Summary
В этом протоколе описывается, как генерировать двусторонние, полно толщины эксцисионных ран у мышей и как впоследствии контролировать, собирать урожай и готовить раны к морфометрическому анализу. Включено подробное описание того, как использовать серийные гистологические разделы для определения, точной количественной оценки и обнаружения морфометрических дефектов.
Abstract
Murine excisional рана модель была широко использована для изучения каждого из последовательно перекрывающихся фаз заживления ран: воспаление, пролиферацию и ремоделирование. Мурин раны имеют гистологологически четко определенные и легко узнаваемые раны кровать, над которой эти различные фазы процесса заживления поддаются измерению. В полевых условиях для гистологических анализов обычно используется произвольно определенная «середина» раны. Однако раны являются трехмерной сущностью и зачастую не являются гисто логически симметричными, что поддерживает необходимость в четко определенном и надежном методе количественной оценки для обнаружения морфометрических дефектов с небольшим размером эффекта. В этом протоколе мы описываем процедуру создания двусторонних, полно толщины эксцизированных ран у мышей, а также подробную инструкцию о том, как измерить морфометрические параметры с помощью программы обработки изображений на отдельных серийных разделах. Двухмерные измерения длины раны, эпидермальной длины, эпидермальной области и области раны используются в сочетании с известным расстоянием между секциями для экстраполяции трехмерной эпидермальной области, покрывающей рану, общую область раны, эпидермальный объем и объем раны. Хотя этот подробный гистологический анализ занимает больше времени и ресурсов, чем обычные анализы, его строгость повышает вероятность обнаружения новых фенотипов в изначально сложном процессе заживления ран.
Introduction
Заживление к cutaneous раны сложный биологический процесс с последовательно перекрывая участками. Она требует координации клеточных и молекулярных процессов, которые временно и пространственно регулируются для восстановления барьерной функции поврежденного эпителия. На первой фазе воспаление, нейтрофилов и макрофаги мигрируют в рану, мобилизуя местную и системнуюзащиту 1. После и перекрытия воспалительной фазы является стадия распространения. Фибробласты начинают быстро размножаться и мигрировать в гранулированную ткань. Кератиноциты от ведущего края направленно размножаются к ране, как дифференцированные кератиноциты в переднем крае мигрируют, чтобы повторно эпителиализироватьрану 2. Наконец, начинается фаза ремоделирования и созревания, во время которой фибробласты в гранулированной ткани начинают синтезировать и от депозитать коллаген. Реконструкция и организация новой матрицы может длиться до 1 года после травмы3. Из-за сложности перекрывающихся событий, связанных с перекрестным разговором между несколькими типами клеток, и, несмотря на годы исследований, многие клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе заживления ран, остаются плохо понятыми.
Модель мыши является преобладающей моделью млекопитающих для исследования механизмов заживления ран из-за их простоты использования, относительно низкой стоимости игенетической манипулябельности 1,4,5. Хотя различные типы ран были описаны в модели мурина, наиболее распространенным является excisional раны (либо двусторонний удар или прямой удар биопсии), а затем разрезные моделираны 4. Эксцисионная модель раны имеет явное преимущество перед разрезной моделью, поскольку она по своей сути генерирует контрольную ткань, которая не прошла процесс заживления. Пунш биопсии ткани, которая вырезана в рамках хирургического протокола могут быть обработаны таким же образом, как раненые ткани и используется для создания гомеостатической условия для желаемого критерия. Акцизная контрольная ткань также может быть полезна при оценке последствий предлечения кожи или подтверждении успешного изменения гена во время травмы4.
Параметры исцеления могут быть оценены по различным методикам, включая планиметрию или гистологию. Тем не менее, планиметрия может только оценить видимые характеристики раны, и из-за наличия парши, часто не коррелирует с измерениями исцеления, которые визуализированы гистологии, тем самым делая гистологию "золотым стандартом" анализа4. Несмотря на гистологический анализ, является золотым стандартом, чаще всего он выполняется на произвольном подмножествераны 6,7. Например, сокращение раны на "половину" до встраивания и секции раны в настоящее время является обычной практикой для сокращения времени и ресурсов, затраченных на секционные материалы и анализ данных. Метод морфометрического анализа, описанный в этом протоколе, был разработан, чтобы охватить всю раневую ткань, точно отражать морфологические характеристики раны, а также увеличить вероятность обнаружения дефектов заживления ран с небольшим размером эффекта. В этом протоколе мы подробно хирургического метода для генерации наиболее часто изученных мурин раны, двусторонней полной толщины эксцизной раны, а также подробный и строгий метод гистологического анализа такие редко используется в полевых условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были завершены в соответствии с федеральными правилами, а политика и процедуры Университета Айовы были одобрены МАКУК Университета Айовы.
