Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מודל ריפוי פצעים מרין וניתוח פצעים מורפומטריים היסטולוגיים

Published: August 21, 2020 doi: 10.3791/61616
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פצעים דו-צדדיים בעובי מלא בעכברים וכיצד לעקוב אחר, לקצור ולהכין את הפצעים לניתוח מורפומטרי. כלול תיאור מעמיק של אופן השימוש בסעיפים היסטולוגיים טוריים כדי להגדיר, לכמת ולזהות פגמים מורפומטריים במדויק.

Abstract

מודל הפצע ים-10-00 שימש בהרחבה כדי לחקור כל אחד מהשלבים החופפים באופן רציפה של ריפוי פצעים: דלקת, התפשטות ושיפוץ. פצעים מורין יש היסטולוגית מוגדר היטב ומיטה לזיהוי בקלות פצע שעליה שלבים שונים אלה של תהליך הריפוי הם מדידים. בתוך השדה, נפוץ להשתמש ב"אמצע" המוגדר באופן שרירותי של הפצע לניתוחים היסטולוגיים. עם זאת, פצעים הם ישות תלת מימדית ולעתים קרובות לא סימטרית היסטולוגית, התומכת בצורך בשיטה מוגדרת היטב וחזקה של כימות כדי לזהות פגמים מורפומטריים עם גודל אפקט קטן. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליך ליצירת פצעים דו-צדדיים בעובי מלא בעכברים, כמו גם הוראה מפורטת כיצד למדוד פרמטרים מורפומטריים באמצעות תוכנית עיבוד תמונה על מקטעים טוריים נבחרים. המדידות הדו-ממדיות של אורך הפצע, אורך האפידרמיס, אזור האפידרמיס, אזור הפצע משמשים בשילוב עם המרחק הידוע בין מקטעים כדי לשער את האזור האפידרמיס תלת מימד מכסה את הפצע, אזור הפצע הכולל, נפח אפידרמי ונפח הפצע. למרות ניתוח היסטולוגי מפורט זה הוא יותר זמן ומשאבים רב מאשר ניתוחים קונבנציונליים, הקשיחות שלה מגבירה את הסבירות של גילוי פנוטיפים חדשניים בתהליך ריפוי פצע מורכב מטבעו.

Introduction

ריפוי פצעים עוריים הוא תהליך ביולוגי מורכב עם שלבים חופפים באופן רצף. היא דורשת תיאום של תהליכים תאיים ומולקולריים המוסדרים באופן זמני ומרחבי על מנת לשחזר את תפקוד המחסום של האפיתל הפגוע. בשלב הראשון, דלקת, נויטרופילים מקרופאגים נודדים לתוך הפצע, מגייסים הגנות מקומיות ומערכתיות1. מעקב וחפיפה של השלב הדלקתי הוא שלב ההתפשטות. פיברובלסטים מתחילים להתרבות במהירות ולנדוד לתוך רקמת הגרגר. Keratinocytes הרחק מהקצה המוביל להתרבות לכיוון הפצע כמו keratinocytes מובדיל בקצה המוביל לנדוד כדי לאפיתל מחדש את הפצע2. לבסוף, שלב השיפוץ וההתבגרות מתחיל, שבמהלכו פיברובלסטים ברקמת הגרגר מתחילים לסנתז ולהפקיד קולגן. השיפוץ והארגון של המטריצה החדשה יכולים להימשך עד שנה אחת בעקבות פציעה3. בשל המורכבות של אירועים חופפים מעורבים שיחה צולבת בין סוגי תאים מרובים, ולמרות שנים של מחקר, רבים מהמנגנונים הסלולריים והמולקולריים הבסיסיים ריפוי הפצע להישאר מובן היטב.

מודל העכבר הוא המודל היונקים הדומיננטי לחקירת מנגנונים של ריפוי פצעים בשל קלות השימוש שלהם, עלות נמוכה יחסיתוניפולנטיות גנטית 1,4,5. למרות סוגים שונים של פצעים תוארו במודל murine, הנפוץ ביותר הוא פצע excisional (או אגרוף דו צדדי או ביופסיה אגרוף ישיר), ואחריו מודלים פצעחתך 4. מודל הפצע excisional יש יתרון מובהק על המודל החתך כפי שהוא מטבעו יוצר רקמת שליטה שלא עברה את תהליך הריפוי. רקמת ביופסיית הפונץ' המחרוטת כחלק מהפרוטוקול הכירורגי יכולה להיות מעובדת באותו אופן כמו הרקמה הפצועה ולהשתמש בה כדי לבסס את התנאים ההמו-סטטיים לקריטריון הרצוי. רקמת בקרה excised עשוי להיות שימושי גם אם להעריך את ההשפעות של טיפול מוקדם בעור או אישור שינוי גנים מוצלח בזמן פציעה4.

ניתן להעריך פרמטרי ריפוי על ידי טכניקות רבות ושונות, כולל תכנון או היסטרולוגיה. עם זאת, planimetry יכול רק להעריך מאפיינים גלויים של הפצע, ו בשל הנוכחות של גלד, לעתים קרובות אינו תואם למדידות של ריפוי כי הם הדמיה על ידי היסטולוגיה, ובכך מה שהופך את ההיטולוגיה "תקן הזהב" שלניתוח 4. למרות ניתוח היסטולוגי להיות תקן הזהב, הוא מבוצע בדרך כלל על קבוצת משנה שרירותית שלהפצע 6,7. לדוגמה, חיתוך הפצע ב"חצי" לפני הטבעה וניתוח הפצע הוא כיום נוהג נפוץ כדי להפחית את הזמן והמשאבים שהושקעו על חומרי ניתוח נתונים וחיתוך. שיטת הניתוח המורפומטרי המתואר בפרוטוקול זה פותחה כדי להקיף את רקמת הפצע כולה, כדי לשקף במדויק את המאפיינים המורפולוגיים של הפצע, ולהגדיל את הסבירות לגילוי פגמים בריפוי פצעים עם גודל אפקט קטן. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים שיטה כירורגית ליצירת פצע murine הנפוץ ביותר, פצע כריתה בעובי מלא דו צדדי, כמו גם שיטה מפורטת וקפדנית לניתוח היסטולוגי כזה משמש לעתים נדירות בתחום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים הושלמו בהתאם לתקנות הפדרליות ומדיניות ונהלים של אוניברסיטת איווה אושרו על ידי אוניברסיטת איווה IACUC.

