर्जन के रूप में कार्य कर सकते हैं जब तक कि 0 दिन में घावों का क्षेत्र व्यक्ति के काम के बीच सांख्यिकीय रूप से अलग नहीं है। अंत में, क्योंकि इस प्रोटोकॉल में वर्णित मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण व्यापक हो सकता है, कई व्यक्ति एक ही प्रयोग के कुछ हिस्सों का विश्लेषण कर सकते हैं, लेकिन केवल तभी जब दो नमूनों के उनके विश्लेषण के परिणाम एक दूसरे के 5% के भीतर हों। हालांकि, पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक ही व्यक्ति को अंधे तरीके से घावों का विश्लेषण करना बेहतर होता है।

चित्रा 6 घाव के "मध्य" और 40 आसपास के वर्गों से प्राप्त माप के साथ इस अध्ययन11 में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके प्राप्त घाव माप की तुलना में एक मेटा-विश्लेषण प्रदर्शित करता है। चित्रा 6 एमें, एपिडर्मल क्षेत्र और घाव क्षेत्र की गणना घाव क्षेत्र के बीच एपिडर्मल क्षेत्र के प्रतिशत की गणना के बाद घाव वर्गों पर एपिडर्मल और घाव की लंबाई के माप से की गई थी (कभी-कभी "बंद होने का प्रतिशत" या "एपिथेलिलाइजेशन का प्रतिशत") के रूप में जाना जाता है)। इसी तरह, चित्रा 6Bमें, घाव में एपिडर्मिस का प्रतिशत घाव की मात्रा (मापा गए एपिडर्मल क्षेत्र से गणना) के अनुपात के रूप में प्राप्त किया गया था। दोनों मापदंडों के लिए, पूरे घाव के विश्लेषण ने समूहों के बीच मजबूत सांख्यिकीय मतभेदों को दिखाया (पी एंड एलटी तक; 0.001 वन-वे इनोवा के बाद)। हालांकि, महत्व (पी & 0.01 तक वन-वे इनोवा के बाद) कम हो गया था जब बीच में केवल 40 वर्गों का विश्लेषण किया गया था। ये परिणाम महत्व के स्तर में कमी प्रदर्शित करते हैं जब घाव के केवल सबसेट का विश्लेषण किया जाता है। इन आंकड़ों का सुझाव है कि एक छोटे से प्रभाव आकार के साथ दोषों की संभावना केवल जब पूरे घाव पर morphometric विश्लेषण प्रदर्शन का पता लगाया जाएगा, और है कि अधिक हल्के घाव चिकित्सा फेनोटाइप विश्लेषण के एक "घाव के बीच" प्रकार से याद किया जाएगा ।

वीवो घाव भरने में विश्लेषण करने के लिए सामान्य अभ्यास में घाव में कहीं चुने गए हिस्टोलॉजिकल वर्गों पर घाव के क्षेत्र कोमापनाशामिल है । इस बात को ध्यान में रखते हुए, पूरे घावों के धारावाहिक खंडों से मापा घाव क्षेत्र के औसत की तुलना मध्य सबसेट वर्गों से प्राप्त एक के साथ की गई थी। परिणामों में प्रयोगात्मक समूहों के बीच और विश्लेषण की विधि(चित्रा 6C)के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया गया । हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल घाव की मात्रा की गणना करने के लिए पूरे घाव पर मापा क्षेत्र (चित्रा 6Cमें दिखाया गया) का उपयोग करता है। जैसा कि चित्रा 6Dमें दिखाया गया है, गणना किए गए घाव की मात्रा (जिसकी गणना केवल पूरे घाव के विश्लेषण का उपयोग करके की जा सकती है) प्रयोगात्मक समूहों के बीच काफी अलग है। संक्षेप में, ये प्रतिनिधि परिणाम इस प्रोटोकॉल में वर्णित घाव उपचार मापदंडों के गहन हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के महत्व को प्रदर्शित करते हैं ताकि फेनोटाइप का पता लगाया जा सके जो अन्यथा अधिक पारंपरिक घाव उपचार विश्लेषण का उपयोग करके याद किया गया होगा।