1. Звери и мужство
- Используйте взрослых мышей желаемой линии мыши в возрасте 8-10 недель, когда стадия волосяного фолликула находится в телогене.
- В день операции, отдельные мыши в чистых клетках и индивидуально дома, чтобы свести к минимуму нарушение раны.
2. Хирургия
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости поддерживать стерильные хирургические условия. Хотя следует позаботиться о поддержании стерильности между животными, пунш биопсии сам делается на чистой, но нестерильной поверхности. Продолжительность операции на одного животного составляет от 10 до 15 минут.
- Обезболить
- Обезболивать животное в течение 1-2 мин в индукционной камере с изофлюран испарителем установлен на 4-5% скорости потока и кислорода поток метр установлен на 1 литр в минуту. Смотрите Обсуждение альтернативных вариантов анестезии.
- Подтвердите правильную анестезию перед началом процедуры. Глубина анестезии может быть подтверждена твердой щепоткой ноча.
- Перенесите мышь из индукционной тары в носовой конус и уменьшите скорость потока изофлюрана до 1,5%, а метр потока кислорода до 0,5 л/мин.
- Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, так как процедура превышает 5 мин.
- Поддерживайте нормальную температуру тела с помощью тепловой колодки.
- Подготовка места ранения
- Используйте электрический клипер бритвы в каудальном ростральном движении, чтобы удалить мех на задней части мыши на уровне плеча. Удалите волосы ниже на спине по мере необходимости, если выполняет более двух ран.
- Удалите оставшиеся волосы с помощью лезвия бритвы в ростральных каудаль движения, состоявшейся на 20 "от задней части мыши, чтобы внимательно побрить обрезанной области (Рисунок 1A).
- Очистите бритую область мазком повидоне-йода.
- Протрите кожу стерильным 70% изопропиловым спиртом, чтобы уменьшить потенциальное кленовое раздражение от йодного тампона.
- Ранив
- Pinch кожи между лопатками вдоль спинной средней линии и вытащить зажатой кожи от тела(рисунок 1B).
- Распоимите мышь на боку с помощью кожи на плоской поверхности, задрапированной чистым бумажным полотенцем или эквивалентом. Используйте лист зубного воска под полотенцем, чтобы защитить основную поверхность от повреждений(рисунок 1C).
- Поместите биопсии удар желаемого размера как можно ближе к телу, как это возможно и позволить коже расслабиться. Не растягивать кожу, или размер раны будет больше, чем назначенный размер удара(рисунок 1D).
- Удар кожи, нажав вниз, качание движение может быть использовано для обеспечения всех слоев кожи с обеих сторон были проникли (Рисунок 1E). Используйте новый пунш биопсии для каждого животного.
- Удалите пунш биопсии из ран(рисунок 1F). Если Есть еще сайты вложения использовать стерильные ножницы и пинцет, чтобы освободить удар от окружающей кожи. Процесс пунша биопсии контроля ткани по мере необходимости на основе вниз по течению планы для заживления ран анализов (см. Обсуждение предложений).
- Возьмите макроскопические фотографии с одинакового расстояния до раны или с линейкой в кадре, чтобы измерить начальную область раны и исключить выбросы из анализа.
- Администрирование анальгезии в течение как минимум 24 ч в соответствии с утвержденным протоколом животных. Например: Бупренорфин SR-LAB, вводят в качестве одной дозы подкожно на 0,5-2 мг/кг для 48 ч боли (см. Обсуждение для альтернативных предложений и соображений).
- Мониторинг мыши, как она выходит из анестезии, пока он не поддерживает вертикальную осанку и обычно ходит вокруг клетки.
3. Пост-мониторинг ран
- Мониторинг мышей ежедневно для экспериментальных конечных точек, как это определено следователем и в соответствии с институциональными протоколами. Примеры включают в себя: инфекция, видимая потеря веса, или сгорбившись осанку.
- Возьмите ежедневные макроскопические фотографии в контролируемой манере, как это было сделано после первоначальной операции.
4. Сбор ран
- Euthanize мышей в нужное время точки после раны в соответствии с утвержденным протоколом животных.
- Возьмите макроскопические фотографии раны сайтов в контролируемой манере в соответствии с предыдущим приобретением фотографии (Рисунок 2A,C).
- Вырезать широкий прямоугольник вокруг раны сайтов с помощью скальпеля (Рисунок 2D,E).
- Освободите прямоугольный кусок ткани с помощью ножниц и пинцета, чтобы очистить назад и отрезать кожу от основнойткани (рисунок 2F). Место в чашке Петри (Рисунок 2G).