1. בעלי חיים ותונו

  1. השתמש בעכברים בוגרים של קו העכבר הרצוי בגיל 8-10 שבועות כאשר שלב זקיק השיער הוא בטלוגן.
  2. ביום הניתוח, להפריד עכברים לכלובים נקיים ובאופן אישי בית כדי למזער את ההפרעה הפצע.

2. כירורגיה

הערה: אין צורך לשמור על תנאים כירורגיים סטריליים. בעוד יש לנקוט טיפול כדי לשמור על עקירות בין בעלי חיים, ביופסיית הפונץ' עצמה נעשית על משטח נקי אך לא סטרילי. משך הניתוח לכל בעל חיים הוא בין 10 ל-15 דקות.

  1. ההתסה
    1. להמריד את החיה במשך 1-2 דקות בתא אינדוקציה עם מאדה isoflurane להגדיר קצב זרימה 4-5% ואת מד זרימת החמצן להגדיר על 1 ליטר לדקה. ראה דיון באפשרויות הרדמה חלופיות.
    2. אשר ההסתה תקינה לפני תחילת ההליך. עומק ההרדמה יכול להיות מאושר על ידי צביטה מוצקה.
    3. העבר את העכבר ממכל האינדוקציה לקונוס האף והפחית את קצב זרימת isoflurane ל- 1.5% ואת מד זרימת החמצן ל- 0.5 L/min.
    4. למרוח משחה אופטלמית על שתי העיניים כמו ההליך עולה על 5 דקות.
    5. שמור על טמפרטורת גוף נורמלית באמצעות משטח תרמי.
  2. הכנת אתר הפצע
    1. השתמש במקצץ גילוח חשמלי בתנועה קאודילית כדי להסיר את הפרווה בגב העכבר ברמת הכתף. הסר את השיער נמוך יותר בגב במידת הצורך בעת ביצוע יותר משני פצעים.
    2. הסר את השיער הנותר באמצעות סכין גילוח בתנוע סיבתי rostral המוחזק ב 20° מגב העכבר כדי לגלח מקרוב את האזור הקצץ(איור 1A).
    3. נקה את האזור המגולח עם ספוגית פובידון יוד.
    4. נגב את העור עם משטח סטרילי של 70% הכנת אלכוהול שופרופיל כדי להפחית גירוי עורי פוטנציאלי מספוגית היוד.
  3. פצע ופציעה
    1. צובטים את העור בין להבי הכתף לאורך קו האמצע הגבי ומשוך את כיסוי העור הסנדוויץ' מהגוף(איור 1B).
    2. מקם את העכבר על צידו עם כיסוי העור על משטח שטוח עטוף במבת נייר נקייה או שווה ערך. השתמש גיליון של שעווה דנטלית מתחת המגבת כדי להגן על פני השטח הבסיסי מפני נזק (איור 1C).
    3. מניחים את פונץ' הביופסיה בגודל הרצוי קרוב ככל האפשר לגוף ואפשרו לעור להירגע. אין למתוח את העור, או שגודל הפצע יהיה גדול יותר מגודל הניקוב המיועד(איור 1D).
    4. הכה את העור על ידי לחיצה למטה, תנועת נדנדה עשוי לשמש כדי להבטיח את כל שכבות העור משני הצדדים כבר חדרו(איור 1E). השתמש בפונץ ביופסיה חדש לכל חיה.
    5. הסר את ביופסיות הניקוב מהפצעים(איור 1F). אם יש עדיין אתרים של קובץ מצורף להשתמש במספריים סטריליים פינצטה כדי לשחרר את האגרוף מהעור שמסביב. עבדו את רקמת בקרת הביופסיה של פונץ' כנדרש בהתבסס על תוכניות במורד הזרם לניתוחי ריפוי פצעים (ראה דיון לקבלת הצעות).
    6. צלם תמונות מאקרוסקופיות ממרחק שווה לאתרי הפצע או עם סרגל במסגרת כדי למדוד את אזור הפצע הראשוני ולחסל חריגים מניתוח.
    7. ניהול משכך כאבים למשך 24 שעות לפחות בהתאם לפרוטוקול בעל חיים מאושר. לדוגמה: Buprenorphine SR-LAB, מוזרק כמנה אחת subcutaneously ב 0.5-2 מ"ג/ק"ג עבור 48 שעות של שיכוך כאבים (ראה דיון להצעות חלופיות ושיקולים).
    8. לפקח על העכבר כפי שהוא יוצא מהרדמה עד שהוא שומר על תנוחה זקופה והוא הולך כרגיל סביב הכלוב.

3. ניטור פצעים פוסט

  1. נטר עכברים מדי יום לקבלת נקודות קצה ניסיוניות כפי שנקבעו על ידי החוקר ובהתאם לתאימות לפרוטוקולים מוסדיים. דוגמאות כוללות: זיהום, ירידה במשקל גלויה, או תנוחה רכונה.
  2. צלם תמונות מאקרוסקופיות יומיות באופן מבוקר כפי שנעשה לאחר הניתוח הראשוני.

4. קצירת פצעים

  1. המתת סד לעכברים בנקודת הזמן הרצויה לאחר הפציעה בהתאם לפרוטוקול בעלי חיים מאושר.
  2. צלם תצלומים מאקרוסקופיים של אתרי הפצע באופן מבוקר העולה בקנה אחד עם רכישתתמונות קודמות( איור 2A,C).
  3. חותכים מלבן רחב סביב אתרי הפצע באמצעות אזמל(איור 2D,E).
  4. שחררו את פיסת הרקמה המלבנית באמצעות מספריים ופינצטה כדי לקלף בחזרה ולחתוך את העור מהרקמות הבסיסיות(איור 2F). מניחים בצלחת פטרי(איור 2G).
  5. לקצור את הפצעים. לקצץ עד 2 מ"מ של רקמה לא נפגעה המקיפה את כל צידי הפצע בצורה מלבנית(איור 2H, I). ראה דיון על אפשרויות חלופיות לקצור את הפצע.
  6. לעבד את הפצעים כנדרש עבור מחקרים עוקבים. שמור לפחות פצע אחד לכל עכבר להטמיע פרפין וניתוח היסטולוגי.

