Summary
Detta protokoll beskriver hur du genererar bilaterala excisionella sår med full tjocklek hos möss och hur man därefter övervakar, skördar och förbereder såren för morfometrisk analys. Inkluderat är en ingående beskrivning av hur man använder seriella histologiska avsnitt för att definiera, exakt kvantifiera och upptäcka morfometriska defekter.
Abstract
Den murine excisional sårmodellen har använts i stor utsträckning för att studera var och en av de sekventiellt överlappande faserna av sårläkning: inflammation, proliferation och ombyggnad. Murine sår har en histologiskt väldefinierad och lätt igenkännlig sårbädd över vilka dessa olika faser av läkningsprocessen är mätbara. Inom området är det vanligt att använda ett godtyckligt definierat "mitten" av såret för histologiska analyser. Sår är dock en tredimensionell enhet och ofta inte histologiskt symmetriska, stödja behovet av en väldefinierad och robust metod för kvantifiering att upptäcka morphometric defekter med en liten effekt storlek. I detta protokoll beskriver vi proceduren för att skapa bilaterala, full-tjocklek excisional sår i möss samt en detaljerad instruktion om hur man mäter morfometer parametrar med hjälp av ett bildbehandlingsprogram på välj seriella avsnitt. De tvådimensionsmått av sårlängd, epidermal längd, epidermalt område och sårområde används i kombination med det kända avståndet mellan sektioner för att extrapolera det epidermala området med tre dimensioner som täcker såret, den totala sårytan, den epidermala volymen och sårvolymen. Även om denna detaljerade histologiska analys är mer tid och resurs konsumerar än konventionella analyser, ökar dess rigor sannolikheten för att upptäcka nya fenotyper i en inneboende komplexa sårläkningsprocessen.
Introduction
Testning sårläkning är en komplex biologisk process med sekventiellt överlappande faser. Det kräver samordning av cellulära och molekylära processer som är tidsmässigt och rumsligt reglerade för att återställa barriärfunktionen hos det skadade epitelet. I den första fasen, inflammation, neutrofiler och makrofager migrera in i såret, mobilisera lokala och systemiska försvar1. Efter och överlappande den inflammatoriska fasen är spridningsstadiet. Fibroblaster börjar snabbt proliferera och migrera in i granulationsvävnaden. Keratinocyter bort från framkanten riktad föröka sig mot såret som differentierade keratinocyter i framkanten migrera till åter epithelialisera såret2. Slutligen börjar ombyggnads- och mognadsfasen, under vilken fibroblaster i granulationsvävnaden börjar syntetisera och deponera kollagen. Ombyggnad och organisation av den nya matrisen kan pågå upp till 1 år efter skada3. På grund av komplexiteten i överlappande händelser som involverar cross-talk mellan flera celltyper, och trots år av forskning, många av de cellulära och molekylära mekanismer bakom sårläkning förbli dåligt förstådd.
Musmodellen är den dominerande däggdjursmodellen för att undersöka mekanismer för sårläkning på grund av deras användarvänlighet, relativt låg kostnad och genetisk manipulabilitet1,4,5. Även om olika typer av sår har beskrivits i murine modellen, den vanligaste är en excisional sår (antingen bilaterala punch eller direkt punch biopsi), följt av incisional sår modeller4. Excisional sår modellen har en klar fördel jämfört med den incisional modellen som det i sig genererar kontroll vävnad som inte har genomgått läkningsprocessen. Den hålslagsbiopsivävnad som strukits som en del av det kirurgiska protokollet kan bearbetas på samma sätt som den sårade vävnaden och användas för att fastställa de homeostatiska villkoren för ett önskat kriterium. Struken kontrollvävnad kan också vara användbar om man bedömer effekterna av en hudförbehandling eller bekräftar en lyckad genförändelse vid tidpunkten för skadan4.
Läkningsparametrar kan bedömas av många olika tekniker, inklusive planimetry eller histologi. Dock kan planimetry endast utvärdera synliga egenskaper av såret, och på grund av närvaron av en sårskorpa, ofta inte korrelerar till mätningar av läkning som visualiseras av histologi, därigenom gör histologi "guldmyntfoten" av analys4. Trots histologisk analys är den gyllene standarden, är det oftast utförs på en godtycklig delmängd av såret6,7. Till exempel, skära såret i "halv" före inbäddning och avsnittning såret är för närvarande vanligt att minska den tid och resurser som spenderas på sektionering material och dataanalys. Metoden för morfometer analys som beskrivs i detta protokoll utvecklades för att omfatta hela sårvävnaden, att korrekt återspegla morfologiska egenskaper såret, och att öka sannolikheten för att upptäcka sårläkning defekter med en liten effekt storlek. I detta protokoll, vi detalj en kirurgisk metod för att generera de vanligaste studerade murine såret, den bilaterala full-tjocklek excisional sår, samt en detaljerad och rigorös metod för histologiska analys sådan används sällan i fältet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment slutfördes i enlighet och överensstämmelse med federala bestämmelser och University of Iowa politik och förfaranden har godkänts av University of Iowa IACUC.