- Урожай ран. Обрезка до 2 мм раскрученной ткани, окружающей все стороны раны в прямоугольной форме(рисунок 2H,I). Смотрите Обсуждение альтернативных вариантов для сбора раны.
- Обработать раны по мере необходимости для последующих исследований. Зарезервировать по крайней мере одну рану на мышь для встраивания парафина и гистологического анализа.
5. Фиксация ран и встраивание
- Исправить рану
- Зафиксировать раневую ткань в свежеприготовленном 4% параформальдегидномрастворе 8 для 3 ч при комнатной температуре, а затем перенести на 4 градуса Цельсия за ночь. Электронная микроскопия (EM) класса параформальдегид и фильтрация раствора не требуется.
- Вымойте раны дважды в течение 30 минут в 1x PBS.
- Замените PBS на 70% ETOH и храните при 4 градусах до встраивания. Обработать ткани в течение 24-48 ч, чтобы избежать потери антигена или в течение 1-2 недель, если только оценка гистологических характеристик.
- Обработать и встроить рану
- Перенесите каждую рану на встраиваемую кассету. Этикетка встраивания кассеты карандашом, как процесс будет удалить чернила.
- Обработать ткани либо вручную или с помощью автоматизированного процессора путем обезвоживания ткани с увеличением процентов этанола, очистка с ксиленом, а затем проникновение в ткани с парафиновым воском (Таблица 1).
- Вставлять рану на 90 градусов ("стоя") с горизонтальной поверхности встраиваемой формы(рисунок 3A,B).
6. День 0 анализ области раны
- Скачать свободное программное обеспечение NIH-Image J или NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Откройте файл с фотографией ран дня 0.
- Проверьте поле для "Область" под анализ | Набор измерений.
- Выберите "Установить шкалу" под анализ. Введите расстояние в пикселях, известное соответствующее расстояние и единицу расстояния (единица длины), если макроскопические измерения являются частью исследования или пропустить этот шаг, если требуются только относительные измерения.
- Выберите"Бесплатный выбор"на панели инструментов Фиджи.
- Очертьте периметр раны.
- Нажмите Мера под анализ.
- Создайте электронную таблицу, чтобы отслеживать измерения на одно животное на рану.
- Скопировать измерение области раны в таблице.
- Рассчитайте среднее количество и стандартное отклонение всех ран для данного эксперимента.
- Исключите любые раны за пределами двух стандартных отклонений среднего от гистологического анализа.
7. Серийный раздел
- Охладите парафин-встроенные раны блоков при 4 градусов по Цельсию на ночь.
- Вставьте парафиновый блок на держатель блока микротомы и ориентируйте так, чтобы лезвие разрезали прямо через блок. Ориентируйте блок так, что ткань «стоит» на 90 градусов, позволяя одновременное сечение эпидермиса и дермы(рисунок 3C,D).
- Сделайте 2-4 ленты по 20-30 парафиновых секций по 7 мкм каждая.
- Используйте сухую кисть краски и вскрытие дразнить иглы для передачи каждой ленты на твердую, но манипулируемой поверхности, такие как твердый черный пластиковый лист.
- Отсоедините верхнюю часть каждой ленты лезвием бритвы и поместите на слайд микроскопа.
- Наблюдайте за неоплеканными секциями под ярким микроскопом, чтобы определить, какие из них содержат раненые ткани, которые могут быть идентифицированы по отсутствию волосяного фолликула, изменениям во внешнем виде соединительной ткани или эпидермиса, и/или наличию парши(рисунок 4A,B).
- Отбросьте раскручиваемые секции до 20 секций до начала раны.
- Раздел через рану, повторяя шаги 7.3 и 7.4 до тех пор, пока рана не обнаружена в необлитых секциях.
8. Монтаж секций парафина
- Отдельные парафиновые секции каждые 5 секций с лезвием бритвы, начиная с первой ленты(рисунок 3E).
- Микроскоп этикетки скользит как с номером слайда, так и со всеми числами разделов.
- Захватите группу из 5 секций с мокрой кистью краски и плавать их на поверхности воды теплой водяной бани (40-45 градусов по Цельсию), чтобы сгладить их.
- Выберите группу из 5 секций из водяной ванны, используя один из помеченных слайдовмикроскопа (рисунок 3F)и поместите на слайде теплее набор при 37 градусов по Цельсию на срок до 24 ч.
- Храните слайды вертикально в слайд-поле.
9. Гистологическое окрашивание
- Перенесите каждый8-й слайд микроскопа (эквивалент каждой 40-йпарафиновой секции) на стойку для окрашивания и пятна гематоксилина и эозин.