5. קיבעון וההטביעה של הפצע

  1. תקן את הפצע
    1. לתקן את רקמת הפצע בתמיסה חדשה מוכן 4% paraformaldehyde8 עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להעביר 4 מעלות צלזיוס לילה. מיקרוסקופאלקטרונים (EM) כיתה paraformaldehyde ו סינון פתרון אינו נדרש.
    2. לשטוף את הפצעים פעמיים במשך 30 דקות ב 1x PBS.
    3. החליפו PBS ב-70% ETOH ואחסן ב-4°C עד להטביעה. לעבד רקמות בתוך 24-48 שעות כדי למנוע אובדן אנטיגן או בתוך 1-2 שבועות אם רק הערכת מאפיינים היסטולוגיים.
  2. לעבד ולהטביע את הפצע
    1. מעבירים כל פצע לקלטת הטבעה. תווית הטבעת קלטות בעיפרון כמו התהליך יסיר צבעי דיו.
    2. לעבד את הרקמה באופן ידני או באמצעות מעבד אוטומטי על ידי התייבשות הרקמה עם הגדלת אחוזי אתנול, ניקוי עם קסילן, ולאחר מכן חדירה הרקמה עם שעוות פרפין (שולחן 1).
    3. הטבע את הפצע 90° ("עומד") מהמשטח האופקי של תבנית ההטבעה(איור 3א', ב).

6. יום 0 ניתוח אזור הפצע

  1. הורד NIH-Image J או NIH-פיג'י תוכנה חופשית (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. פתח קובץ עם תמונה של יום 0 פצעים.
  3. סמן את התיבה עבור "אזור" תחת ניתוח | הגדר מידות.
  4. בחר "הגדר קנה מידה" תחת נתח. הזן את המרחק בפיקסלים, את המרחק המתאים המוכר ואת יחידת המרחק (= יחידת אורך) אם מדידות מאקרוסקופיות הן חלק מהמחקר או דלג על שלב זה אם נדרשות מדידות יחסיות בלבד.
  5. בחר "בחירות יד חופשית " בסרגלהכלים פיג'י.
  6. תאר את היקף הפצע.
  7. לחץ על מידה תחת נתח.
  8. צור גיליון אלקטרוני כדי לעקוב אחר המידות לכל בעל חיים לכל פצע.
  9. העתק את המדידה של אזור הפצע בגיליון האלקטרוני.
  10. חשב את האזור ממוצע ואת סטיית התקן של כל הפצעים לניסוי נתון.
  11. אל תכלול פצעים מחוץ לשתי סטיות תקן של המקרה מניתוח היסטולוגי.

7. מקטע טורי

  1. מצננים את בלוקי הפצע משובצים בפרפין ב-4 מעלות צלזיוס בלילה.
  2. הכנס את בלוק הפרפין על מחזיק הבלוק של המיקרוטומיה והכיוון כך שהלהב יחתוך ישר על פני הבלוק. לכוון את הבלוק כך הרקמה "עומד" ב 90° המאפשר את החלק בו זמנית של האפידרמיסוהדרמיס (איור 3C,D).
  3. להפוך 2-4 סרטים של 20-30 פרפין קטעים של 7 μm כל אחד.
  4. השתמש במברשת צבע יבשה ומחט נתגרת כדי להעביר כל סרט למשטח מוצק אך ניתן למניפולציה, כגון יריעת פלסטיק שחורה איתנה.
  5. נתק את החלק העליון של כל סרט עם סכין גילוח והישם על מגלשת מיקרוסקופ.
  6. שים לב למקטעים הלא מוכתמים תחת מיקרוסקופ brightfield כדי לקבוע אילו מהם מכילים רקמה פצועה, אשר ניתן לזהות על ידי היעדר זקיק שיער, שינויים במראה של רקמת החיבור או האפידרמיס, ו / או הנוכחות שלגלד (איור 4A,B).
  7. זרוק חלקים ללא נפגעים עד 20 חלקים לפני תחילת הפצע.
  8. מקטע דרך הפצע על ידי חזרה על שלבים 7.3 ו 7.4 עד שלא זוהה פצע בחלקים לא מוכתמים.

8. הרכבה של מקטעים פרפין

  1. מחלקי פרפין נפרדים כל 5 מקטעים עם סכין גילוח, החל ברצועת הכלים הראשונה(איור 3E).
  2. שקופיות מיקרוסקופ תוויות הן עם מספר השקופית והן עם כל מספרי המקטעים.
  3. תפוס את הקבוצה של 5 קטעים עם מברשת צבע רטובה ולהציף אותם על פני המים של אמבט מים חמים (40-45 ° C) כדי לשטח אותם.
  4. בחר את הקבוצה של 5 קטעים מתוך אמבט המים באמצעות אחת מגלשות מיקרוסקופ מתויג(איור 3F) והמקםעל סט חם שקופיות ב 37 °C עבור עד 24 שעות.
  5. אחסן את השקופיות זקוף בתיבת שקופיות.

9. כתמים היסטולוגיים

  1. מעבירים כלמגלשת מיקרוסקופ 8 (שווה ערך לכל קטע פרפין 40) למדףכתמים וכתם עם המטוקסילין ואאוסין.

10. הדמיה מיקרוסקופית

  1. רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר המצויד ביכולות רכישה אובייקטיביות ודיגיטליות של פי 4. רטוט את קנה המידה שבו התמונה נלקחה.
  2. תמונה הפצע כולו של החלק העליון של כל שקופית מוכתמת וודא לכלול כמה רקמה לא נפגעה משני הצדדים. צלם מספר תמונות חופפות אם הפצע גדול יותר מהמסגרת של תמונה בודדת.
  3. שמור את הקובץ כולל מספר המקטע לניתוח מורפומטרי. השתמש במספר המקטע ואחריו a, b, c, וכו ' עבור תמונות חופפות של אותו פצע.

11. ניתוח מורפומטרי

הערה: כאשר הפצע משתרע על פני תמונות מרובות, סכם את המידות שנלקחו מהתמונות הבודדות כדי להשיג ערך אחד לכל מטרי לכל מקטע פצע כדי להקליט בגיליון האלקטרוני.