1. Djur och djurhållning
- Använd vuxna möss av önskad muslinje vid 8-10 veckors ålder när hårsäcksstadiet är i telogen.
- På operationsdagen, separera möss i rena burar och individuellt hus för att minimera sårstörningar.
2. Kirurgi
OBS: Det är onödigt att upprätthålla sterila kirurgiska förhållanden. Medan försiktighet bör vidtas för att upprätthålla sterilitet mellan djur, är punch biopsi själv görs på en ren, men nonsterile yta. Operationen varaktighet per djur är mellan 10 och 15 min.
- Anestetisering
- Söva djuret i 1-2 min i en induktionskammare med isoflurane spridaren inställd på en 4-5% flödeshastighet och syreflödesmätaren inställd på 1 liter per minut. Se Diskussion för alternativ anestesi alternativ.
- Bekräfta korrekt anesthetization innan du påbörjar proceduren. Anestesidjupet kan bekräftas av en fast tå nypa.
- Överför musen från induktionsbehållaren till en noskon och minska isofluranflödet till 1,5 % och syreflödesmätaren till 0,5 L/min.
- Applicera oftalmisk salva på båda ögonen eftersom förfarandet överstiger 5 min.
- Bibehåll normal kroppstemperatur med hjälp av en termisk pad.
- Beredning av sårplatsen
- Använd en elektrisk rakhyvelsurr i en caudal rostral rörelse för att ta bort pälsen på baksidan av musen på axelnivå. Ta bort hår lägre på baksidan efter behov om utför mer än två sår.
- Ta bort det återstående håret genom att använda ett rakblad i en rostral caudalrörelse som hålls vid 20° från musens baksida för att noggrant raka det klippta området (Bild 1A).
- Rengör det rakade området med en povidone-jodspudd.
- Torka av huden med en steril 70% isopropylalkohol prep pad att minska potentiella testning irritation från jod svabb.
- Skadade
- Nyp ihop huden mellan skulderbladen längs ryggsmängen och dra bort den inklämda hudvecket från kroppen (Figur 1B).
- Placera musen på sin sida med hudvecket på en plan yta draperad med en ren pappersbaserad handduk eller motsvarande. Använd ett ark med dentalvax under handduken för att skydda den underliggande ytan från skador (Bild 1C).
- Placera biopsi punch av önskad storlek så nära kroppen som möjligt och låt huden slappna av. Sträck inte ut huden, då blir sårstorleken större än den angivna hålslagstorleken (Bild 1D).
- Stansa huden genom att trycka ner, en gungande rörelse får användas för att säkerställa att alla hudlager på båda sidor har trängts in (Bild 1E). Använd en ny biopsi punch för varje djur.
- Ta bort stansbiopsierna från såren (Bild 1F). Om det fortfarande finns platser av fastsättning använda steril sax och pincett för att frigöra punsch från den omgivande huden. Bearbeta hålslagsbiopsikontrollvävnaden enligt krav utifrån nedströmsplaner för sårläkningsanalyser (se Diskussion för förslag).
- Ta makroskopiska fotografier från lika avstånd till sårplatserna eller med en linjal i ramen för att kunna mäta det ursprungliga sårområdet och eliminera extremvärden från analys.
- Administrera analgesi i minst 24 h i enlighet med ett godkänt djurprotokoll. Till exempel: Buprenorfin SR-LAB, injiceras som en engångsdos subkutant vid 0,5-2 mg/kg för 48 h smärtlindring (se Diskussion för alternativa förslag och överväganden).
- Övervaka musen som det kommer ut ur anestesi tills den upprätthåller en upprätt hållning och går normalt runt buren.
3. Post sår övervakning
- Övervaka dagligen möss för experimentella effektmått enligt vad som bestäms av prövaren och i enlighet med och överensstämmelse med institutionella protokoll. Exempel är: infektion, synlig viktminskning, eller en hunched hållning.
- Ta dagliga makroskopiska fotografier på ett kontrollerat sätt som gjordes efter den första operationen.
4. Skördesår
- Avliva möss vid önskad tidpunkt efter sår i enlighet med ett godkänt djurprotokoll.
- Ta makroskopiska fotografier av sårplatserna på ett kontrollerat sätt som överensstämmer med tidigare fotografiförvärv (Figur 2A,C).
- Skär en bred rektangel runt sårställena med hjälp av en skalpell( Figur 2D,E).
- Befria den rektangulära vävnadsbiten med hjälp av sax och pincett för att skala tillbaka och skära bort huden från den underliggande vävnaden (Figur 2F). Placera i en petriskål (Bild 2G).
- Skörda såren. Trimma ner till 2 mm av ovävd vävnad som omger alla sidor av såret i rektangulär form (Figur 2H,I). Se Diskussion för alternativa alternativ för att skörda såret.
- Bearbeta såren enligt vad som krävs för efterföljande studier. Reservera minst ett sår per mus för paraffininbäddning och histologisk analys.