10. Микроскопическая визуализация
- Приобретайте изображения с помощью яркого полевого микроскопа, оснащенного 4x объективными и цифровыми возможностями приобретения. Завехать масштаб, в котором делается снимок.
- Изображение всей раны верхней части каждого окрашенных слайд и убедитесь, что включить некоторые раскручивается ткани с обеих сторон. Сделайте несколько перекрывающихся снимков, если рана больше рамки одного изображения.
- Сохраните файл, включая номер раздела для морфометрического анализа. Используйте номер раздела, за которым следуют a, b, c и т.д. для перекрывающихся изображений одной и той же раны.
11. Морфометрический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда рана охватывает несколько фотографий, сумма измерений, взятых из отдельных фотографий, чтобы получить одно значение на метрику на рану разделе для записи в электронной таблице.
- На изображении J откройте цифровой файл окрашенной раны изображения. Не используйте сшитые картинки для анализа. Выполните измерения на увеличенных перекрывающихся изображениях, найдя ориентиры, чтобы оставить и подобрать измерения от изображения к изображению.
- Установите настройки масштаба и измерения.
- Выберите "Установить шкалу" под анализ. Введите расстояние в пикселях, известное соответствующее расстояние и единицу расстояния (единица длины). Шкала должна отображаться в окне и соответствовать масштабу изображения, на который было получено изображение.
- Проверьте поле"Глобальный",чтобы сохранить шкалу одинаково для каждого открытого изображения.
- Повторите шаги 11.2.1 до 11.2.2 каждый раз, когда Изображение J закрывается и вновь открывается.
- Проверьте поле для "Область" под анализ | Набор измерений.
- Измерьте длину раны
- Выберите"Бесплатный выбор"на панели инструментов Фиджи.
- Мера, начиная от последнего волосяного фолликула невредимой ткани с одной стороны раны до первого волосяного фолликула невредимой ткани на другой стороне раны(рисунок 4A,B).
- Проследите вдоль дермо-эпидермального соединения, чтобы добраться до этих двух достопримечательностей. Если эпидермис не покрывает всю рану, следуйте дермо-эпидермального соединения на одной стороне раны и где мигрирующий язык заканчивается продолжать после превосходный аспект гранулированной ткани или соединение между гранулированной ткани и парши, пока вы не достигнете мигрирующих язык, а затем, наконец, первый волосяной фолликул невредимой ткани на другой стороне (Рисунок 4E,F).
- Под анализ,нажмите Мера. Длина измерения будет отображаться в тех же единицах, что и в шкале.
- Создание электронной таблицы для отслеживания измерений(Дополнительная таблица 1).
- Скопировать длину раны в электронную таблицу.
- Измерьте эпидерматальную длину
- Если эпидермис покрывает всю рану, эпидермальная длина такая же, как длина раны.
- Скопируйте измерение длины раны в столбец «эпидермальной длины» в таблице Excel и пропустите шаг 11.5.
- Если эпидермис не покрывает всю рану, выберите«выбор из свободы»и измерьте расстояние между каждым эпидермальным передним краем, следуя превосходному аспекту гранулированной ткани или стыку между гранулированной тканью и парши до первого волосяного фолликула(рисунок 4C,D).
- Под анализ,нажмите Мера.
- Вычесть это измерение из длины раны и записать число под "эпидермальной длины" в таблице Excel.
- Если эпидермис покрывает всю рану, эпидермальная длина такая же, как длина раны.
- Измерьте область раны
- Выберите"Бесплатный выбор"на панели инструментов Фиджи.
- Мера, начиная от последнего волосяного фолликула невредимой ткани с одной стороны раны до первого волосяного фолликула невредимой ткани на другой стороне раны(рисунок 4A,B,E,F).
- След вдоль превосходного аспекта эпидермиса (не включают парши) или превосходный аспект гранулированной ткани, если рана не полностью покрыта эпидермисом.
- Продолжайте отслеживать вертикально вдоль волосяного фолликула в гранулуляционной ткани, как только противоположный волосяной фолликул достигнут и до жировой ткани или мышцы не будет достигнута. Следуйте нижней границе грануляции ткани на противоположную сторону раны и присоединиться к отправной точке вдоль волосяного фолликула, чтобы закрыть область (Рисунок 4E, F).
- Под анализ,нажмите Мера.
- Скопировать область раны в электронную таблицу под "измеренной областью раны".
- Измерьте эпидермальный район
- Выберите"Бесплатный выбор"на панели инструментов Фиджи.
- Если рана полностью эпителиализирована:
- След вдоль верхнего аспекта эпидермиса, пока противоположный волосяной фолликул не будет достигнут и завершить область, "вернувшись" к отправной точке после дермо-эпидермального соединения между эпидермисом и дермой (Рисунок 4D).