  1. בתמונה J, פתח קובץ דיגיטלי של תמונת פצע מוכתמת. אין להשתמש בתמונות תפורות לניתוח. בצע מדידות על תמונות חופפות עם התקרבות על-ידי איתור ציוני דרך שיש לעזוב ולאסוף מדידות מתמונה לתמונה.
  2. הגדר את העדפות קנה המידה והמדידה.
    1. בחר "הגדר קנה מידה" תחת נתח. הזן את המרחק בפיקסלים, את המרחק המתאים המוכר ואת יחידת המרחק (= יחידת אורך). קנה המידה אמור להופיע בחלון ואם להתאים את קנה המידה בו התמונה נרכשה.
    2. סמן אתהתיבה" כללי " כדי לשמור על קנה המידה זהה עבור כל תמונה פתוחה.
    3. חזור על שלבים 11.2.1 עד 11.2.2 בכל פעם ש- Image J נסגר ונפתח מחדש.
    4. סמן את התיבה עבור "אזור" תחת ניתוח | הגדר מידות.
  3. למדוד את אורך הפצע
    1. בחר "בחירות יד חופשית " בסרגלהכלים פיג'י.
    2. למדוד החל זקיק השיער האחרון של הרקמה ללא פגע בצד אחד של הפצע לזקיק השיער הראשון של הרקמה הלא פצועה בצד השני של הפצע(איור 4א', ב).
    3. עקבות לאורך צומת דרמו-אפידרמיס כדי להגיע לשני ציוני הדרך האלה. אם האפידרמיס אינו מכסה את כל הפצע, בצע את צומת dermo-epidermal בצד אחד של הפצע ואיפה הלשון הנודדת מסתיימת להמשיך בעקבות ההיבט העליון של רקמת הגרגר או הצומת בין רקמת הגרגר וגלד עד שאתה מגיע ללשון נודדת ולאחר מכן לבסוף זקיק השיער הראשון של הרקמה הלא פצועה בצד השני(איור 4E,F).
    4. תחת נתח , לחץעל מידה. אורך המדידה יופיע באותן יחידות כמו שנקבעו בקנה המידה.
    5. צור גיליון אלקטרוני כדי לעקוב אחר המידות (טבלה משלימה 1).
    6. העתק את אורך הפצע לתוך הגיליון האלקטרוני.
  4. למדוד את אורך האפידרמיס
    1. אם האפידרמיס מכסה את כל הפצע, אורך האפידרמיס זהה לאורך הפצע.
      1. העתק את המדידה "אורך פצע" לעמודה "אורך אפידרמיס" בגיליון האלקטרוני של Excel ולדלג לשלב 11.5.
    2. אם האפידרמיס אינו מכסה את הפצע כולו, בחר את "בחירות ידחופשית " ומדד את המרחק בין כל קצה מוביל אפידרמיס בעקבות ההיבט המעולה של רקמת הגרגרן או הצומת בין רקמת הגרגרן לבין גלד לזקיק השיער הראשון(איור 4C,D).
      1. תחת נתח , לחץעל מידה.
      2. הפחת מדידה זו מאורך הפצע והרשם את המספר תחת "אורך אפידרמיס" בגיליון האלקטרוני של Excel.
  5. למדוד את אזור הפצע
    1. בחר "בחירות יד חופשית " בסרגלהכלים פיג'י.
    2. למדוד החל זקיק השיער האחרון של הרקמה ללא פגע בצד אחד של הפצע לזקיק השיער הראשון של הרקמה הלא פצועה בצד השני של הפצע(איור 4A, B, E, F).
    3. מעקב לאורך ההיבט העליון של האפידרמיס (לא כוללים את גלד) או את ההיבט העליון של רקמת הגרגרן אם הפצע אינו מכוסה באופן מלא על ידי האפידרמיס.
    4. המשיכו להתחקות אנכית לאורך זקיק השיער לתוך רקמת הגרגרן ברגע שזקיק השיער הנגדי מגיע ועד לעצם השומן או לשריר. בצע את הגבול יצנון של רקמת הגרגרן לצד השני של הפצע ולהצטרף לנקודת ההתחלה לאורך זקיק השיער כדי לסגור את האזור(איור 4E,F).
    5. תחת נתח , לחץעל מידה.
    6. העתק את אזור הפצע לגיליון האלקטרוני תחת "אזור הפצע נמדד".
  6. למדוד את אזור האפידרמיס
    1. בחר "בחירות יד חופשית " בסרגלהכלים פיג'י.
    2. אם הפצע הוא אפיתל מלא:
      1. מעקב לאורך ההיבט העליון של האפידרמיס עד זקיק השיער הנגדי הוא הגיע להשלים את האזור על ידי "חוזר" לנקודת ההתחלה בעקבות צומת dermo-epidermal בין האפידרמיסוdermis (איור 4D).
      2. תחת נתח , לחץעל מידה.
      3. העתק את אזור האפידרמיס לגיליון האלקטרוני של Excel תחת "אזור אפידרמי נמדד" ולדלג לשלב 11.7.
    3. אם הפצע אינו אפיתל מלא:
      1. עקבו אחר ההיבט העילוי של האפידרמיס עד לקצה המוביל וחזרו לנקודת ההתחלה בעקבות צומת דרמו-אפידרמיס(איור 4C).
      2. תחת נתח , לחץעל מידה.
      3. חזור על שלב 11.6.3.1 ו- 11.6.3.2 בצד השני של הפצע.
      4. תחת נתח, לחץ על מידה.
      5. סכום את שני המספרים שהושגו בשלבים 11.6.3.2 ו- 11.6.3.4 והזן את התוצאה תחת "אזור אפידרמי נמדד" בגיליון האלקטרוני.
  7. חזור על שלבים 11.3 עד 11.6 בכלקטע 40 (כל שקופית8).
  8. חשב את אזור האפידרמיס של הפצע כולו.
    1. צור עמודה חדשה בגיליון האלקטרוני "אזור אפידרמי מחושב" לצד "אורך אפידרמיס".
    2. הכפל את המספר עבור "אורך אפידרמי" ב- 280 עבור כל מקטע פרט לאחרון (סעיף 7 μm עבה x 40 מקטעים).
    3. הכפל את המספר עבור "אורך אפידרמי" ב- 7 עבור המקטע האחרון (עובי המקטע).
    4. סכום את הערך של "אזור האפידרמיס מחושב" עבור כל סעיף כדי לקבל את האזור האפידרמיס של הפצע כולו.
  9. חשב את אזור הפצע של הפצע כולו.
    1. חזור על שלבים 11.8.1 עד 11.8.4 באמצעות מדידות אורך הפצע.
  10. חשב את נפח האפידרמיס של הפצע כולו.
    1. חזור על שלבים 11.8.1 עד 11.8.4 באמצעות המדידות "אזור אפידרמיס נמדד".
  11. חשב את נפח הפצע של הפצע כולו.
    1. חזור על שלבים 11.8.1 עד 11.8.4 באמצעות המדידות "אזור הפצע נמדד".
  12. חשב את אחוז נפח האפידרמיס בפצע.
    1. חלק את נפח האפידרמיס הכולל בנפח הפצע הכולל והכפל ב- 100 כדי לקבל את האחוז (אל תעשה יחס זה עבור כל מקטע).
  13. חשב את אחוז האזור האפידרמיס בין אזור הפצע.
    1. חלקו את אזור האפידרמיס הכולל באזור הפצע הכולל והכפלו ב-100 כדי להשיג את האחוז. אם פצע הוא אפיתל מלא, מספר זה צריך להיות 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 5 מתאר את הטווח בערכים מדודים ומחושבים שהושגו על ידי ביצוע ניתוח מורפומטרי על פצעים מסוג פראי שנוצרו בזנים שונים של העכבר על ידי מנתחים מרובים וניתחו על ידי אנשים שונים. עכברים מסוג פראי זנים שונים יכולים להציג הבדלים סטטיסטיים כמתואר הן במחקרים שלנו והןבספרות 9,10. בהתבסס על תוצאות מייצגות אלה, אנו ממליצים כי, בתוך מחקר אחד, עכברים מזן אחד בלבד ישמשו. למרות שאנו ממליצים כי אותו אדם לבצע את כל הפצעים בתוך מחקר מסוים, אנשים מרובים יכולים לשמש מנתחים כל עוד האזור של הפצעים ביום 0 אינו שונה סטטיסטית בין עבודתו של הפרט. לבסוף, מכיוון שהניתוח המוקפאמטרי המתואר בפרוטוקול זה יכול להיות נרחב, אנשים מרובים יכולים לנתח חלקים מאותו ניסוי, אבל רק אם תוצאות הניתוח של שתי דגימות שלהם הן בטווח של 5% זה מזה. עם זאת, עדיף שאדם אחד ינתח את הפצעים בצורה עיוורת כדי להימנע מהטיה.