5. Sårfixering och inbäddning
- Fixa såret
- Fixera sårvävnaden i en nyberedd 4% paraformaldehydlösning8 för 3 h vid rumstemperatur överför sedan till 4 °C över natten. Elektronmikroskopi (EM) grad paraformaldehyd och lösningsfiltrering krävs inte.
- Tvätta såren två gånger i 30 min i 1x PBS.
- Ersätt PBS med 70% ETOH och förvara vid 4 °C tills ingjutning. Bearbeta vävnader inom 24-48 h för att undvika antigenförlust eller inom 1-2 veckor om endast utvärdera histologiska egenskaper.
- Bearbeta och bädda in såret
- Överför varje sår till en inbäddningskassett. Etikett bädda kassetter i blyerts som processen kommer att ta bort bläck.
- Bearbeta vävnaden antingen manuellt eller med hjälp av en automatiserad processor genom att torka ut vävnaden med ökande etanolprocent, rensa med xylen, och sedan infiltrera vävnaden med paraffinvax (Tabell 1).
- Bädda in såret 90° ("stående") från inbäddningsformens horisontella yta (Figur 3A,B).
6. Analys av sårområde dag 0
- Ladda ner NIH-Image J eller NIH-Fiji fri programvara (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Öppna en fil med ett fotografi av dag 0 sår.
- Markera rutan för "Område" under Analysera | Ange Mått.
- Välj "Ställ skala" under Analysera. Ange avståndet i bildpunkter, det kända motsvarande avståndet och sträckans enhet (= längdenhet) om makroskopiska mätningar ingår i studien eller hoppar över detta steg om det bara krävs relativa mätningar.
- Välj "Frihandsval" i Fijis verktygsfält.
- Skissera omkretsen av såret.
- Klicka på Mät under Analysera.
- Skapa ett kalkylblad för att hålla reda på mätningarna per djur per sår.
- Kopiera mätningen av sårområdet i kalkylarket.
- Beräkna medelvärdet för area och standardavvikelsen för alla sår för ett givet experiment.
- Uteslut eventuella sår utanför två standardavvikelser av medelvärdet från histologisk analys.
7. Seriell snittning
- Kyl ned de paraffininbäddade sårblocken vid 4 °C över natten.
- Sätt in paraffinblocket på blockhållaren på mikrotomen och orientera så att klingan skär rakt över blocket. Orientera blocket så att vävnaden "står" i 90° som tillåter samtidig snittning av epidermis och dermis (Figur 3C,D).
- Gör 2-4 band av 20-30 paraffin sektioner av 7 μm vardera.
- Använd en torr pensel och en dissekering retas nål för att överföra varje band till ett fast men ändå manipulatable yta som en fast svart plastfolie.
- Lösgör den övre delen av varje band med ett rakblad och placera på ett mikroskop bild.
- Observera de obefläckade sektionerna under ett ljusfältmikroskop för att bestämma vilka som innehåller sårad vävnad, som kan identifieras genom frånvaro av hårsäck, förändringar i bindvävens utseende eller epidermis, och/eller förekomsten av en sårskorpa (Figur 4A,B).
- Kassera oavvävda sektioner upp till 20 sektioner före sårets början.
- Sektion genom såret genom att upprepa steg 7.3 och 7.4 tills inget sår upptäcks i obefläckade sektioner.
8. Montering av paraffinsektioner
- Separat paraffin sektioner varje 5 sektioner med ett rakblad, börjar med den första band (Bild 3E).
- Etikettmikroskopsglas med både bildnumret och alla sektionsnumren.
- Ta tag i gruppen med 5 sektioner med en våt färgpensel och flyta dem på ytan av vattnet i ett varmt vattenbad (40-45 °C) för att platta ut dem.
- Plocka ut gruppen med 5 sektioner ur vattenbadet med hjälp av en av de märkta mikroskopglasen (Figur 3F) och lägg på en glidvarmare inställd vid 37 °C i upp till 24 h.
- Förvara bilderna upprätt i en diakartong.
9. Histologisk färgning
- Överför varje8:e mikroskopsglas (motsvarande varje40:e paraffinsektion) till ett färgningsställ och fläck med hematoxylin och eosin.
10. Mikroskopisk avbildning
- Skaffa bilder med hjälp av ett ljust fältmikroskop utrustat med en 4x objektiv och digital förvärvskapacitet. Registrera den skala som bilden tas med.
- Bild hela såret av den övre delen av varje färgade glida och se till att inkludera några ovävda vävnad på vardera sidan. Ta flera överlappande bilder om såret är större än ramen för en enda bild.
- Spara filen inklusive avsnittsnumret för morfometrisk analys. Använd avsnittsnumret följt av a, b, c, etc. för överlappande bilder av samma sår.
11. Morfometrisk analys
OBS: När såret sträcker sig över flera bilder, summera de mätningar som tas från de enskilda bilderna för att få ett värde per mått per sårsektion för att spela in i kalkylbladet.