- Под анализ,нажмите Мера.
- Скопировать эпидермальной области в таблицу Excel под "эпидермальной области измеряется" и пропустить шаг 11,7.
- Если рана не полностью эпителиализирована:
- Проследите вдоль превосходного аспекта эпидермиса до ведущего края и вернитесь к исходной точке после дермо-эпидермального соединения(рисунок 4C).
- Под анализ,нажмите Мера.
- Повторите шаг 11.6.3.1 и 11.6.3.2 на противоположной стороне раны.
- Под анализ, нажмите Мера.
- Сумма двух чисел, полученных в шагах 11.6.3.2 и 11.6.3.4 и введите результат под "эпидермальной области измеряется" в таблице.
- Повторите шаги от 11,3 до 11,6 на каждом40-м разделе (каждый8-й слайд).
- Рассчитайте эпидермальный район всей раны.
- Создайте новый столбец в таблице "эпидермальная область рассчитывается" рядом с "эпидермальной длины".
- Умножьте число для "эпидермальной длины" на 280 для каждого раздела, за исключением последнего (7 мкм толщиной раздел х 40 разделов).
- Умножьте число для "эпидермальной длины" на 7 для последнего раздела (толщина сечения).
- Сумма значение "эпидермальной области рассчитывается" для каждого раздела, чтобы получить эпидермальной области всей раны.
- Рассчитайте область раны всей раны.
- Повторите шаги от 11,8,1 до 11,8,4 с помощью измерений длины раны.
- Рассчитайте эпидермальный объем всей раны.
- Повторите шаги от 11,8,1 до 11,8,4 с использованием измерений "измеренной эпидермальной области".
- Рассчитайте объем раны всей раны.
- Повторите шаги от 11.8.1 до 11.8.4 с помощью измерений «измеренной области раны».
- Рассчитайте процент эпидермального объема раны.
- Разделите общий эпидермальный объем на общий объем раны и умножьте на 100, чтобы получить процент (не делайте этого соотношения для каждого раздела).
- Рассчитайте процент эпидермальной области среди области раны.
- Разделите общую эпидерматальную область на общую площадь раны и умножьте на 100, чтобы получить процент. Если рана полностью эпителиализирована, это число должно быть 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 5 показан диапазон измеренных и рассчитанных значений, полученных путем проведения морфометрического анализа ран дикого типа, генерируемых в различных штаммах мышей несколькими хирургами и анализируемых различными людьми. Мыши дикого типа из разных штаммов могут отображать статистические различия, описанные как в наших исследованиях, так ив литературе 9,10. Основываясь на этих репрезентативных результатах, мы рекомендуем использовать в рамках одного исследования мышей только из одного штамма. Хотя мы рекомендуем, чтобы один и тот же человек выполнять все раны в рамках конкретного исследования, несколько человек могут выступать в качестве хирургов до тех пор, как область ран в день 0 статистически не отличается между работой человека. Наконец, поскольку морфометрический анализ, описанный в этом протоколе, может быть обширным, несколько человек могут анализировать части одного и того же эксперимента, но только в том случае, если результаты их анализа двух образцов находятся в пределах 5% друг от друга. Тем не менее, предпочтительнее иметь одного человека, анализирующих раны в ослепленный образом, чтобы избежать предвзятости.
На рисунке 6 отображается мета-анализ, сравнивающий измерения ран, полученные в соответствии спротоколом, описанным в данном исследовании 11, с измерениями, полученными из "середины" раны и 40 окружающих участков. На рисунке 6Аэпидермальная область и область ран были рассчитаны на основе измерения длины эпидермальной и раны на участках ран, за которыми последовал расчет процентной доли эпидермальной области среди области ран (иногда именуемой "процентом закрытия" или "процентом эпителиализации"). Аналогичным образом, на рисунке 6B,процент эпидермиса в ране был получен как соотношение эпидермального объема (рассчитывается из измеренной эпидермальной области) над объемом раны (рассчитывается из измеренной области раны). По обоим параметрам анализ всей раны показал сильные статистические различия между группами (до P lt; 0.001 после One-way Anova). Тем не менее, значение было уменьшено (до P Lt; 0,01 после в одну сторону Anova), когда только 40 разделов в середине будет проанализирована. Эти результаты демонстрируют снижение уровня значимости, когда анализируется только подмножество раны. Эти данные свидетельствуют о том, что дефекты с небольшим размером эффекта, скорее всего, будут обнаружены только при выполнении морфометрического анализа на всю рану, и что более мягкие фенотипы заживления ран будут пропущены из "середины раны" типа анализа.