Figure 1
चित्रा 1: द्विपक्षीय उत्तेजना घाव प्रक्रिया। (एक)सर्जिकल क्षेत्र से कतरन और शेविंग बालों के बाद एक माउस की प्रतिनिधि तस्वीर । (ख)त्वचा पृष्ठीय मिडलाइन के साथ कंधे के ब्लेड के बीच चुटकी ली । (ग)त्वचा के साथ अपनी तरफ स्थित माउस फ्लैट रखा । (घ)बायोप्सी पंच प्लेसमेंट का प्रतिनिधित्व । (ई)मुक्का मारा त्वचा। (च)दिन 0 में दो द्विपक्षीय घावों के साथ माउस और उत्पादित पंच बायोप्सी नियंत्रण ऊतकों के रूप में सफेद तीर द्वारा संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: घाव फसल प्रक्रिया। (ए-सी) 4 दिन(ए),7 दिन(बी)और 11 दिन(सी)के बाद 6 मिमी एक्ससिओनल घावों की स्थूल तस्वीरें । (D-E) एक स्केलपेल ब्लेड के साथ, एक विस्तृत आयत के आकार में एक कटनीस चीरा बनाया गया था जिसमें घाव और आसपास के अघाव ऊतक शामिल हैं। (च)त्वचा को अंतर्निहित ऊतकों से संदंश और कैंची के साथ छोड़ा गया था। (जी)काटा द्विपक्षीय घावों का प्रतिनिधित्व । (ज)बिंदीदार सफेद रेखा ऊतक की सीमा का प्रतिनिधित्व करता है जिसे पंच बायोप्सी के उपयोग के बाद काटा जाएगा (यह विधि काटे गए ऊतकों की मानकीकृत मात्रा के लिए अनुमति देती है)। (I)बिंदीदार सफेद रेखा ऊतक की सीमा का प्रतिनिधित्व करता है जिसे हिक्टोलॉजी के लिए छंटनी की जाएगी (आयताकार आकार आसान एम्बेडिंग के लिए अनुमति देता है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विलयन समय (मिनट) तापमान (सेल्सियस) दबाव (केपीए)
80% एटोह 30 प्रारंभ N/A
95% ईटीओएच 30 प्रारंभ N/A
100% ईटीओएच 30 प्रारंभ N/A
जाइलीन 30 प्रारंभ N/A
जाइलीन 30 प्रारंभ N/A
पैराफ़िन 30 60 20
पैराफ़िन 30 60 20

तालिका 1: पैराफिन एम्बेडिंग के लिए नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया। आर टी = कमरे का तापमान। N/A = लागू नहीं।

Figure 3
चित्रा 3: घाव एम्बेडिंग और सेक्शनिंग। (A)पैराफिन प्रोसेस्ड घाव एक एम्बेडिंग मोल्ड में फ्लैट पड़ा हुआ है । (ख)घाव एम्बेडिंग के लिए मोल्ड की क्षैतिज सतह से 90 डिग्री ("खड़े") पर आयोजित किया गया था। (ग)पैराफिन एम्बेडेड घाव को ठीक से सेक्शनिंग के लिए उन्मुख(डी)माइक्रोटॉम पर चढ़कर पैराफिन ब्लॉक को सफेद कोष्ठक द्वारा इंगित 5-सेक्शन वेतन वृद्धि में काटे गए लगभग 20 खंडों(ई)पैराफिन रिबन के रिबन में विभाजित किया गया था । (एफ)गर्म पानी के स्नान (40-45 डिग्री सेल्सियस) में फ्लैट रखे गए सीरियल सेक्शन को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखा गया था । (ए-सी)में कार्टून प्रत्येक चरण के लिए एपिडर्मिस (ई) और डर्मिस (डी) के उचित अभिविन्यास के साथ त्वचा (नीले) में घाव (नारंगी) का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: घावों की हिस्टोलॉजिकल विशेषताएं और रूपोमेट्रिक मापदंडों का चित्रण। (ए, बी) एक दिन 4(ए)और एक दिन 7(बी)6 मिमी घाव की हिस्टोलॉजिकल विशेषताएं। (सी-एफ) मात्रात्मक मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न मापों का प्रतिनिधित्व: एपिडर्मिस(सी, डी,बिंदीदार काली रेखा), एपिडर्मिस(सी, डी,पीले छायांकित क्षेत्र), घाव की लंबाई(ई, एफ,बिंदीदार पीली रेखा) और पूरे घाव के मापा क्षेत्र(ई, एफ,ग्रे छायांकित क्षेत्र) की लंबाई। एचएफ = बाल कूप; स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिनिधि की मॉर्फोमेट्रिक विशेषताएं 4 दिन, 7 दिन और दिन 11 के बाद घायल होने पर 6 मिमी जंगली प्रकार के घाव। बिखरे हुए भूखंड कई सर्जनों द्वारा विभिन्न माउस उपभेदों में उत्पन्न 6 मिमी जंगली प्रकार के घावों के मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण से प्राप्त डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं और विभिन्न व्यक्तियों द्वारा विश्लेषण किया जाता है। (A)घाव की मात्रा,(बी)एपिडर्मल वॉल्यूम,(सी)घाव में एपिडर्मिस का प्रतिशत,(डी)घाव क्षेत्र (गणना),(ई)एपिडर्मल क्षेत्र (गणना), औरघावक्षेत्र के बीच एपिडर्मल क्षेत्र का प्रतिशत मॉर्फोमेट्रिक मूल्यों में भिन्नता की सीमा को प्रदर्शित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: मेटा-विश्लेषण घाव के बीच के साथ पूरे घाव से प्राप्त मापदंडों की तुलना उच्च महत्व के साथ नए दोषों की पहचान करता है । घाव हीलिंग मॉर्फोमेट्री दिन 7 घावों को नमकीन (नियंत्रण), विकास कारक बीटा 3 (Tgfb3) को बदलने, एंटीबॉडी (Tgfb3 + NAB) को बेअसर करने और अकेले एंटीबॉडी को बेअसर करने के साथ किया गया था (एनएबी)। माप धारावाहिक खंडित घावों ("पूरे") या घाव ("मध्य") के बीच से 40 वर्गों पर किया गया था और घाव क्षेत्र(ए),घाव में एपिडर्मिस का प्रतिशत(बी),और घाव की मात्रा(डी)पर एपिडर्मल क्षेत्र के प्रतिशत की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता था। (ग)घाव के पूरे या मध्य पर मापा घाव क्षेत्र के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। * पी एंड एलटी; 0.05, ** पी एंड एलटी; 0.01, *** पी एंड एलटी; 0.001, एनएस = महत्वपूर्ण नहीं, वन-वे इनोवा)। इस आंकड़े को ले एट अल11से डेटा का उपयोग करके संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: मॉर्फोमेट्रिक माप रिकॉर्ड करने के लिए स्प्रेडशीट का एक उदाहरण। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