איור 6 מציג מטא-אנליזה המשווה מדידות פצע שהתקבלו על-ידי ביצועהפרוטוקול המתואר במחקר זה 11 עם מדידות שהתקבלו מה"אמצע" של הפצע ו-40 סעיפים מסביב. באות 6א,האזור האפידרמי ואזור הפצע חושבו מדידה של האפידרמיס ואורך הפצע על חלקי הפצע ואחריו חישוב אחוז האזור האפידרמיס בין אזור הפצע (המכונה לעתים "אחוז הסגר" או "אחוז האפיתלציה"). באופן דומה, בדמות 6B, אחוז האפידרמיס בפצע הושג כייחס של נפח האפידרמיס (מחושב מהאזור האפידרמי נמדד) על פני נפח הפצע (מחושב באזור הפצע נמדד). עבור שני הפרמטרים, הניתוח של הפצע כולו הראה הבדלים סטטיסטיים חזקים בין קבוצות (עד P < 0.001 בעקבות Anova חד-סטרי). עם זאת, המשמעות הופחתה (עד P < 0.01 בעקבות Anova חד-כיוון) כאשר רק 40 מקטעים באמצע היו נותחו. תוצאות אלה מדגימות ירידה ברמת המשמעות כאשר רק תת-קבוצה של הפצע מנותחת. נתונים אלה מצביעים על כך שפגמים עם גודל אפקט קטן יתגלו ככל הנראה רק בעת ביצוע ניתוח מורפומטרי על הפצע כולו, ושפנוטיפים קלים יותר לריפוי פצעים יחסרו מסוג ניתוח "אמצע הפצע".

מנהג נפוץ לניתוח בריפוי פצעי vivo כרוך במדידת אזור הפצע בחלקים היסטולוגיים שנבחרו אי שם בפצע12. עם זאת, הממוצע של אזור הפצע המדוד מהחלקים הסדרתיים של פצעים שלמים הושווה לזה שהתקבל ממקטעים של קבוצת המשנה האמצעית. התוצאות לא הראו הבדל משמעותי בין קבוצות ניסיוניות ובין שיטת ניתוח(איור 6C). עם זאת, הפרוטוקול הנוכחי משתמש באזור הנמדד (המוצג באיון 6C) עלכל הפצע כדי לחשב את נפח הפצע. כפי שניתן לראות באות 6D, נפח הפצע המחושב (שניתן לחשב רק באמצעות ניתוח הפצע כולו) שונה באופן משמעותי בין הקבוצות הניסיוניות. לסיכום, תוצאות מייצגות אלה מדגימות את החשיבות של ניתוח היסטולוגי מעמיק של פרמטרים לריפוי פצעים המתוארים בפרוטוקול זה על מנת לזהות פנוטיפים שאחרת היו מפספסים באמצעות ניתוח מסורתי יותר לריפוי פצעים.