Распространенная практика для анализа заживления раны in vivo включает измерение области раны на гистологических участках, выбранных где-то в ране12. С этой хранимой информацией среднее значение измеренной области раны из серийных участков целых ран было сопоставлено с областью, полученной из средних подмножества секций. Результаты не показали существенной разницы между экспериментальными группами и между методом анализа(рисунок 6C). Тем не менее, текущий протокол использует измеренную область (показано на рисунке 6C) по всей ране для расчета объема раны. Как показано на рисунке 6D, рассчитанный объем раны (который может быть рассчитан только с помощью анализа всей раны) значительно отличается между экспериментальными группами. В целом, эти репрезентативные результаты демонстрируют важность углубленного гистологического анализа параметров заживления ран, описанных в этом протоколе, для того, чтобы обнаружить фенотипы, которые в противном случае были бы пропущены с помощью более традиционного анализа заживления ран.
Рисунок 1: Двусторонняя эксциобразная процедура раны. (A)Представитель фотографию мыши после отсечения и бритья волос из хирургической области. (B)Кожа ущипнул между лопатками вдоль спинной средней линии. (C) Мышь расположена на боку с кожей положил плоский. (D)Представление биопсии пунш размещения. (E)Punched кожи. (F) Мышь с двумя двусторонними ранами на 0-й день и вырезанной пунш биопсии контроля тканей, как указано на белые стрелы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Процедура сбора ран. (A-C) Макроскопические фотографии 6 мм эксцизных ран после 4дней( A ), 7 дней (B) и 11 дней (C). (D-E) С лезвием скальпеля, кокечный разрез был сделан в форме широкого прямоугольника, который включает в себя раны и окружающие раскрученные ткани. (F)Кожа была освобождена от основной ткани с типсами и ножницами. (G)Представление собранных двусторонних ран. (H)пунктирная белая линия представляет собой границу ткани, которая будет собрана после использования пунша биопсии (этот метод позволяет стандартизированное количество ткани собраны). (I)пунктирная белая линия представляет собой границу ткани, которая будет обрезана для гистологии (прямоугольная форма позволяет легче вставлять). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Решение | Время (минуты) | Температура (по Цельсию) | Давление (kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 95% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 100% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| Ксилол | 30 | Rt | N/A |
| Ксилол | 30 | Rt | N/A |
| Парафин | 30 | 60 | 20 |
| Парафин | 30 | 60 | 20 |
Таблица 1: Процедура обработки образцов для встраивания парафина. RT и комнатная температура. N/A не применяется.
Рисунок 3: Встраивание ран и раздел. (A)Парафин обработанные раны лежали плашмя в встраивание плесени. (B)Рана была проведена на 90 "("стоя") от горизонтальной поверхности формы для встраивания. (C) Парафин-встроенная рана должным образом ориентирована насекции( D ) Парафин блок, установленный на микротоме был разрезан на ленты около 20 разделов ( E )Парафинленты разрезать на 5-секционые приращения, как указано в белых скобках. (F)Серийные секции, уложенные плашмя в теплую водяную баню (40-45 градусов по Цельсию), были установлены на слайде микроскопа. Мультфильм в (A-C) представляет рану (оранжевый) в коже (синий) с надлежащей ориентацией эпидермиса (е) и дермы (d) для каждого шага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Гистологические характеристики ран и иллюстрация морфометрических параметров. (A, B) Гистологические особенности дня 4(A) и день 7(B) 6 мм раны. (C-F) Представление различных измерений, используемых для выполнения количественного морфометрического анализа: длина эпидермиса(C, D, пунктирнаячерная линия), измеренная область эпидермиса(C, D,желтая затененная область), длина раны(E, F, пунктирнаяжелтая линия) и измеренная область всейраны (E, F,серая затененная область). HF и волосяной фолликул; шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Морфометрические характеристики репрезентативных 6 мм ран дикого типа в день 4, день 7 и день 11 после ранения. Рассеянные участки представляют собой данные, полученные в результате морфометрического анализа 6 мм ран дикого типа, генерируемых в различных штаммах мыши несколькими хирургами и анализируемых различными людьми. (A) объем раны, (B) эпидермальный объем, (C) процент эпидермиса в ране, (D) область раны (рассчитывается), ( E )эпидермальнойобласти (рассчитывается), и (F) процент эпидермальной области среди области раны демонстрируют диапазон вариаций в морфометрических значениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Мета-анализ, сравнивающий параметры, полученные из целой раны со средней частью раны, выявляет новые дефекты более высокого значения. Морфометрия заживления ран была выполнена на 7-й день раны, введенные с солевым раствором (контроль), преобразование фактора роста бета 3 (Tgfb3), Tgfb3 с нейтрализуя антитела (Tgfb3 и NAB) и нейтрализации антител в одиночку (NAB). Измерения проводились на серийных секционных ранах ("целые") или на 40 участках из середины раны ("средний") и использовались для расчета доли эпидермальной области над областью раны(A),процент эпидермиса вране (В)и объема раны(D). (C)представляет среднее значение области раны, измеряемое по целому или середине раны. - P lt; 0.05, P lt; 0.01, P lt; 0.001, ns - не значительная, одноразовая Anova). Эта цифра