- Öppna en digital fil av en färgad sårbild i bild J. Använd inte sydda bilder för analys. Utför mätningar på inzoomade överlappande bilder genom att hitta landmärken att lämna av och plocka upp mätningar från bild till bild.
- Ställ in skal- och måttpreferenserna.
- Välj "Ställ skala" under Analysera. Ange avståndet i pixlar, det kända motsvarande avståndet och avståndets enhet (= längdenhet). Skalan ska visas i fönstret och ska motsvara skalan bilden förvärvades vid.
- Markera rutan "Global" för att behålla skalan densamma för varje öppen bild.
- Upprepa steg 11.2.1 till 11.2.2 varje gång Bild J stängs och öppnas igen.
- Markera rutan för "Område" under Analysera | Ange Mått.
- Mät sårlängden
- Välj "Frihandsval" i Fijis verktygsfält.
- Mät start från den oskadade vävnadens sista hårsäck på ena sidan av såret till den första hårsäcken i den oskadade vävnaden på andra sidan av såret (Figur 4A,B).
- Spåra längs dermo-epidermal korsningen för att nå dessa två landmärken. Om epidermis inte täcker hela såret, följ korsningen dermo-epidermal på ena sidan av såret och där migrerande tungan slutar fortsätta efter den överlägsna aspekten av granulation vävnad eller korsningen mellan granulationsvävnad och sårskorpa tills du når migrerande tungan och sedan slutligen den första hårsäcken av den oskadade vävnaden på andra sidan (Figur 4E,F).
- Klicka påMät under Analysera. Längden på mätningen kommer att visas i samma enheter som anges i skalan.
- Skapa ett kalkylblad för att hålla reda på mätningarna (Tilläggstabell 1).
- Kopiera sårlängden i kalkylarket.
- Mät epidermallängden
- Om epidermis täcker hela såret, är den epidermala längden densamma som sårlängden.
- Kopiera "sårlängden" mätning i "epidermal längd" kolumnen i Excel-kalkylbladet och hoppa till steg 11.5.
- Om epidermis inte täcker hela såret, välj ut de "Frihandsvalen" och mät avståndet mellan varje epidermal framkant efter den överlägsna aspekten av granulationsvävnaden eller korsningen mellan granulationsvävnaden och sårskorpan till den första hårsäcken (Figur 4C,D).
- Klicka påMät under Analysera.
- Subtrahera denna mätning från sårlängden och registrera talet under "epidermal längd" i Excel-kalkylbladet.
- Om epidermis täcker hela såret, är den epidermala längden densamma som sårlängden.
- Mät sårområdet
- Välj "Frihandsval" i Fijis verktygsfält.
- Mät start från den oskadade vävnadens sista hårsäck på ena sidan av såret till den första hårsäcken i den oskadade vävnaden på andra sidan av såret (Figur 4A,B,E,F).
- Spåra längs den överlägsna aspekten av epidermis (inkludera inte sårskorpa) eller den överlägsna aspekten av granulationsvävnaden om såret inte är helt täckt av epidermis.
- Fortsätt att spåra vertikalt längs hårsäcken in i granulationsvävnaden när den motsatta hårsäcken har nåtts och tills fettvävnad eller muskler har nåtts. Följ granulationsvävnadens sämre gräns till sårets motsatta sida och anslut dig till utgångspunkten längs hårsäcken för att stänga området (Figur 4E,F).
- Klicka påMät under Analysera.
- Kopiera sårområdet i kalkylbladet under "sårområde mätt".
- Mät det epidermala området
- Välj "Frihandsval" i Fijis verktygsfält.
- Om såret är helt epithelialized:
- Spåra längs den överlägsna aspekten av epidermis tills den motsatta hårsäcken nås och slutföra området genom att "återvända" till utgångspunkten efter dermo-epidermal korsningen mellan epidermis och dermis (Figur 4D).
- Klicka påMät under Analysera.
- Kopiera det epidermala området i Excel-kalkylbladet under "epidermal area measured" och hoppa till steg 11.7.
- Om såret inte är helt epithelialiserat:
- Spåra längs den överlägsna aspekten av epidermis tills framkanten och återgå till utgångspunkten efter korsningen dermo-epidermal (Figur 4C).
- Klicka påMät under Analysera.
- Upprepa steg 11.6.3.1 och 11.6.3.2 på motsatt sida av såret.
- Klicka på Mät under Analysera.
- Summera de två tal som erhålls i steg 11.6.3.2 och 11.6.3.4 och ange resultatet under "epidermalt område mätt" i kalkylarket.
- Upprepa steg 11,3 till 11,6 på varje40:e sektion (varje8:e bild).
- Beräkna hela sårets epidermala område.
- Skapa en ny kolumn i kalkylbladet "epidermal area calculated" bredvid "epidermal längd."
- Multiplicera talet för "epidermal längd" med 280 för varje sektion utom den sista (7 μm tjock sektion x 40 sektioner).
- Multiplicera talet för "epidermal längd" med 7 för den sista delen (tjocklek på avsnittet).
- Summera värdet av det "epidermala området beräknat" för varje avsnitt för att erhålla hela sårets epidermala område.
- Beräkna sårområdet på hela såret.
- Upprepa steg 11.8.1 till 11.8.4 med hjälp av sårlängdsmåtten.
- Beräkna hela sårets epidermala volym.
- Upprepa steg 11.8.1 till 11.8.4 med hjälp av mätningarna "epidermal area measured".
- Beräkna sårvolymen för hela såret.
- Upprepa steg 11.8.1 till 11.8.4 med hjälp av "sårytan mätt" mätningar.
- Beräkna andelen epidermal volym i såret.
- Dividera den totala epidermala volymen med den totala sårvolymen och multiplicera med 100 för att få den procentuella andelen (gör inte detta förhållande för varje avsnitt).
- Beräkna andelen epidermalt område bland sårområdet.
- Dela upp den totala epidermala ytan med den totala sårytan och multiplicera med 100 för att få den procentuella. Om ett sår är helt epithelialiserat, bör detta nummer vara 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 skildrar intervallet i uppmätta och beräknade värden som erhålls genom att utföra morfometrisk analys på vildtypssår som genereras i olika musstammar av flera kirurger och analyseras av olika individer. Möss av vildtyp från olika stammar kan visa statistiska skillnader som beskrivs både i våra studier och ilitteraturen 9,10. Baserat på dessa representativa resultat rekommenderar vi att möss från endast en stam, inom en studie, används. Även om vi rekommenderar att samma individ utför alla sår inom en viss studie, flera individer skulle kunna fungera som kirurger så länge området för såren på dag 0 är inte statistiskt olika mellan individens arbete. Slutligen, eftersom den morfometriska analys som beskrivs i detta protokoll kan vara omfattande, kunde flera individer analysera delar av samma experiment, men bara om resultaten av deras analys av två prover är inom 5% av varandra. Det är dock att föredra att ha en enda individ analysera såren på ett förblindat sätt för att undvika partiskhet.
I figur 6 visas en metaanalys där man jämför sårmätningar som erhållits genom att följa det protokoll som beskrivs idenna studie 11 med mätningar som erhållits från sårets "mitt" och 40 omgivande avsnitt. I figur 6Aberäknades det epidermala området och sårområdet från mätningen av de epidermala och sårlängderna på sårsektioner följt av beräkning av den procentuella andelen av det epidermala området bland sårområdet (ibland kallat "procent för stängning" eller "procent av epithelialisering"). På samma sätt erhölls i figur 6B, den procentuella andelen av epidermis i såret som kvoten mellan den epidermala volymen (räknat från det uppmätta epidermala området) över sårvolymen (beräknat från det uppmätta sårområdet). För båda parametrarna visade analysen av hela såret starka statistiska skillnader mellan grupper (upp till P < 0,001 efter Enkelriktad Anova). Signifikansen minskades dock (upp till P < 0,01 efter Enkelriktad Anova) då endast 40 sektioner mitt i skulle analyseras. Dessa resultat visar en minskning av nivån av signifikans när endast en delmängd av såret analyseras. Dessa uppgifter tyder på att defekter med en liten effekt storlek kommer sannolikt bara att upptäckas när de utför morphometric analys på hela såret, och att mer mild sårläkning fenotyper kommer att missas från en "mitten av såret" typ av analys.
Vanlig praxis för att analysera in vivo sårläkning innebär att mäta området för såret på histologiska sektioner som valts någonstans i såret12. Med detta i åtanke jämfördes medelvärdet av det uppmätta sårområdet från de seriella sektionerna av hela sår med den som erhölls från de mellersta delmängdssektionerna. Resultaten visade ingen signifikant skillnad mellan försöksgrupper och mellan analysmetod (Figur 6C). Det aktuella protokollet använder dock det uppmätta området (som visas i figur 6C) över hela såret för att beräkna sårvolymen. Som framgår av figur 6Dskiljer sig den beräknade sårvolymen (som endast kan beräknas med hjälp av analysen av hela såret) avsevärt mellan försöksgrupperna. Sammanfattningsvis visar dessa representativa resultat vikten av djupgående histologiska analys av sårläkning parametrar som beskrivs i detta protokoll i syfte att upptäcka fenotyper som annars skulle ha missat med hjälp av en mer traditionell sårläkning analys.
Figur 1: Bilateralt förfarande med excisionalt sår. (A) Representativt fotografi av en mus efter klippning och rakning hår från operationsområdet. (B) Huden klämde mellan skulderbladen längs ryggs mittlinjen. (C) Musen placerad på sin sida med skinfold som platt. (D) Representation av biopsistansplaceringen. (E) Stansade skinfold. (F) Musen med två bilaterala sår på dag 0 och de strukna hålslagsbiopsikontrollvävnaderna enligt de vita pilarna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Sårskördprocedur. (A-C) Makroskopiska fotografier av 6 mm excisional sår efter 4 dagar (A), 7 dagar (B) och 11 dagar (C). (D-E) Med en skalpell blad gjordes en testning snitt i form av en bred rektangel som inkluderar såren och omgivande ovävt vävnad. (F) Huden frisläpptes från underliggande vävnad med tes och sax. (G) Representation av skördade bilaterala sår. (H) Den prickade vita linjen representerar gränsen för vävnaden som skulle skördas efter användning av en stans biopsi (denna metod möjliggör standardiserad mängd vävnad skördas). (I) Den streckade vita linjen representerar vävnadens gräns som skulle trimmas för histologi (rektangulär form möjliggör enklare inbäddning). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Lösning | Tid (minuter) | Temperatur (Celsius) | Tryck (kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | Ej ant |
| 95% ETOH | 30 | Rt | Ej ant |
| 100% ETOH | 30 | Rt | Ej ant |
| Xylen | 30 | Rt | Ej ant |
| Xylen | 30 | Rt | Ej ant |
| Paraffin | 30 | 60 | 20 |
| Paraffin | 30 | 60 | 20 |
Tabell 1: Förfarande för provbearbetning av paraffininbäddning. RT = rumstemperatur. N/A = ej tillämpligt.
Bild 3: Sårinbäddning och snittning. (A) Paraffin-bearbetade sår liggande platt i en inbäddning mögel. (B) Såret hölls vid 90° ("stående") från den horisontella ytan av formen för ingjutning. (C) Paraffin-inbäddat sår ordentligt orienterade för snittning (D) Paraffin block monterad på mikrotomen var sektionerade i band av ca 20 sektioner (E) Paraffin band skära i 5-avsnitt steg som anges av de vita parentes. (F) Seriesektioner som lagts platt i ett varmt vattenbad (40-45 °C) monterades på ett mikroskopsglas. Den tecknade i (A-C) representerar såret (orange) i huden (blå) med rätt inriktning av epidermis (e) och dermis (d) för varje steg. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Histologiska egenskaper hos sår och illustration av morfometerparametrar. (A, B) Histologiska drag av en dag 4 (A) och en dag 7 (B) 6 mm sår. (C-F) Representation av de olika mätningar som används för att utföra den kvantitativa morfometriska analysen: längden på epidermis (C, D, prickad svart linje), uppmätt område av epidermis (C, D, gul skuggad område), längd på såret (E, F, prickad gul linje) och uppmätt område av hela såret (E, F, grå skuggat område). HF = hårsäck; skala bar = 1 mm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Morfometriska egenskaper hos representativa 6 mm sår av vildtyp vid dag 4, dag 7 och dag 11 efter sår. Spridda tomter representerar data som erhållits från morfometriska analyser av 6 mm vild-typ sår som genereras i olika mus stammar av flera kirurger och analyseras av olika individer. (A) sårvolym, (B) epidermal volym, (C) procent av epidermis i såret, (D) sårområdet (beräknat), (E) epidermal areal (beräknat), och (F) procent av epidermal areal bland sårområdet visar variationsintervallet i morfometriska värden. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Metaanalys jämförande parametrar som erhålls från helsåret med mitten av såret identifierar nya defekter med högre betydelse. Sårläkning morphometry utfördes dag 7 sår injiceras med saltlösning (kontroll), omvandla tillväxtfaktor beta 3 (Tgfb3), Tgfb3 med neutraliserande antikropp (Tgfb3 + NAB) och neutraliserande antikroppar ensam (NAB). Mätningar utfördes på seriellt uppdelade sår ("hela") eller på 40 sektioner från mitten av såret ("mitten") och användes för att beräkna andelen epidermalt område över sårområdet (A), andelen epidermis i såret (B), och sårvolymen (D). (C) representerar medelvärdet av sårområdet mätt på hela eller mitten av såret. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ns = inte betydande, Enkelriktad Anova). Denna siffra har ändrats med hjälp av data från Le et al.11. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1: Ett exempel på ett kalkylblad för registrering av morfometermätningar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den bilaterala excisional sår modellen är en mycket anpassningsbar förfarande som kan användas för att studera många olika aspekter av sårläkning. Innan du påbörjar ett sårläkningsprojekt bör utredarna utföra en effektanalys för att fastställa antalet sår som behövs för att upptäcka en defekt av en viss effektstorlek. Inkonsekvenser finns inom litteraturen om huruvida enskilda möss eller sår bör användas som biologiska replikat, men en färsk studie visade att det inte finns någon signifikant korrelation mellan två sår på ett enda djur4. Detta tyder på att sår från ett enda djur är oberoende av varandra och kan betraktas som biologiska replikat, vilket minskar antalet möss som krävs för att upptäcka en defekt. Detta är relevant när man överväger små effektstorlekar för vilka det krävs ett stort antal sår för att nå signifikans4. Dessutom kan resultaten av effektberäkningen påverka hur många sår som utförs på varje djur, med 2 och 4 sår per djur som vanligast.
Det kirurgiska protokollet i sig är också mycket flexibel. Medan vi rekommenderar anesthetization av isoflurane SPRIDARE på grund av den korta proceduren längd och snabb återhämtning (10-15 min per mus), kan utredare utan tillgång till en spridare använda injicerbara anestesi inklusive ketamin/xylazine eller pentobarbital. Val av ett lämpligt smärtstillande medel är särskilt kritiskt, eftersom det avser de inflammatoriska faserna av sårläkning. Användning av icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) såsom Flunixin meglumin eller Meloxikam ska användas med försiktighet eftersom de kan minska inflammation. Opioider är därför att föredra i studier där inflammation undersöks. Vi rekommenderar smärtstillande medel (t.ex. Buprenorfin Sustained-Release) som ger upp till 48 h analgesi och eliminerar behovet av upprepade, ytterligare doser. Alla kirurgiska ingrepp bör utföras i enlighet med federala riktlinjer och stödjas av ett godkänt djurprotokoll.
Sårläkning är en process som omfattar flera faser, som var och en kännetecknas av olika biologiska processer som involverar distinkta celltyper3. Den inflammatoriska fasen inträffar mellan dag 0 och 5, med den tidiga migrationen av polymorfoukleära neutrofiler (PMN) och makrofager till platsen för skada13. Den proliferativa fasen sker mellan 3 och 14 dagar med re-epithelialization tar en varierande tid baserat på storleken på såret14. I detta protokoll använde vi en 6 mm biopsi punch och de flesta sår var re-epithelialized av 7 dagar. Denna tidsram skulle dock behöva förkortas om mindre stansar användes (de finns så små som 1 mm). I kombination med tidigare tidpunkter kan dessa mindre sår vara att föredra att minska mängden histologiska analyser15. Slutligen sker ombyggnads- och mognadsfaserna efter 7 dagar och upp till ett år efter skadan16. Dessa senare tidspunkter kan krävas för att undersöka mognaden av såret eller att undersöka sårläkningsförseningar hos försöksdjur. Därför kommer utredaren att behöva fastställa de kritiska tidspunkter som krävs för att undersöka särskilda faser av sårläkning baserat på deras särskilda hypotes5.
Analysen av sårläkning är ofta inte begränsad till histologiska analyser. Obesvaga paraffinsektioner kan användas för ytterligare analyser som immunofluorescens eller Massons trichrom för kollagendeposition. Bearbetningen av kontrollvävnad (stansbiopsier) och vävnadens skördesteg kommer alla att bero på hur, förutom histologiska analyser, sårläkning bedöms. Som en del av det kirurgiska protokollet, stans tarmbiopsier tas bort för att generera excisional såret. Dessa stansar kan tjäna som unwounded kontroll vävnad för nedströms applikationer såsom protein (för västra eller cytokin profilering), DNA eller RNA extraktion och bör bearbetas därefter. Det rekommenderas att minst en stans sparas för histologisk analys, särskilt i fall där huden behandlas före sår (till exempel applicering av tamoxifen för induktion av Cre-Lox rekombination17). Undersökning av stansen kan bestämma effekten av behandlingen på testning morfologi eller helt enkelt tillåta bedömning av utgångsvärdet testning morfologi av särskilda mus modell som används. Sår som inte används för histologi kan skördas med en punch biopsi som omfattar storleken på såret. Detta förfarande har några fördelar, inklusive skörd samma mängd vävnad oavsett sårstorlek (större sår har mindre omgivande frisk vävnad). Slutligen beskriver vi användning av 4% paraformaldehyd som fixativ och paraffin som materialet för att bevara och bädda in vävnader, respektive. Andra fixativ kan krävas för vissa tillämpningar och kan ersättas (till exempel Carnoy's eller Bouins fixativ). För bästa immunofluorescerande färgning, frysning och inbäddning av såret i Optimal Skärtemperatur förening följt av frysta snittning förblir den metod för val.
Snittning av sårad vävnad kan innebära många utmaningar, särskilt dag 4 sår på grund av förekomsten av sårskorven. För att generera sektioner av hög kvalitet rekommenderas att verifiera att alla delar av mikrotomen är tätt infästa, blockhållaren dras in till sitt inledande läge, bladhållaren ställs in mellan 0 och 10° och bladet är tätt fastspät men inte överdraget. Även om paraffinblocket är kylt, kan vävnaden fortfarande strimla. Om fragmentering fortsätter kan en bit is placeras på blocket i 5 minuter medan den fortfarande är monterad. När snittningen har påbörjats rekommenderas det starkt att undvika att ta bort blocket från mikrotomen för att förhindra förlust av paraffinsektioner. Det är absolut nödvändigt att spela in eventuella förlorade paraffin sektioner, både deras nummer och deras ranking i den seriella snittningen. Detta kommer att påverka den morfemriska analysen och måste beaktas. Efter inledande snittning kan identifiering av sårade vävnad på obefläckade avsnitt vara svårt, särskilt om inte bekant med histologi. När du är osäker, det rekommenderas att vara konservativ och hålla alla avsnitt som innehåller vävnad. När den histologiska fläcken utförs kommer vävnadsorganisationen att vara mer uppenbar och såret mer distinkt. Ibland kan hårsäckarna inte vara tydligt synliga eller kan vara långt från sårkanten. Om så är fallet kan andra viktiga egenskaper hos den sårade vävnaden användas för att fastställa gränserna för såret inklusive en abrupt ökning följt av omedelbar minskning av epidermal tjocklek och skarpa förändringar i organisationen av bindväven (Figur 4A-B).
Digital bildbehandling är ett kritiskt steg i den morfometeranalys. Den morfometriska analysen ska utföras på enskilda bilder med hjälp av ett landmärke på varje bild för att undvika upprepade mätningar. Det är dock möjligt att sy ihop alla ramar med hjälp av digital programvara och utföra analysen på en enda bild. Även om detta verkar lättare i början, kan manipulering av en stor bild sakta ner analysprocessen. Valet av sektionen är också kritiskt för analys. Även om vi rekommenderar att digitalt förvärva den övre delen avvarje 8: e bild, bör kvaliteten på avsnittet prioriteras och det bästa av de 5 avsnitten på den bilden ska avbildas. Sektioner med små veck kunde fortfarande analyseras genom att uppskatta området / längden på luckan. Numret för just det avsnittet ska registreras både i den digitala filen och i Excel-kalkylbladet, så att avståndet mellan föregående och nästa analyserade avsnitt kan justeras i enlighet med detta.
Testning sår påverkar uppskattningsvis 6,5 miljoner människor med behandling kostar över $ 25 miljarderårligen 18 och är en inneboende del av kirurgiska ingrepp förutom att vara sekundär till många andra hälsoproblem, inklusive diabetes och fetma. Musen har använts som en bekväm modell för att studera mänskliga sjukdomar på grund av den lätthet i att manipulera dess arvsmassa, trots ofta uppvisar en subtil fenotyp jämfört med den mänskliga sjukdomen. Den bilaterala excisional sårmodell och efterföljande morphometric analys som beskrivs i detta protokoll är betydande på grund av dess förmåga att ta itu med svårigheten att upptäcka mindre defekter i en inneboende komplexa sårläkningsprocessen19. På grund av dess större känslighet och minskade variabilitet ger detta protokoll möjligheter att använda färre djur för att erhålla samma experimentella känslighet. Protokollet är mycket anpassningsbar och kan användas för att studera alla stadier av vävnad reparation. Detaljerad histologiska morfometer analys i kombination med fenotypic karakterisering av vävnaden har stor potential att öka den kunskap som behövs för att främja förståelsen av kritiska faktorer modulerande vävnad reparation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot alla medlemmar i Dunnwald Lab som har bidragit till optimering av detta protokoll genom åren, och till Gina Schatteman vars uthållighet i att främja användningen av seriell snittning för såranalys gjorde dess skapelse möjlig. Detta arbete stöddes av finansiering från NIH/NIAMS till Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine Models for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Crowe, M. J., Doetschman, T., Greenhalgh, D. G. Delayed wound healing in immunodeficient TGF-beta 1 knockout mice. Journal of Investigative Dermatology. 115 (1), 3-11 (2000).
- Pietramaggiori, G., et al. Improved cutaneous healing in diabetic mice exposed to healthy peripheral circulation. Journal of Investigative Dermatology. 129 (9), 2265-2274 (2009).
- Cold Spring Harbor. Paraformaldehyde in PBS. Cold Spring Harbor Protocols. 1 (1), (2006).
- Gerharz, M., et al. Morphometric analysis of murine skin wound healing: standardization of experimental procedures and impact of an advanced multitissue array technique. Wound Repair Regeneration. 15 (1), 105-112 (2007).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair Regeneration. 14 (1), 81-90 (2006).
- Le, M., et al. Transforming growth factor beta 3 is required for proper excisional wound repair in vivo. PLoS One. 7 (10), 48040 (2012).
- Sato, T., Yamamoto, M., Shimosato, T., Klinman, D. M. Accelerated wound healing mediated by activation of Toll-like receptor 9. Wound Repair Regeneration. 18 (6), 586-593 (2010).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair: a showcase for cell plasticity and migration. Current Opinion in Cell Biology. 42, 29-37 (2016).
- Hoffman, M., Monroe, D. M. Low intensity laser therapy speeds wound healing in hemophilia by enhancing platelet procoagulant activity. Wound Repair Regeneration. 20 (5), 770-777 (2012).
- Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
- Uchiyama, A., et al. SOX2 Epidermal Overexpression Promotes Cutaneous Wound Healing via Activation of EGFR/MEK/ERK Signaling Mediated by EGFR Ligands. Journal of Investigative Dermatology. 139 (8), 1809-1820 (2019).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Rhea, L., et al. Interferon regulatory factor 6 is required for proper wound healing in vivo. Developmental Dynamics. 249 (4), 509-522 (2020).