Figure 1
איור 1: הליך פצע דו-צדדי. (א)תצלום מייצג של עכבר לאחר גזירת שיער וגילוח מהאזור הכירורגי. (ב)העור צבט בין להבי הכתף לאורך קו האמצע הגב. העכברממוקםעל צידו עם כיסוי העור מונח שטוח. (ד)ייצוג מיקום פונץ' ביופסיה. אגרוףבקפל עור. (ו)העכבר עם שני פצעים דו-צדדיים ביום 0 ורקמות בקרת ביופסיה אגרוף שנקתה כפי שצוין על ידי החצים הלבנים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הליך קצירת פצעים. (A-C) מה אתה עושה? תצלומים מאקרוסקופיים של 6 מ"מ פצעים לאחר 4 ימים (A), 7 ימים (ב)ו 11 ימים(ג). (D-E) מה אתה עושה? עם להב אזמל, חתך עורי נעשה בצורה של מלבן רחב הכולל את הפצעים ואת הרקמה הלא נפגעת שמסביב. (ו)העור שוחרר מהרקמות הבסיסיות עם מלקות ומספריים. ייצוגשל פצעים דו-צדדיים שנקטפו. (H)הקו הלבן המקוקד מייצג את גבול הרקמה שנקטפה בעקבות השימוש בביופסיית ניקוב (שיטה זו מאפשרת כמות מתוקנת של רקמות שנקטפו). (I)הקו הלבן המקוקד מייצג את גבול הרקמה שתחתוך להיסטולוגיה (צורה מלבנית מאפשרת הטבעה קלה יותר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

פתרון זמן (דקות) טמפרטורה (צלזיוס) לחץ (kPa)
80% אתו 30 Rt לא יה"ח
95% ETOH 30 Rt לא יה"ח
100% ETOH 30 Rt לא יה"ח
סילן (19) 30 Rt לא יה"ח
סילן (19) 30 Rt לא יה"ח
פרפין 30 60 20
פרפין 30 60 20

טבלה 1: הליך עיבוד לדוגמה להטבלת פרפין. RT = טמפרטורת החדר. לא /ת = לא ישים.

Figure 3
איור 3: הטביעה וקרוחב פצע. (א)פצע מעובד פרפין שוכב שטוח בתבנית הטבעה. (ב)הפצע הוחזק ב-90° ("עומד") מהמשטח האופקי של התבנית להטביעה. (ג)פצע מוטבע פרפין בכיוון נכון עבור sectioning(D)פרפין בלוק רכוב על microtome היה לחתוך לתוך סרטים של כ 20 קטעים(E)סרטי פרפין לחתוך בממקמים 5-מקטעים כפי שצוין על ידי הסוגריים הלבנים. (F)קטעים טוריים שהונחו שטוח באמבט מים חמים (40-45 °C) הותקנו על מגלשת מיקרוסקופ. הקריקטורה ב (A-C) מייצגת את הפצע (כתום) בעור (כחול) עם הכיוון הנכון של האפידרמיס (ה) ואת הדרמיס (ד) עבור כל שלב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: מאפיינים היסטולוגיים של פצעים ואיור של פרמטרים מורפומטריים. (א,ב) מה אתה עושה? תכונות היסטולוגיות של יום 4 (A) ויום 7 (ב)6 מ"מ פצע. אני לאיודע מה לעשות. ייצוג המדידות השונות המשמשות לביצוע הניתוח המוקפאומטרי הכמותי: אורך האפידרמיס (C, D , קו שחורמנוקד), אזור נמדד של האפידרמיס(C, D, אזור מוצל צהוב), אורך הפצע (E, F , קוצהוב מנוקד) ותחום נמדד של הפצע כולו (E, F, אזור מוצל אפור). HF = זקיק שיער; סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מאפיינים מורפומטריים של פצעים מייצגים מסוג 6 מ"מ ביום 4, יום 7 ויום 11 לאחר הפציעה. חלקות מפוזרות מייצגות נתונים שהתקבלו מניתוחים מורפומטריים של פצעים מסוג פראי של 6 מ"מ שנוצרו בזנים שונים של העכבר על ידי מנתחים מרובים וניתחו על ידי אנשים שונים. (א)נפח פצע,(ב)נפחאפידרמיס, (ג)אחוז האפידרמיס בפצע,(ד)אזור הפצע (מחושב),(ה)אזור אפידרמיס (מחושב), ו -(F)אחוז של אזור האפידרמיס בין אזור הפצע להדגים את טווח הווריאציה בערכים מורפומטריים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: מטא-אנליזה המשווה פרמטרים שהתקבלו מפצע שלם עם אמצע הפצע מזהה פגמים חדשים בעלי משמעות גבוהה יותר. מורפוזיה ריפוי הפצע בוצע ביום 7 פצעים מוזרקים עם תמיסת מלח (שליטה), שינוי גורם גדילה בטא 3 (Tgfb3), Tgfb3 עם נוגדן נטרול (Tgfb3 + NAB) ונטרול נוגדן לבד (NAB). מדידות בוצעו על פצעים ים מדורים סדרתיים ("שלם") או על 40 חלקים מאמצע הפצע ("אמצע") והשתמשו בחישוב אחוז האזור האפידרמיס מעל אזור הפצע (א),אחוז האפידרמיס בפצע (ב),ונפח הפצע(ד). (ג)מייצג את הממוצע של אזור הפצע נמדד על כל או באמצע הפצע. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, ns = לא משמעותי, חד-כיוון Anova). נתון זה שונה באמצעות נתונים מ- Le et al.11. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה 1: דוגמה של גיליון אלקטרוני להקלטת מידות מורפומטריות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודל הפצע ים דו צדדי הוא הליך להתאמה אישית מאוד אשר יכול לשמש כדי ללמוד היבטים רבים ושונים של ריפוי הפצע. לפני תחילת פרויקט ריפוי הפצע, החוקרים צריכים לבצע ניתוח כוח כדי לקבוע את מספר הפצעים הדרושים כדי לזהות פגם בגודל אפקט מסוים. חוסר עקביות קיים בתוך הספרות על אם עכברים בודדים או פצעים צריך לשמש משכפלים ביולוגיים, עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי אין מתאם משמעותי בין שני פצעים על בעלחיים יחיד 4. הדבר מצביע על כך שפצעים מאדם יחיד אינם תלויים זה בזה ותוכלים להיחשב כמשכפלים ביולוגיים, מה שמפחית את מספר העכברים הנדרשים לזיהוי פגם. הדבר רלוונטי כאשר בוחנים גדלי אפקט קטנים שעבורם נדרש מספר גבוה של פצעים כדי להגיע למשמעות4. בנוסף, תוצאות חישוב הכוח עשויות להשפיע על מספר הפצעים המבוצעים על כל בעל חיים, כאשר 2 ו-4 פצעים לכל בעל חיים הם הנפוצים ביותר.