была изменена с использованием данных Le et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная таблица 1: Пример электронной таблицы для записи морфометрических измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Двусторонняя эксциобразная модель раны является весьма настраиваемой процедурой, которая может быть использована для изучения многих различных аспектов заживления ран. Перед началом проекта заживления ран, исследователи должны выполнить анализ мощности, чтобы определить количество ран, необходимых для обнаружения дефекта определенного размера эффекта. Несоответствия существуют в литературе о том, отдельные мыши или раны должны быть использованы в качестве биологических репликаций, однако, недавнее исследование показало, что нет существенной корреляции между двумя ранами на одномживотном 4. Это говорит о том, что раны от одного животного независимы друг от друга и могут рассматриваться как биологические репликации, уменьшая количество мышей, необходимых для обнаружения дефекта. Это актуально при рассмотрении небольших размеров эффекта, для которых требуется большое количество ран, чтобы достичь значения4. Кроме того, результаты расчета мощности могут повлиять на количество ран, выполняемых на каждое животное, с 2 и 4 раны на животное является наиболее распространенным.
Сам хирургический протокол также очень гибок. В то время как мы рекомендуем анестезию испарителем изофлурана из-за короткой длины процедуры и быстрого восстановления (10-15 мин на мышь), следователи без доступа к испаритель может использовать инъекционные анестезии, включая кетамин / ксилазин или пентобарбитал. Выбор соответствующего анальгетики особенно критичен, так как относится к воспалительным фазам заживления ран. Использование нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), таких как флуниксин мэглюмин или мелоксикам следует использовать с осторожностью, поскольку они могут уменьшить воспаление. Опиоиды, таким образом, предпочтительнее в исследованиях, где воспаление в настоящее время изучается. Мы рекомендуем анальгетики (например, бупренорфин устойчивый-релиз), которые обеспечивают до 48 ч анальгезии и устранить необходимость повторных, дополнительные дозы. Все хирургические процедуры должны выполняться в соответствии с федеральными руководящими принципами и поддерживаться утвержденным протоколом животных.
Заживление ран является процессом, который включает в себя несколько этапов, каждая из которых характеризуется различными биологическими процессами, включающими различные типыклеток 3. Воспалительная фаза происходит между днями 0 и 5, с ранней миграцией полиморфонуклеарных нейтрофилов (PMN) и макрофагов кместу травмы 13. Пролиферативная фаза происходит между 3 и 14 дней с повторной эпителиализации занимает различное количество времени в зависимости от размера раны14. В этом протоколе мы использовали 6-мм пунш биопсии, и большинство ран были повторно эпителиализированы на 7 дней. Тем не менее, эти сроки должны быть сокращены, если меньшие удары были использованы (они доступны как малые, как 1 мм). В сочетании с более ранними точками времени, эти меньшие раны могут быть предпочтительнее, чтобы уменьшить количество гистологическиханализов 15. Наконец, этапы реконструкции и созревания происходят через 7 дней и до года после травмы16. Эти более поздние точки времени могут потребоваться для исследования созревания раны или для расследования задержки заживления ран у экспериментальных животных. Таким образом, следователь должен будет определить критические моменты времени, необходимые для расследования конкретных фаз заживления ран на основе их конкретнойгипотезы 5.
Анализ заживления ран часто не ограничивается гистологическими анализами. Необлеченные секции парафина могут быть использованы для дополнительных анализов, таких как иммунофлуоресценция или трихром Массона для осаждения коллагена. Обработка контрольной ткани (пунш-биопсия) и шаги по сбору урожая тканей будут зависеть от того, как, помимо гистологических анализов, оценивается заживление ран. В рамках хирургического протокола, пунш биопсии удаляются для того, чтобы генерировать excisional раны. Эти удары могут служить раскручиваемой контрольной ткани для вниз по течению приложений, таких как белок (для западного или цитокинов профилирования), ДНК или РНК и должны быть обработаны соответствующим образом. Рекомендуется, чтобы по крайней мере один удар быть сохранены для гистологического анализа, особенно в тех случаях, когда кожа лечится до раны (например, применение тамоксифена для индукции Cre-Lox рекомбинации17). Изучение пунша может определить влияние лечения на кишачую морфологию или просто позволить оценить базовую киданую морфологию конкретной используемой мышиной модели. Раны, не используемые для гистологии могут быть собраны с пунш биопсии, которая охватывает размер раны. Эта процедура имеет несколько преимуществ, в том числе сбор одинакового количества ткани, независимо от размера раны (большие раны имеют меньше окружающих здоровых тканей). Наконец, мы описываем использование 4% параформальдегида как фиксатор и парафин как материал для сохранения и встраивания тканей, соответственно. Другие фиксаторы могут потребоваться для определенных приложений и могут быть заменены (например, фиксаторы Carnoy или Bouin). Для лучшего иммунофлуоресцентного окрашивания, замораживания и встраивания раны в оптимальное соединение температуры резки с последующим замороженным разделом остается метод выбора.