द्विपक्षीय एक्सीसिओनल घाव मॉडल एक अत्यधिक अनुकूलन प्रक्रिया है जिसका उपयोग घाव भरने के कई अलग-अलग पहलुओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। घाव भरने की परियोजना शुरू करने से पहले, जांचकर्ताओं को एक विशेष प्रभाव आकार के दोष का पता लगाने के लिए आवश्यक घावों की संख्या निर्धारित करने के लिए एक शक्ति विश्लेषण करना चाहिए। साहित्य के भीतर विसंगतियां मौजूद हैं कि क्या व्यक्तिगत चूहों या घावों को जैविक प्रतिकृति के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, हालांकि, हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि एक ही जानवर4पर दो घावों के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध नहीं है। इससे पता चलता है कि एक ही जानवर से घाव एक दूसरे से स्वतंत्र होते हैं और उन्हें जैविक प्रतिकृति माना जा सकता है, जिससे दोष का पता लगाने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या कम हो जाती है। छोटे प्रभावों के आकार पर विचार करते समय यह प्रासंगिक है जिसके लिए अधिक संख्या में घावों की आवश्यकता है4महत्व तक पहुंचने के लिए । इसके अलावा, शक्ति गणना के परिणाम प्रत्येक जानवर पर कितने घावों को प्रभावित कर सकते हैं, प्रति जानवर 2 और 4 घाव सबसे आम हैं।

सर्जिकल प्रोटोकॉल भी अत्यधिक लचीला है। जबकि हम छोटी प्रक्रिया की लंबाई और त्वरित वसूली (10-15 मिनट प्रति माउस) के कारण आइसोफ्लारेन वाष्पीकरण द्वारा एनेस्थेटाइजेशन की सलाह देते हैं, वाष्पीकरण तक पहुंच के बिना जांचकर्ता केटामाइन/जाइलाज़ीन या पेंटोबार्बिटल सहित इंजेक्शन संज्ञाहरण का उपयोग कर सकते हैं। एक उपयुक्त एनाल्जेसिक का चयन विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह घाव भरने के भड़काऊ चरणों से संबंधित है। फ्लूनिक्सिन मेग्लुमीन या मेलोक्सीकम जैसी नॉनस्टेरॉयड एंटी-भड़काऊ दवाओं (एनईएसएस) के इस्तेमाल को सावधानी के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए क्योंकि वे सूजन को कम कर सकते हैं । इसलिए, ओपिओइड को अध्ययनों में पसंद किया जाता है जहां सूजन की जांच की जा रही है। हम एनाल्जेसिक (जैसे, बुप्रेनोरफिन निरंतर-रिलीज) की सलाह देते हैं जो एनाल्जेसिया के 48 घंटे तक प्रदान करते हैं और दोहराए गए, अतिरिक्त खुराक की आवश्यकता को समाप्त करते हैं। सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को संघीय दिशानिर्देशों के अनुसार निष्पादित किया जाना चाहिए और एक अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल द्वारा समर्थित होना चाहिए।