הפרוטוקול הכירורגי עצמו הוא גם גמיש מאוד. בעוד אנו ממליצים על הרדמה על ידי מאדה isoflurane בשל אורך הליך קצר והתאוששות מהירה (10-15 דקות לכל עכבר), חוקרים ללא גישה לאייד יכול להשתמש הרדמה להזרקה כולל קטמין / xylazine או פנטוברביטל. הבחירה של משכך כאבים מתאים היא קריטית במיוחד, כפי שהוא נוגע לשלבים דלקתיים של ריפוי הפצע. השימוש בתרופות אנטי דלקתיות nonsteroidal (NSAIDS) כגון מלומיין Flunixin או Meloxicam יש להשתמש בזהירות כפי שהם יכולים להקטין דלקת. אופיואידים, לכן, העדיפו במחקרים שבהם הדלקת נחקרת. אנו ממליצים משכך כאבים (למשל, Buprenorphine ממושך-שחרור) אשר מספקים עד 48 שעות של משכך כאבים ולחסל את הצורך חוזר, מינונים נוספים. כל ההליכים הכירורגיים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות הפדרליות ונתמך על ידי פרוטוקול בעלי חיים מאושר.

ריפוי פצעים הוא תהליך המקיף מספר שלבים, שכל אחד מהם מאופיין בתהליכים ביולוגיים שונים הקשורים לסוגי תאיםשונים 3. השלב הדלקתי מתרחש בין ימים 0 ו 5, עם ההעברה המוקדמת של נויטרופילים פולימורפונונליאר (PMN) מקרופאגים לאתר שלפציעה 13. שלב ההתפשטות מתרחש בין 3 ו 14 ימים עם אפיתל מחדש לוקח כמות משתנה של זמן בהתבסס על גודל הפצע14. בפרוטוקול הזה, השתמשנו באגרוף ביופסיה של 6 מ"מ ורוב הפצעים התעמיסו מחדש ב-7 ימים. עם זאת, מסגרת זמן זו תצטרך להיות מקוצרת אם נעשה שימוש באגרופים קטנים יותר (הם זמינים קטנים כמו 1 מ"מ). בשילוב עם נקודות זמן מוקדמות יותר, פצעים קטנים אלה עשויים להיות עדיפים כדי להפחית את כמות ניתוחים היסטולוגיים15. לבסוף, שלבי השיפוץ וההתבגרות מתרחשים לאחר 7 ימים ועד שנה לאחר הפציעה16. נקודות זמן מאוחרות אלה עשויות להידרש לחקור את התבגרות הפצע או לחקור עיכובים בריפוי פצעים בבעלי חיים ניסיוניים. לכן, החוקר יצטרך לקבוע את נקודות הזמן הקריטיות הדרושות כדי לחקור שלבים מסוימים של ריפוי פצעים בהתבסס על ההשערה הספציפית שלהם5.

הניתוח של ריפוי פצעים לעתים קרובות אינו מוגבל לניתוחים היסטולוגיים. ניתן להשתמש בקטעי פרפין לא מושתקים לניתוחים נוספים כגון חיסון ים או טריכרום של מאסון לתצהיר קולגן. העיבוד של רקמת שליטה (ביופסיות אגרוף) ואת שלבי הקציר של הרקמה יהיה כל תלוי איך, בנוסף לניתוחים היסטולוגיים, ריפוי הפצע מוערך. כחלק מהפרוטוקול הכירורגי, ביופסיות אגרוף מוסרות כדי ליצור את הפצע המחולק. אגרופים אלה יכולים לשמש רקמת בקרה ללא נפגעים עבור יישומים במורד הזרם כגון חלבון (עבור פרופיל מערבי או ציטוקין), הפקת DNA או RNA ויש לעבד בהתאם. מומלץ לשמור לפחות אגרוף אחד לניתוח היסטולוגי, במיוחד במקרים שבהם העור מטופל לפני הפציעה (לדוגמה, יישום של טמוקסיפן עבור אינדוקציה של קר-Lox שילובמחדש 17). בדיקת האגרוף יכולה לקבוע את ההשפעה של הטיפול על מורפולוגיה חותכת או פשוט לאפשר הערכה של מורפולוגיה חותכת בסיסית של מודל העכבר המסוים בשימוש. ניתן לקצור פצעים שלא משמשים להיסטולוגיה עם ביופסיית פונץ' המקיפה את גודל הפצע. הליך זה יש כמה יתרונות, כולל קצירת אותה כמות של רקמה ללא קשר לגודל הפצע (פצעים גדולים יותר יש פחות סביב רקמות בריאות). לבסוף, אנו מתארים את השימוש של 4% paraformaldehyde כמו קיבעון ופרפין כחומר לשימור והטמיעה של רקמות, בהתאמה. ייתכן שיהיה צורך בתיקונים אחרים עבור יישומים מסוימים וניתן להחליף ם (לדוגמה, המקבעים של Carnoy's או Bouin). עבור הכתמים החיסוניים הטובים ביותר, הקפאה והטבעה של הפצע בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית ואחריו קטע קפוא נשאר השיטה של בחירה.