Раздел раненых тканей может представлять много проблем, особенно день 4 раны из-за присутствия парши. Для создания высококачественных секций рекомендуется проверить, что все части микротомы плотно закреплены, держатель блока убран в исходное положение, держатель лезвия установлен между 0 и 10 ", и лезвие плотно крепится, но не затягивается. Хотя парафин блок охлаждается, ткань все еще может лоскуток. Если измельчение продолжается, кусок льда может быть помещен на блок в течение 5 минут в то же время установлен. После начала секции настоятельно рекомендуется избегать удаления блока из микротома, чтобы предотвратить потерю парафиновых секций. Крайне важно записывать любые потерянные парафиновые секции, как их номера, так и их рейтинг в серийном разделе. Это повлияет на морфометрический анализ и должно быть рассмотрено. После инициирования секции идентификация раненых тканей на необитых участках может быть затруднена, особенно если она не знакома с гистологией. Если вы сомневаетесь, рекомендуется быть консервативным и сохранить все разделы, которые содержат ткани. После того, как гистологическое пятно выполняется, ткани организации будет более очевидным и раны более отчетливой. Иногда волосяные фолликулы могут быть не очень хорошо видны или могут быть далеко от края раны. Если это так, то другие ключевые характеристики раненой ткани могут быть использованы для установления границ раны, включая резкое увеличение с последующим немедленным уменьшением эпидермальной толщины и резкими изменениями в организации соединительнойткани (рисунок 4A-B).
Цифровая визуализация является важным шагом в морфометрическом анализе. Морфометрический анализ должен быть выполнен на отдельных изображениях с использованием ориентира на каждом изображении, чтобы избежать повторных измерений. Тем не менее, можно сшить все кадры вместе с помощью цифрового программного обеспечения и выполнить анализ на одном изображении. Хотя поначалу это кажется проще, манипуляция большим изображением может замедлить процесс анализа. Выбор раздела также имеет решающее значение для анализа. Хотя мы рекомендуем в цифровом виде приобрести верхнюю часть каждого8-го слайда, качество раздела должно быть приоритетным и лучшие из 5 разделов на этом слайде должны быть изображены. Разделы с небольшими складками все еще могут быть проанализированы путем оценки площади/длины складки. Количество этого конкретного раздела должно быть записано как в цифровом файле, так и в таблице Excel, так что расстояние между предыдущим и следующим проанализированным разделом может быть соответствующим образом скорректировано.
Кутанные раны затрагивают, по оценкам, 6,5 миллиона человек с лечением стоимостью более $ 25 млрдв год 18 и являются неотъемлемым компонентом хирургических процедур в дополнение к вторичной по отношению ко многим другим проблемам со здоровьем, в том числе диабета и ожирения. Мышь была использована в качестве удобной модели для изучения заболеваний человека из-за легкости в манипулировании его генома, несмотря на часто проявляет тонкий фенотип по сравнению с человеческим расстройством. Двусторонняя эксцисионная модель раны и последующий морфометрический анализ, описанный в этом протоколе, имеет важное значение из-за его способности решать трудности в выявлении незначительных дефектов в изначально сложном процессезаживления ран 19. Из-за своей большей чувствительности и пониженной изменчивости, этот протокол предоставляет возможность использовать меньше животных для получения той же экспериментальной чувствительности. Протокол очень настраивается и может быть использован для изучения всех этапов восстановления тканей. Подробный гистологический морфометрический анализ в сочетании с фенотипической характеристикой ткани имеют большой потенциал для увеличения знаний, необходимых для дальнейшего понимания критических факторов, модулирующие ремонт тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы признательны всем сотрудникам лаборатории Даннвальда, которые внесли свой вклад в оптимизацию этого протокола на протяжении многих лет, и Джине Шаттеман, чья настойчивость в продвижении использования серийного сечения для анализа ран сделала его создание возможным. Эта работа была поддержана финансированием от NIH/NIAMS Мартине Даннвальд (AR067739).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