घाव भरने वाली एक प्रक्रिया है जिसमें कई चरण शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक को अलग-अलग कोशिका प्रकार3से जुड़ी विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं की विशेषता है। भड़काऊ चरण 0 और 5 दिनों के बीच होता है, जिसमें पॉलीमॉर्फोक्लियर न्यूट्रोफिल (पीएमएन) और मैक्रोफेज के शुरुआती प्रवास के साथ चोट13की साइट पर होता है। यह प्रजनन चरण 3 से 14 दिनों के बीच होता है जिसमें घाव के आकार के आधार पर पुन: धर्मनिर्ष्ठा होती है जिसमें14घाव के आकार के आधार पर अलग - अलग समय लिया जाता है । इस प्रोटोकॉल में, हमने 6 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग किया और अधिकांश घावों को 7 दिनों तक फिर से एपिथेलाइज्ड किया गया। हालांकि, इस समय सीमा को छोटा करने की आवश्यकता होगी यदि छोटे घूंसे का उपयोग किया जाता था (वे 1 मिमी के रूप में छोटे के रूप में उपलब्ध हैं)। पहले के समय बिंदुओं के संयोजन में, ये छोटे घाव हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की मात्रा को कम करने के लिए बेहतर हो सकते हैं15। अंत में, रीमॉडलिंग और परिपक्वता चरण 7 दिनों के बाद और चोट16के बाद एक साल तक होते हैं। इन बाद के समय अंक घाव की परिपक्वता की जांच करने के लिए या प्रयोगात्मक जानवरों में घाव भरने में देरी की जांच करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसलिए, अन्वेषक को अपनी विशेष परिकल्पना5के आधार पर घाव भरने के विशेष चरणों की जांच करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण समय बिंदुओं का निर्धारण करने की आवश्यकता होगी ।

घाव भरने का विश्लेषण अक्सर हिस्टोलॉजिकल विश्लेषणों तक ही सीमित नहीं होता है। अन दागदार पैराफिन वर्गों का उपयोग अतिरिक्त विश्लेषणों जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस या कोलेजन जमाव के लिए मैसन के ट्राइक्रोम के लिए किया जा सकता है। नियंत्रण ऊतक (पंच बायोप्सी) के प्रसंस्करण और ऊतक के कटाई चरण सभी इस बात पर निर्भर करेंगे कि हिस्टोलॉजिकल विश्लेषणों के अलावा, घाव भरने का आकलन कैसे किया जाता है। सर्जिकल प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में, एक्ससिओनल घाव उत्पन्न करने के लिए पंच बायोप्सी को हटा दिया जाता है। ये घूंसे प्रोटीन (पश्चिमी या साइटोकिन प्रोफाइलिंग के लिए), डीएनए या आरएनए निष्कर्षण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अनगूफ्ड कंट्रोल ऊतक के रूप में काम कर सकते हैं और तदनुसार संसाधित किया जाना चाहिए। यह सिफारिश की जाती है कि हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए कम से कम एक पंच को बचाया जाए, विशेष रूप से उन मामलों में जहां घायल होने से पहले त्वचा का इलाज किया जाता है (उदाहरण के लिए, क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन17को शामिल करने के लिए टैमोक्सिफेन का आवेदन)। पंच की परीक्षा क्यूटेनियस आकृति विज्ञान पर उपचार के प्रभाव को निर्धारित कर सकती है या बस विशेष माउस मॉडल के बेसलाइन क्यूटनीस आकृति विज्ञान के मूल्यांकन की अनुमति दे सकती है। हिस्टोलॉजी के लिए उपयोग नहीं किए जाने वाले घावों को एक पंच बायोप्सी के साथ काटा जा सकता है जिसमें घाव का आकार शामिल है। इस प्रक्रिया के कुछ फायदे हैं, जिसमें घाव के आकार की परवाह किए बिना ऊतक की समान मात्रा में कटाई शामिल है (बड़े घावों में स्वस्थ ऊतकों के आसपास कम होता है)। अंत में, हम क्रमशः ऊतकों के संरक्षण और एम्बेडिंग के लिए सामग्री के रूप में फिक्सेटिव और पैराफिन के रूप में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के उपयोग का वर्णन करते हैं। कुछ अनुप्रयोगों के लिए अन्य फिक्सेटिव्स की आवश्यकता हो सकती है और उन्हें प्रतिस्थापित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, कार्नॉय या बोइन के फिक्सेटिव)। सबसे अच्छा इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला के लिए, ठंड और इष्टतम काटने तापमान यौगिक में घाव के एम्बेडिंग के बाद जमे हुए खंड द्वारा पीछा किया पसंद की विधि बनी हुई है ।

घायल ऊतक की धारा कई चुनौतियों, विशेष रूप से दिन 4 घावों क्योंकि पपड़ी की उपस्थिति के पेश कर सकते हैं । उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों को उत्पन्न करने के लिए, यह सत्यापित करने की सिफारिश की जाती है कि माइक्रोटॉम के सभी हिस्सों को कसकर बांधा जाता है, ब्लॉक धारक अपनी प्रारंभिक स्थिति से मुकर जाता है, ब्लेड धारक 0 और 10 डिग्री के बीच सेट किया जाता है और ब्लेड कसकर बांधा जाता है लेकिन ओवरटाइट नहीं होता है। हालांकि पैराफिन ब्लॉक ठंडा है, ऊतक अभी भी टुकड़ा हो सकता है । यदि श्रेडिंग जारी रहती है, तो बर्फ का एक टुकड़ा ब्लॉक पर 5 मिनट के लिए रखा जा सकता है, जबकि अभी भी घुड़सवार। एक बार सेक्शनिंग शुरू हो जाने के बाद, पैराफिन वर्गों के नुकसान को रोकने के लिए माइक्रोटॉम से ब्लॉक को हटाने से बचने के लिए अत्यधिक सिफारिश की जाती है। सीरियल सेक्शनिंग में उनकी संख्या और उनकी रैंकिंग दोनों ही किसी भी खोए हुए पैराफिन सेक्शन को रिकॉर्ड करना जरूरी है । यह मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण को प्रभावित करेगा और इस पर विचार करने की आवश्यकता है। खंड शुरू करने के बाद, अन दाग वर्गों पर घायल ऊतक की पहचान मुश्किल हो सकती है, खासकर अगर हिस्टोलॉजी से परिचित नहीं है। संदेह होने पर, रूढ़िवादी होने और ऊतक वाले सभी वर्गों को रखने की सिफारिश की जाती है। एक बार हिस्टोलॉजिकल दाग प्रदर्शन किया जाता है, ऊतक संगठन और अधिक स्पष्ट हो जाएगा और घाव अधिक अलग है । कभी-कभी, बालों के रोम स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं दे सकते हैं या घाव के किनारे से दूर हो सकते हैं। यदि यह मामला है, घायल ऊतक की अन्य प्रमुख विशेषताओं का उपयोग घाव की सीमाओं को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है जिसमें अचानक वृद्धि शामिल है और इसके बाद संयोजी ऊतक के संगठन में तत्काल कमी और संयोजी ऊतक(चित्रा 4ए-बी)में तेज परिवर्तन होते हैं।

डिजिटल इमेजिंग मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम है। बार-बार मापन से बचने के लिए प्रत्येक छवि पर एक मील का पत्थर का उपयोग करके व्यक्तिगत छवियों पर मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण किया जाना चाहिए। हालांकि, डिजिटल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सभी फ्रेम को एक साथ सिलाई करना और एक ही छवि पर विश्लेषण करना संभव है। हालांकि यह पहली बार में आसान लगता है, एक बड़ी छवि के हेरफेर विश्लेषण प्रक्रिया को धीमा कर सकते हैं । विश्लेषण के लिए अनुभाग का विकल्प भी महत्वपूर्ण है। यद्यपि हम हर 8 वीं स्लाइड के शीर्ष अनुभाग को डिजिटल रूप से प्राप्त करने की सलाहदेते हैं, लेकिन अनुभाग की गुणवत्ता को प्राथमिकता दी जानी चाहिए और उस स्लाइड पर 5 वर्गों में से सर्वश्रेष्ठ को इमेज किया जाना चाहिए। छोटे सिलवटों वाले वर्गों का विश्लेषण अभी भी गुना के क्षेत्र/लंबाई का आकलन करके किया जा सकता है । उस विशेष अनुभाग की संख्या डिजिटल फ़ाइल और एक्सेल स्प्रेडशीट दोनों में दर्ज की जानी चाहिए, जैसे कि पिछले और अगले विश्लेषण अनुभाग के बीच की दूरी को तदनुसार समायोजित किया जा सकता है।

Cutaneous घावों को प्रभावित करने के लिए एक अनुमान के साथ 6.5 करोड़ डॉलर सालाना18 डॉलर की लागत से उपचार के साथ और मधुमेह और मोटापे सहित कई अन्य स्वास्थ्य चिंताओं के लिए माध्यमिक होने के अलावा शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का एक अंतर्निहित घटक हैं. माउस को मानव विकार की तुलना में अक्सर एक सूक्ष्म फेनोटाइप प्रदर्शित करने के बावजूद, अपने जीनोम में हेरफेर करने में आसानी के कारण मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित द्विपक्षीय एक्सीसिओनल घाव मॉडल और बाद में मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण महत्वपूर्ण है क्योंकि स्वाभाविक रूप से जटिल घाव भरने की प्रक्रिया में मामूली दोषों का पता लगाने में कठिनाई को दूर करने की क्षमता19है । इसकी अधिक संवेदनशीलता और कम परिवर्तनशीलता के कारण, यह प्रोटोकॉल एक ही प्रयोगात्मक संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए कम जानवरों का उपयोग करने के अवसर प्रदान करता है। प्रोटोकॉल अत्यधिक अनुकूलन योग्य है और ऊतक की मरम्मत के सभी चरणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊतक के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन के साथ संयोजन में विस्तृत हिस्टोलॉजिकल रूप्ण विश्लेषण में ऊतक की मरम्मत को कम करने वाले महत्वपूर्ण कारकों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक ज्ञान को बढ़ाने की काफी क्षमता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम डनवाल्ड लैब के उन सभी सदस्यों के आभारी हैं जिन्होंने वर्षों से इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में योगदान दिया है, और जीना Schatteman जिनके घाव विश्लेषण के लिए धारावाहिक अनुभागिंग के उपयोग को बढ़ावा देने में हठ ने इसकी रचना को संभव बनाया। इस काम को एनआईएच/एनआईएएमएस से मार्टिन डनवाल्ड (AR067739) तक फंडिंग से सपोर्ट मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol
70% ethanol
80% ethanol
95% ethanol
Alcohol Prep NOVAPLUS V9100 70% Isopropyl alcohol, sterile
Ammonium hydroxide
Biopsy pads Cellpath 22-222-012
Black plastic sheet Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper
Brightfield microscope With digital acquisition capabilities and a 4X objective
Cotton tipped applicators
Coverslips 22 x 60 #1
Dental wax sheets
Digital camera Include a ruler for scale, if applicable
Dissection teasing needle (straight)
Embedding molds 22 x 22 x 12
Embedding rings Simport Scientific Inc. M460
Eosin Y
Glacial acetic acid
Hair clipper
Heating pad Conair Moist dry Heating Pad
Hematoxylin
Microtome
Microtome blades
Paint brushes
Paraffin Type 6
Paraformaldehyde
Permount
Phosphate buffer solution (PBS)
Povidone-iodine Aplicare 82-255
Processing cassette Simport Scientific Inc. M490-2
Razor blades ASR .009 Regular Duty
Scalpel blades #10
Scalpel handle
Sharp surgical scissors sterile for surgery
Skin biopsy punches Size as determined by researcher
Slide boxes
Slide warmers
Superfrosted microscope slides Fisher Scientific 22 037 246
Temperature control water bath
Tissue embedding station Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate
Tissue processor Minimum of a oven with a vacuum pump
Triple antibiotic opthalmic ointment
tweezers, curved tip sterile for surgery
tweezers, tapered tip sterile for surgery
WypAll X60 Kimberly-Clark 34865

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References

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JoVE में इस महीने अंक 162 घाव भरने उत्तेजना घाव हिस्टोलॉजी आकृति त्वचा माउस सर्जरी ऊतक की मरम्मत
मुरीन एक्सिसिओनल घाव हीलिंग मॉडल और हिस्टोलॉजिकल मॉर्फोमेट्रिक घाव विश्लेषण
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Rhea, L., Dunnwald, M. Murine… More

Rhea, L., Dunnwald, M. Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61616, doi:10.3791/61616 (2020).

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