ניתוח של רקמה פצועה יכול להציג אתגרים רבים, במיוחד ביום 4 פצעים בגלל הנוכחות של גלד. כדי ליצור מקטעים באיכות גבוהה, מומלץ לוודא כי כל חלקי microtome מהודקות בחוזקה, מחזיק הבלוק הוא נסוג למיקום הראשוני שלה, מחזיק הלהב מוגדר בין 0 ל 10° והלהב מהודוק בחוזקה אך לא חזק מדי. למרות שבלוק הפרפין מקורר, הרקמה עדיין עלולה לגרוס. אם הגריסה נמשכת, ניתן יהיה להציב פיסת קרח על הבלוק למשך 5 דקות בעודה מותקנת. לאחר שהניתוח החל, מומלץ מאוד להימנע מהסרת הבלוק מהמיקרוטומיה כדי למנוע אובדן של מקטעים פרפין. זה הכרחי להקליט את כל מקטעי הפרפין האבודים, הן את המספרים שלהם והן את הדירוג שלהם במקטעים הטוריים. זה ישפיע על הניתוח המוקפאמטרי וצריך לקחת בחשבון. לאחר ייזום קטעים, זיהוי של רקמה פצועה על חלקים לא מוכתמים עשוי להיות קשה, במיוחד אם לא מכיר את ההיטולוגיה. בהטלת ספק, מומלץ להיות שמרני ולשמור על כל הסעיפים המכילים רקמות. ברגע שהכתם ההיסטולוגי מבוצע, ארגון הרקמות יהיה ברור יותר והפצע יהיה ברור יותר. מדי פעם, זקיקי השיער לא יכולים להיות גלויים בבירור או עשויים להיות רחוקים מקצה הפצע. אם זה המקרה, מאפיינים מרכזיים אחרים של הרקמה הפצועה יכולים לשמש כדי לבסס את גבולות הפצע כולל עלייה פתאומית ואחריו ירידה מיידית בעובי האפידרמיס ושינויים חדים בארגון רקמת החיבור(איור 4א-ב).

הדמיה דיגיטלית היא צעד קריטי בניתוח המורפומטרי. הניתוח המוקפאמטרי צריך להתבצע על תמונות בודדות באמצעות ציון דרך על כל תמונה כדי למנוע מדידות חוזרות ונשנות. עם זאת, ניתן לתפור את כל המסגרות יחד באמצעות תוכנה דיגיטלית ולבצע את הניתוח בתמונה אחת. למרות שזה נראה קל יותר בהתחלה, מניפולציה של תמונה גדולה עשויה להאט את תהליך הניתוח. הבחירה של הסעיף היא גם קריטית לניתוח. למרות שאנו ממליצים לרכוש דיגיטלית את החלק העליון של כלשקופית 8, איכות המקטע צריך להיות בראש סדר העדיפויות ואת הטוב ביותר של 5 מקטעים על שקופית זו יש למצוא תמונה. מקטעים עם קפלים קטנים עדיין ניתן לנתח על ידי הערכת האזור / אורך של הקפל. יש להקליט את מספר מקטע מסוים זה הן בקובץ הדיגיטלי והן בגיליון האלקטרוני של Excel, כך שניתן יהיה להתאים את המרחק בין המקטע הקודם למקטע המנותח הבא בהתאם.

פצעים חותכים משפיעים על כ 6.5 מיליון אנשים עם טיפול עולה מעל $25 מיליארדדולר בשנה 18 והם מרכיב טבוע של הליכים כירורגיים בנוסף להיות משני לדאגות בריאותיות רבות אחרות, כולל סוכרת והשמנת יתר. העכבר שימש מודל נוח לחקר מחלות אנושיות בגלל הקלות במניפולציה הגנום שלה, למרות לעתים קרובות הפגין פנוטיפ עדין לעומת ההפרעה האנושית. מודל הפצעים הדו-צדדיים וניתוח מורפומטרי מאוחר יותר המתואר בפרוטוקול זה משמעותיים בשל יכולתו לטפל בקשיים בזיהוי פגמים קלים בתהליך ריפויפצעים מורכב מטבעו 19. בשל רגישותו הרבה יותר והשונות המופחתת, פרוטוקול זה מספק הזדמנויות להשתמש בפחות בעלי חיים כדי להשיג את אותה רגישות ניסיונית. הפרוטוקול הוא מאוד להתאמה אישית, ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את כל השלבים של תיקון רקמות. ניתוח מורפומטרי היסטולוגי מפורט בשילוב עם אפיון פנוטיפי של הרקמה יש פוטנציאל גדול כדי להגדיל את הידע הדרוש כדי לקדם את ההבנה של גורמים קריטיים לווסת תיקון רקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לכל חברי מעבדת דאנוולד שתרמו לייעול הפרוטוקול הזה לאורך השנים, וגם לג'ינה שטמן, שהתעקשותה לקדם את השימוש במקטעים סדרתיים לניתוח פצעים אפשרה את יצירתה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מ-NIH/NIAMS למרטין דנוואלד (AR067739).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% ethanol
70% ethanol
80% ethanol
95% ethanol
Alcohol Prep NOVAPLUS V9100 70% Isopropyl alcohol, sterile
Ammonium hydroxide
Biopsy pads Cellpath 22-222-012
Black plastic sheet Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper
Brightfield microscope With digital acquisition capabilities and a 4X objective
Cotton tipped applicators
Coverslips 22 x 60 #1
Dental wax sheets
Digital camera Include a ruler for scale, if applicable
Dissection teasing needle (straight)
Embedding molds 22 x 22 x 12
Embedding rings Simport Scientific Inc. M460
Eosin Y
Glacial acetic acid
Hair clipper
Heating pad Conair Moist dry Heating Pad
Hematoxylin
Microtome
Microtome blades
Paint brushes
Paraffin Type 6
Paraformaldehyde
Permount
Phosphate buffer solution (PBS)
Povidone-iodine Aplicare 82-255
Processing cassette Simport Scientific Inc. M490-2
Razor blades ASR .009 Regular Duty
Scalpel blades #10
Scalpel handle
Sharp surgical scissors sterile for surgery
Skin biopsy punches Size as determined by researcher
Slide boxes
Slide warmers
Superfrosted microscope slides Fisher Scientific 22 037 246
Temperature control water bath
Tissue embedding station Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate
Tissue processor Minimum of a oven with a vacuum pump
Triple antibiotic opthalmic ointment
tweezers, curved tip sterile for surgery
tweezers, tapered tip sterile for surgery
WypAll X60 Kimberly-Clark 34865

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  2. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  3. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  4. Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
  5. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  6. Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
  7. Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
  8. Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
  9. Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
  10. Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
  11. Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
  12. Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
  13. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  14. Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
  15. Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
  16. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  17. Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
  18. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  19. Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).

Tags

החודש ב JoVE גיליון 162 ריפוי פצע פצע excisional היסטולוגיה מורפומטריה עור עכבר ניתוח תיקון רקמות
מודל ריפוי פצעים מרין וניתוח פצעים מורפומטריים היסטולוגיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rhea, L., Dunnwald, M. Murine… More

Rhea, L., Dunnwald, M. Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61616, doi:10.3791/61616 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter