Summary
이 프로토콜은 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 생성하는 방법과 이후에 형태 분석을 위해 상처를 모니터링, 수확 및 준비하는 방법을 설명합니다. 여기에는 직렬 조직학적 섹션을 사용하여 형태학적 결함을 정의하고 정확하게 정량화하고 감지하는 방법에 대한 심층적인 설명이 포함되어 있습니다.
Abstract
뮤린 절제 상처 모델은 염증, 증식 및 리모델링 : 상처 치유의 순차적으로 겹치는 각 단계를 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 뮤린 상처는 치유 과정의 이러한 다른 단계가 측정 할 수있는 조직학적으로 잘 정의되고 쉽게 인식 할 수있는 상처 침대를 가지고 있습니다. 필드 내에서 조직학적 분석을 위해 임의로 정의된 상처 "중간"을 사용하는 것이 일반적입니다. 그러나 상처는 3차원 실체이며 종종 조직학적으로 대칭적이지 않으며, 작은 효과 크기로 형태학적 결함을 검출하기 위해 잘 정의되고 견고한 정량화 방법의 필요성을 뒷받침한다. 이 프로토콜에서는 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 만드는 절차뿐만 아니라 일부 직렬 섹션에서 이미지 처리 프로그램을 사용하여 형태 매개 변수를 측정하는 방법에 대한 자세한 지침을 설명합니다. 상처 길이, 표피 길이, 표피 영역 및 상처 영역의 2차원 측정은 상처, 전체 상처 영역, 표피 부피 및 상처 부피를 포함하는 3 차원 표피 영역을 추정하기 위해 섹션 사이의 알려진 거리와 함께 사용됩니다. 이 상세한 조직학적 분석은 기존의 분석보다 시간과 자원이 더 많이 소비되지만, 그 엄격함은 본질적으로 복잡한 상처 치유 과정에서 새로운 표현형을 검출할 가능성을 증가시킵니다.
Introduction
피부 상처 치유는 순차적으로 겹치는 단계를 가진 복잡한 생물학적 과정입니다. 손상된 상피의 장벽 기능을 복원하기 위해 일시적이고 공간적으로 조절되는 세포 및 분자 공정의 조정이 필요합니다. 첫 번째 단계에서염증, 호중구 및 대식세포는 상처로 이동하여 국소 및 전신 방어1을동원합니다. 염증 단계를 따르고 겹치는 것은 증식 단계입니다. 섬유아세포는 급속히 확산되고 과립 조직으로 이동하기 시작합니다. 선두 가장자리에서 멀리 각질세포는 앞가장자리에서 분화된 각질 세포가 상처2를다시 상형화하기 위해 이동함에 따라 상처쪽으로 방향을 내다보며 증식한다. 마지막으로, 리모델링 및 성숙 단계가 시작되며, 그 동안 과립 조직의 섬유아세포는 콜라겐을 합성하고 퇴적시키기 시작합니다. 새 행렬의 리모델링 및 조직은 부상3다음에 최대 1년까지 지속될 수 있습니다. 때문에 다중 세포 모형 사이 교차 이야기와 관련시키는 중복한 사건의 복잡성 때문에, 그리고 수년간의 연구에도 불구하고, 상처 치유의 근본적인 세포 및 분자 기계장치의 많은 것은 제대로 이해되지 않습니다.
마우스 모델은 사용편의성, 상대적으로 저렴한 비용 및 유전적 매니풀성1,4,5로인한 상처 치유 메커니즘을 조사하기 위한 주요 포유류 모델이다. 다른 유형의 상처가 뮤린 모델에서 설명되었지만, 가장 흔한 상처는 절제적 상처 (양측 펀치 또는 직접 펀치 생검)이며 절개 상처 모델4가뒤따릅니다. 절제상처 모델은 본질적으로 치유 과정을 거치지 않은 대조군 조직을 생성하기 때문에 절개 모델에 비해 뚜렷한 이점이 있다. 외과 프로토콜의 일부로 절제되는 펀치 생검 조직은 상처입은 조직과 동일한 방식으로 처리될 수 있으며 원하는 기준을 위한 동종 성 조건을 확립하는 데 사용될 수 있다. 절제된 대조군 조직은 또한 피부 전처리의 효과를 평가하거나 부상 시 성공적인 유전자 변경을 확인하는 경우에 유용할 수 있다4.
치유 매개 변수는 평면도 또는 히스토로지를 포함한 다양한 기술에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 평면도는 상처의 가시적 특성만을 평가할 수 있으며, 딱지의 존재로 인해, 종종 히스토로지에 의해 시각화되는 치유의 측정과 상관관계가 없기 때문에, 따라서 히스토로지분석4의"금본위제"를 만든다. 조직학적 분석이 금본위제임에도 불구하고, 상처6,7의임의하위집합에서 가장 자주 수행됩니다. 예를 들어, 상처를 포함시키고 절단하기 전에 상처를 "절반"으로 절단하는 것은 현재 재료 및 데이터 분석에 소요되는 시간과 자원을 줄이는 일반적인 관행입니다. 본 프로토콜에 기재된 형태 분석 방법은 전체 상처 조직을 포괄하고, 상처의 형태학적 특성을 정확하게 반영하고, 작은 효과 크기로 상처 치유 결함을 검출할 가능성을 높이기 위해 개발되었다. 본 프로토콜에서, 우리는 가장 일반적으로 연구된 뮤린 상처, 양측 전체 두께 절제적 상처를 생성하기 위한 수술 방법뿐만 아니라, 조직학적 분석을 위한 상세하고 엄격한 방법을 현장에서 거의 사용되지 않습니다.
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Protocol
모든 실험은 연방 규정에 따라 완료되었으며 아이오와 대학 정책 및 절차는 아이오와 IACUC 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 동물과 축산
- 모낭 단계가 텔로겐에있을 때 8-10 주에 원하는 마우스 라인의 성인 마우스를 사용합니다.
- 수술 당일, 마우스를 깨끗한 케이지와 개별적으로 집에 분리하여 상처 장애를 최소화합니다.
2. 수술
참고: 멸균 수술 조건을 유지하는 것은 필요하지 않습니다. 동물 들 간의 멸균을 유지 하기 위해 주의 해야 하는 동안, 펀치 생검 자체는 깨끗 한, 하지만 비 멸균 표면에 이루어집니다. 동물당 수술 기간은 10분에서 15분 사이입니다.
- 마취
- 이소플루란 기화기가 분당 1리터로 설정된 이소플루란 기화기와 함께 유도 챔버에서 1-2분 동안 동물을 마취한다. 대체 마취 옵션에 대한 토론을 참조하십시오.
- 절차를 시작하기 전에 적절한 마취를 확인합니다. 마취의 깊이는 단단한 발가락 핀치에 의해 확인 될 수있다.
- 유도 용기에서 코 콘으로 마우스를 옮기고 이소플루란 유량을 1.5%로 줄이고 산소 유량계를 0.5L/min으로 줄입니다.
- 절차가 5 분 초과로 양쪽 눈에 안과 연고를 적용합니다.
- 열 패드를 사용하여 정상 체온을 유지합니다.
- 상처 부위 준비
- 코달 로스트랄 모션에 전기 면도기 클리퍼를 사용하여 어깨 수준에서 마우스 뒷면의 털을 제거합니다. 두 개 이상의 상처를 수행하는 경우 필요에 따라 뒤쪽의 머리카락을 낮게 제거합니다.
- 마우스 뒤쪽으로부터 20°에서 유지된 로스트랄 코골 모션에서 면도날을 사용하여 나머지 모발을 제거하여 잘린부위(그림 1A)를밀접하게 면도합니다.
- 면도 부위를 포비도네 요오드 면봉으로 청소하십시오.
- 멸균 70% 이소프로필 알코올 준비 패드로 피부를 닦아 요오드 면봉으로 인한 잠재적인 피부 자극을 줄입니다.
- 부상
- 등대 중진선을 따라 견갑골 사이의 피부를 꼬집어 몸에서 끼어 넣은 스킨폴드를 당깁니다(그림1B).
- 깨끗한 종이 기반 타월 또는 동등한 로 드레이프 평평한 표면에 스킨 폴드와 측면에 마우스를 배치합니다. 수건 아래에 치과 왁스 시트를 사용하여 기본 표면을 손상으로부터 보호하십시오(그림 1C).
- 원하는 크기의 생검 펀치를 가능한 한 신체에 가깝게 놓고 피부가 휴식을 취할 수 있도록 하십시오. 피부를 스트레칭하지 마십시오, 또는 상처 크기는 지정된 펀치 크기(도 1D)보다큽니다.
- 아래로 눌러 피부를 펀치, 흔들 운동은 양쪽에 피부의 모든 층이 침투되었는지 확인하는 데 사용될 수있다(도 1E). 각 동물에 대 한 새로운 생검 펀치를 사용 하 여.
- 상처에서 펀치 생검을 제거합니다(그림1F). 부착 부위가 여전히 있는 경우 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 주변 피부로부터 펀치를 풀어주세요. 상처 치유 분석을 위한 다운스트림 계획에 따라 필요에 따라 펀치 생검 제어 조직을 처리합니다(제안에 대한 토론 참조).
- 초기 상처 부위를 측정하고 분석에서 이상값을 제거하기 위해 상처 부위또는 프레임의 눈금자와 동일한 거리에서 매크로 사진을 찍습니다.
- 승인된 동물 프로토콜에 따라 최소 24시간 동안 진통을 투여한다. 예를 들면: Buprenorphine SR-LAB, 통증 완화의 48 h에 대 한 0.5-2 mg/kg에서 피하 로 주사 (대체 제안 및 고려 사항에 대 한 토론 참조).
- 그것은 똑바로 자세를 유지하고 케이지 주위에 정상적으로 걷고 될 때까지 마취에서 나오는 마우스를 모니터링합니다.
3. 상처 후 모니터링
- 조사자가 결정하고 기관 프로토콜에 따라 실험 종점에 대해 매일 마우스를 모니터링합니다. 예는 다음과 같습니다 : 감염, 눈에 보이는 체중 감소, 또는 구부러진 자세.
- 초기 수술 후 수행 된 것처럼 제어 방식으로 매일 매크로 사진을 촬영합니다.
4. 상처 수확
- 승인된 동물 프로토콜에 따라 원하는 시점에서 마우스를 재탄화하여 상처 후 후.
- 이전 사진수집(그림 2A, C)과일치하는 제어 방식으로 상처 부위의 매크로 사진을 촬영합니다.
- 메스(그림2D, E)를사용하여 상처 부위 주위의 넓은 직사각형을 잘라냅니다.
- 가위와 핀셋을 사용하여 직사각형 조직을 풀어 서 껍질을 벗기고 기본 조직(그림 2F)에서 피부를 잘라냅니다. 페트리 접시에 놓습니다(그림 2G).
- 상처를 수확하십시오. 직사각형 모양으로 상처의 모든 면을 둘러싼 상처가없는 조직의 2mm까지 손질하십시오(그림 2H, I). 상처를 수확하는 대체 옵션에 대한 토론을 참조하십시오.
- 후속 연구에 필요한 상처를 처리합니다. 파라핀 포함 및 조직학적 분석을 위해 마우스당 적어도 하나의 상처를 예약하십시오.
5. 상처 고정 및 포함
- 상처 수정
- 상처 조직을 4% 파라포름알데히드 용액8에서 실온에서 3시간 동안 수정한 다음 하룻밤 사이에 4°C로 옮겨. 전자 현미경 검사법(EM) 급파라포름알데히드 및 용액 여과가 필요하지 않습니다.
- 1x PBS에서 30분 동안 상처를 두 번 씻으시면 됩니다.
- PBS를 70% ETOH로 교체하고 포함될 때까지 4°C에 보관하십시오. 조직학적 특성을 평가하는 경우에만 항원 손실을 피하거나 1-2주 이내에 조직을 처리합니다.
- 상처를 처리하고 포함
- 각 상처를 포함 카세트로 옮기습니다. 이 과정에서 잉크를 제거할 수 있기 때문에 연필에 카세트를 포함시키는 라벨을 부착합니다.
- 조직을 수동으로 또는 자동화된 프로세서를 사용하여 에탄올 백분율이 증가하고 자일렌으로 클리어한 다음 파라핀 왁스(표1)로조직에 침투하여 조직을 처리합니다.
- 포함 금형의 수평 표면에서 상처 90 ° ("서")를 포함(도 3A, B).
6. 0일 차 감부 분석
- NIH-이미지 J 또는 NIH-피지 무료 소프트웨어 (https://imagej.net/Fiji/Downloads)를 다운로드합니다.
- 0일 차의 상처 사진이 있는 파일을 엽니다.
- "영역" 아래 "| 확인 측정값을 설정합니다.
- 분석 에서"설정 규모"를 선택합니다. 상대측정이 필요한 경우, 소거리에서, 알려진 해당 거리와 거리(= 길이 단위)의 단위(= 길이 단위)를 입력합니다.
- 피지 도구모음에서 "프리핸드 선택"을선택합니다.
- 상처의 둘레를 간략하게 설명합니다.
- 분석아래 측정값을 클릭합니다.
- 스프레드시트를 만들어 상처당 동물당 측정값을 추적합니다.
- 스프레드시트에서 상처 영역의 측정값을 복사합니다.
- 주어진 실험에 대한 모든 상처의 평균 영역과 표준 편차를 계산합니다.
- 조직학적 분석에서 평균의 두 가지 표준 편차 이외의 상처를 제외합니다.
7. 직렬 단면
- 파라핀에 내장된 상처 블록을 하룻밤 동안 4°C에서 식힙니다.
- 마이크로톤 및 오리엔드의 블록 홀더에 파라핀 블록을 삽입하여 블레이드가 블록을 가로질러 곧장 절단됩니다. 조직이 표피와 진피(도3C,D)의동시 단면을 허용하는 90°에서 조직이 "스탠드"되는 등의 블록을 방향을 지정합니다.
- 각각 7 μm의 20-30 파라핀 섹션의 2-4 리본을 만듭니다.
- 드라이 페인트 브러시와 해부 괴롭히는 바늘을 사용하여 각 리본을 단단한 검은 색 플라스틱 시트와 같은 단단하면서도 조작 가능한 표면으로 전송합니다.
- 각 리본의 상단 부분을 면도날로 분리하고 현미경 슬라이드에 놓습니다.
- 밝은 필드 현미경의 밑에 얼룩지지 않은 단면을 관찰하여 어떤 자가 부상당한 조직을 포함하고 있는지, 이는 모낭의 부재, 결합 조직 또는 표피의 출현 변화 및/또는 딱지의존재(도 4A,B)에의해 확인될 수 있다.
- 상처가 시작되기 전에 최대 20개의 단면에 상처가 없는 부분을 버리십시오.
- 얼룩이 없는 섹션에서 상처가 발견되지 않을 때까지 7.3 및 7.4 단계를 반복하여 상처를 통해 단면.
8. 파라핀 섹션 장착
- 첫 번째리본(그림 3E)부터시작하여 면도날로 5개 섹션마다 별도의 파라핀 섹션이 있습니다.
- 슬라이드 번호와 모든 단면 번호가 있는 현미경 슬라이드라벨.
- 젖은 페인트 브러시로 5 개의 섹션의 그룹을 잡고 따뜻한 수조 (40-45 °C)의 물 표면에 띄워 서 평평하게하십시오.
- 라벨이 부착된 현미경슬라이드(그림 3F)중 하나를 사용하여 수조에서 5개의 섹션의 그룹을 선택하고 최대 24시간 동안 37°C의 슬라이드 워머 세트에 놓습니다.
- 슬라이드 를 슬라이드 상자에 똑바로 세워 보관합니다.
9. 조직학적 염색
- 8th 현미경 슬라이드(매40번째 파라핀 섹션에 해당)를 헤마톡슬린과 에오신을 함유한 염색 랙및 얼룩으로 옮겨보십시오.
10. 현미경 이미징
- 4배 의 객관적이고 디지털 획득 기능을 갖춘 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 이미지를 촬영하는 배율을 기록합니다.
- 각 스테인드 슬라이드의 상단 부분의 전체 상처를 이미지와 양쪽에 부상되지 않은 조직을 포함해야합니다. 상처가 단일 그림의 프레임보다 크면 여러 겹치는 사진을 찍습니다.
- 형태 분석에 대한 단면 번호를 포함하여 파일을 저장합니다. 동일한 상처의 사진을 겹치기 위해 a, b, c 등이 이어지는 단면 번호를 사용합니다.
11. 형태 분석
참고: 상처가 여러 장의 사진에 걸쳐 있는 경우 개별 사진에서 가져온 측정값을 합하여 스프레드시트에 기록할 상처 섹션당 미터법당 한 값을 얻습니다.
- 이미지 J에서 염색 된 상처 사진의 디지털 파일을 엽니 다. 분석을 위해 스티치 된 사진을 사용하지 마십시오. 축소된 중복 된 그림에서 측정을 수행하여 분리하고 그림에서 그림으로 측정을 선택할 랜드 마크를 찾아서 측정을 수행합니다.
- 스케일 및 측정 기본 설정을 설정합니다.
- 분석 에서"설정 규모"를 선택합니다. 픽셀의 거리, 알려진 해당 거리 및 거리 단위(= 길이 단위)로 거리를 입력합니다. 축척이 창에 나타나야 하며 이미지가 획득한 배율에 대응해야 합니다.
- "전역"란을 선택하여 열려 있는 각 이미지에 대해 배율을 동일하게 유지합니다.
- 이미지 J가 닫혀 다시 열릴 때마다 11.2.1에서 11.2.2단계를 반복합니다.
- "영역" 아래 "| 확인 측정값을 설정합니다.
- 상처 길이 측정
- 피지 도구모음에서 "프리핸드 선택"을선택합니다.
- 상처의 한쪽에 있는 부상되지 않은 조직의 마지막 모낭에서 시작하여 상처의 반대편에 있는 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭(그림4A, B)을측정합니다.
- 이 두 랜드마크에 도달하기 위해 진피 교차로를 따라 추적합니다. 표피가 전체 상처를 커버하지 않는 경우, 상처의 한쪽에 진피 접합을 따르고, 이동 혀는 과립 조직 또는 과립 조직과 딱지 사이의 접합의 우수한 측면을 따라 계속되는 경우 이동 혀에 도달 한 다음 마지막으로 다른 쪽에 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭(그림 4E,F).
- 분석 에서 측정을 클릭합니다. 측정 길이는 스케일에 설정된 것과 동일한 단위로 나타납니다.
- 측정을 추적하기 위해 스프레드시트를만듭니다(보조 표 1).
- 상처 길이를 스프레드시트에 복사합니다.
- 표피 길이 측정
- 표피가 전체 상처를 덮는 경우 표피 길이는 상처 길이와 동일합니다.
- "상처 길이" 측정값을 Excel 스프레드시트의 "표피 길이" 컬럼에 복사하고 11.5단계로 건너뜁니다.
- 표피가 전체 상처를 커버하지 않는 경우,"Freehand 선택"을선택하고 과립 조직과 제1 모낭 사이의 과립 조직 또는 딱지 사이의 접합의 우수한 측면에 따라 각 표피 선도 가장자리 사이의 거리를 측정(도 4C,D).
- 분석 에서 측정을 클릭합니다.
- 이 측정값을 상처 길이에서 빼고 Excel 스프레드시트의 "표피 길이"아래 의 수를 기록합니다.
- 표피가 전체 상처를 덮는 경우 표피 길이는 상처 길이와 동일합니다.
- 상처 부위 측정
- 피지 도구모음에서 "프리핸드 선택"을선택합니다.
- 상처의 한쪽에 있는 부상되지 않은 조직의 마지막 모낭에서 시작하여 상처의 반대편에 있는 부상되지 않은 조직의 첫 번째 모낭(그림4A, B, E, F)을측정합니다.
- 표피의 우수한 측면을 따라 추적 (딱지를 포함하지 않음) 또는 상처가 표피에 의해 완전히 덮여있지 않은 경우 과립 조직의 우수한 측면.
- 반대 모낭에 도달하면 그리고 지방 조직 이나 근육에 도달 할 때까지 과립 조직으로 모낭을 따라 수직으로 추적 계속. 과립 조직의 열등한 경계를 따라 상처의 반대쪽으로 가서 모낭을 따라 시작지점에 합류하여영역(도 4E,F)을닫는다.
- 분석 에서 측정을 클릭합니다.
- 상처 부위를 "측정된 상처 영역"아래 스프레드시트에 복사합니다.
- 표피 영역 측정
- 피지 도구모음에서 "프리핸드 선택"을선택합니다.
- 상처가 완전히 상형화된 경우:
- 표피의 우수한 측면을 따라 추적하여 반대 모낭에 도달할 때까지 피피와 진피(도4D)를거쳐 시작점으로 "반환"하여 영역을 완성한다.
- 분석 에서 측정을 클릭합니다.
- 표피 영역을 "측정된 표피 영역"에서 Excel 스프레드시트에 복사하고 11.7단계로 건너뜁니다.
- 상처가 완전히 상형화되지 않은 경우 :
- 표피의 우수한 측면을 따라 추적하여 앞가장자리까지 추적하고 데르모 표피 접합(도4C)에따라 시작점으로 돌아갑니다.
- 분석 에서 측정을 클릭합니다.
- 상처의 반대편에 있는 11.6.3.1 및 11.6.3.2단계를 반복한다.
- 분석에서 측정값을 클릭합니다.
- 11.6.3.2 및 11.6.3.4 단계에서 얻은 두 숫자를 합산하고 스프레드시트에서 "측정된 표피 영역"으로 결과를 입력합니다.
- 40단(8번째 슬라이드마다)마다 11.3~11.6단계를 반복합니다.
- 전체 상처의 표피 영역을 계산합니다.
- 스프레드시트 "표피 길이"에 새 열을 만듭니다.
- 마지막 단을 제외한 각 섹션에 대해 "표피 길이"의 수를 280으로 곱합니다(7 μm 두께 섹션 x 40 단면).
- 마지막 단면(단면도의 두께)에 대해 "표피 길이"의 수를 7로 곱합니다.
- 각 섹션에 대해 "계산된 표피 영역"의 값을 합하여 전체 상처의 표피 영역을 얻습니다.
- 상처 전체의 상처 부위를 계산합니다.
- 상처 길이 측정을 사용하여 11.8.1 ~ 11.8.4 단계를 반복합니다.
- 전체 상처의 표피 볼륨을 계산합니다.
- "측정된 표피 영역" 측정을 사용하여 11.8.1 ~ 11.8.4 단계를 반복합니다.
- 전체 상처의 상처 볼륨을 계산합니다.
- "측정된 상처 영역" 측정을 사용하여 11.8.1 ~ 11.8.4단계를 반복합니다.
- 상처의 표피 볼륨 비율을 계산합니다.
- 총 표피 볼륨을 총 상처 부피로 나누고 백분율을 얻기 위해 100으로 곱합니다(각 섹션에 대해 이 비율을 하지 마십시오).
- 상처 영역 중 표피 영역의 백분율을 계산합니다.
- 총 표피 영역을 총 상처 부위로 나누고 백분율을 얻기 위해 100으로 곱합니다. 상처가 완전히 상피되면이 숫자는 100이어야합니다.
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Representative Results
도 5는 여러 외과 의사에 의해 다른 마우스 균주에서 생성되고 다른 개인에 의해 분석된 야생형 상처에 대한 형태측정 분석을 수행하여 얻은 측정 및 계산된 값의 범위를 묘사합니다. 다른 균주에서 야생 형 마우스는 우리의 연구와 문학9,10에서모두 설명 된 통계적 차이를 표시 할 수 있습니다. 이러한 대표적인 결과에 기초하여, 우리는 한 연구 내에서 단 하나의 균주에서 마우스를 사용하는 것이 좋습니다. 우리는 동일 개별이 특정 연구 결과 내의 모든 상처를 능력을 발휘하는 것이 좋습니다 하더라도, 0일째에 상처의 지역이 개별의 일 사이에서 통계적으로 다르지 않는 한 다중 개별은 군의관으로 행동할 수 있었습니다. 마지막으로, 이 프로토콜에 설명된 형태 분석이 광범위할 수 있기 때문에 여러 개인이 동일한 실험의 일부를 분석할 수 있지만, 두 개의 샘플분석 결과가 서로의 5% 이내인 경우에만 분석할 수 있습니다. 그러나, 편견을 피하기 위해 맹목적인 방식으로 상처를 분석하는 단일 개인이 있는 것이 바람직하다.
도 6은 이 연구에서 기재된 프로토콜을 따르는 것으로 얻은 상처 측정을 비교하는 메타 분석을표시하고, 상처의 "중간"과 40개의 주변 구간에서 얻은 측정을 한다. 도 6A에서,표피 영역 및 상처 영역은 상처 부위의 표피 및 상처 길이의 측정에서 계산되었고 상처 부위 중 표피 영역의 백분율(때로는 "폐쇄비율" 또는 "상피화의 백분율"이라고도 함). 유사하게, 도 6B에서,상처내표피의 백분율은 상처 부피(측정된 상처 영역에서 계산된) 표피 부피의 비율(측정된 상처 영역에서 계산)의 비율로 얻어졌다. 두 매개 변수에 대해, 전체 상처의 분석은 그룹 간의 강한 통계적 차이를 보였다 (P & 0.001 단방향 아노바 다음). 그러나 중간에 40개 섹션만 분석되었을 때(편도 아노바에 이어 P<, 0.01까지) 중요성이 감소하였다. 이러한 결과는 상처의 하위 집합만 분석될 때 유의한 수준에 있는 감소를 보여줍니다. 이 데이터는 작은 효과 크기를 가진 결함이 전체 상처에 대한 형태 측정 분석을 수행 할 때만 검출 될 가능성이 있으며, 더 가벼운 상처 치유 표현형이 분석의 "상처의 중간"유형에서 누락 될 것이라고 제안합니다.
생체 내 상처 치유를 분석하기 위한 일반적인 관행은상처(12)의어딘가에 선택된 조직학적 부위에 상처 부위를 측정하는 것을 포함한다. 이를 염두에 두고, 전체 상처의 직렬 섹션에서 측정된 상처 영역의 평균은 중간 하위 집합 섹션에서 얻은 것과 비교되었다. 결과는 실험군과 분석방법(도 6C)사이에유의한 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 현재 프로토콜은 상처 부피를 계산하기 위해 전체 상처에 측정된 영역(도 6C에도시됨)을 사용합니다. 도 6D에도시된 바와 같이, 계산된 상처 부피(전체 상처의 분석을 통해서만 계산할 수 있음)는 실험군 간에 상당히 다르다. 요약하자면, 이러한 대표적인 결과는 전통적인 상처 치유 분석을 사용하여 놓친 표현형을 검출하기 위해 본 프로토콜에 기재된 상처 치유 파라미터의 심층적 조직학적 분석의 중요성을 입증한다.
그림 1: 양측 절제상처 시술. (A)수술 부위에서 모발을 클리핑하고 면도한 후 마우스의 대표적인 사진. (B)등간 미드라인을 따라 견갑골 사이에 꼬집힌 피부. (C)마우스가 옆으로 위치하고 피부폴드가 평평하게 놓여 있습니다. (D)생검 펀치 배치의 표현. (E)펀치 스킨폴드. (F)0일째에 두 개의 양측 상처를 가진 마우스와 백색 화살에 의해 표시된 대로 절제된 펀치 생검 대조군 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 상처 수확 절차. (A-C) 4일(A),7일(B) 및 11일(C) 후6mm 절제된상처의 매크로 사진. (D-E) 메스 블레이드를 사용하면 상처와 주변의 상처조직을 포함하는 넓은 사각형 모양으로 상처 절개가 만들어졌습니다. (F)피부는 집게와 가위를 가진 기본 조직에서 풀어 놓였습니다. (G)수확된 양측 의 상처의 표현. (H)점선 백색선은 펀치 생검을 사용한 후 수확될 조직의 경계를 나타낸다(이 방법은 수확된 조직의 표준화된 양을 허용한다). (I)점선 흰색 선은 조직학을 위해 손질될 조직의 경계를 나타낸다(직사각형 모양은 쉽게 포함할 수 있음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 | 시간(분) | 온도 (섭씨) | 압력(kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 95% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 100% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 자일렌 (동음이의) | 30 | Rt | N/A |
| 자일렌 (동음이의) | 30 | Rt | N/A |
| 파라핀 | 30 | 60 | 20 |
| 파라핀 | 30 | 60 | 20 |
표 1: 파라핀 포함시 샘플 처리 절차. RT = 실온. N/A = 적용할 수 없습니다.
그림 3: 상처 포함 및 단면. (A)파라핀 가공 상처는 내장 금형에 평평하게 누워 있습니다. (B)감은 몰드의 수평 표면으로부터 90°("스탠딩")로 포함되었다. (C)파라핀 임베디드 상처는 미세토메에 장착된 단면(D) 파라핀 블록을 백색 브래킷에 의해 표시된 대로 5단 단위로 절단된 약 20개의 섹션(E) 파라핀 리본으로 절개하였다. (F)시리얼 섹션은 따뜻한 수조 (40-45 °C)에 평평하게 놓인 현미경 슬라이드에 장착되었다. 만화(A-C)는각 단계에 대한 표피 (e)와 진피 (d)의 적절한 방향과 함께 피부 (파란색)의 상처 (주황색)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 상처의 조직학적 특성과 형태 매개 변수의 그림입니다. (A, B) 하루 4(A)및 일 7(B)6 mm 상처의 조직학적 특징. (C-F) 정량적 형태 분석을 수행하는 데 사용되는 상이한 측정값의 표현: 표피의길이(C, D,점선 검정선), 표피의 측정 영역(C, D,황색 그늘진 영역), 상처길이(E, F,점선 황선) 및 전체 상처의 측정영역(E, F,회색 그늘이 있는 영역). HF = 모낭; 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 4일째, 7일째, 11일째에 대표적인 6mm 야생형 상처의 형태학적 특성. 흩어진 플롯은 여러 외과 의사에 의해 다른 마우스 긴장에서 생성되고 다른 개별에 의해 분석된 6mm 야생형 상처의 형태측정 분석에서 얻은 데이터를 나타냅니다. (A)상처 부피,(B)표피 부피,(C)상처내표피의 백분율,(D)상처 영역(계산),(E)표피 영역(계산), 및(F)상처 영역 중 표피 영역의 백분율은 형태측정값의 변동 범위를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 상처의 중간과 전체 상처에서 얻은 매개 변수를 비교하는 메타 분석은 더 높은 중요성을 가진 새로운 결함을 식별합니다. 상처 치유 morphometry는 식염수 (대조군)로 주입된 7일째 상처, 성장 인자 베타 3(Tgfb3), Tgfb3를 중화 항체(Tgfb3 + NAB) 및 단독으로 중화(NAB)로 수행하였다. 측정은 연쇄 단면 상처("전체") 또는 상처 의 중간("중간")에서 40개의 섹션에서 수행되었으며 상처부위(A),상처(B)의표피 비율 및 상처 부피(D)를 통해 표피 영역의 백분율을 계산하는 데 사용하였다. (C)는상처의 전체 또는 중간에 측정된 상처 영역의 평균을 나타낸다. * P < 0.05, ** P & 0.01, *** P & 0.001, ns = 중요하지 않은, 편도 아노바). 이 그림은 Le 외11의데이터를 사용하여 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 형태 측정을 기록하기 위한 스프레드시트의 예입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
양측 절제 상처 모델은 상처 치유의 많은 다른 측면을 연구하는 데 사용할 수있는 매우 사용자 정의 절차입니다. 상처 치유 프로젝트를 시작하기 전에 조사관은 특정 효과 크기의 결함을 감지하는 데 필요한 상처 수를 결정하기 위해 전력 분석을 수행해야합니다. 개별 마우스 또는 상처가 생물학적 복제로 사용되어야 하는지에 대한 문헌 내에 불일치가 존재하지만, 최근 연구에 따르면 단일 동물4에대한 두 상처 사이에 는 유의한 상관관계가 없는 것으로 나타났다. 이것은 단 하나 동물에게서 상처가 서로 독립적이고 결점을 검출하는 데 필요한 마우스의 수를 감소시키는 생물학 복제로 간주될 수 있다는 것을 건의합니다. 이는 중성4에도달하기 위해 많은 수의 상처가 필요한 작은 효과 크기를 고려할 때 관련이 있습니다. 또한, 전력 계산의 결과는 동물 당 2 및 4 개의 상처가 가장 일반적인 각 동물에 수행되는 상처 수에 영향을 미칠 수 있습니다.
외과 프로토콜 자체는 또한 매우 유연합니다. 짧은 절차 길이와 빠른 회복(마우스당 10-15분)으로 인해 이소플루란 기화기에 의한 마취를 권장하지만, 기화기에 접근하지 않은 조사관은 케타민/자일라진 또는 펜토바르비탈을 포함한 주사용 마취를 사용할 수 있습니다. 적절한 진통제의 선택은 상처 치유의 염증 단계에 관련되기 때문에 특히 중요합니다. 플루니신 메글루민이나 멜록시캄과 같은 비스테로이드성 항염증제(NSAIDS)의 사용은 염증을 감소시킬 수 있기 때문에 주의해서 사용되어야 한다. 오피오이드는, 그러므로, 염증이 조사되고 있는 연구 결과에서 선호됩니다. 우리는 진통제를 권장합니다 (예를 들어, 부프레노르핀 지속 릴리스) 이는 최대 제공 48 진통의 시간 반복에 대한 필요성을 제거, 추가 용량. 모든 외과 적 절차는 연방 지침에 따라 실행되어야하며 승인 된 동물 프로토콜에 의해 지원되어야합니다.
상처 치유는 여러 단계를 포괄하는 과정으로, 각각은 별개의 세포 유형3을포함하는 상이한 생물학적 과정을 특징으로 한다. 염증단계는 0일과 5일 사이에 발생하며, 다형성핵 호중구(PMN)와 대식세포의 조기 이동을 상해 부위로13일사이에 이동한다. 증식 단계는상처(14)의크기에 따라 다양한 시간을 취하는 재상피화로 3일에서 14일 사이에 발생한다. 이 프로토콜에서, 우리는 6mm 생검 펀치를 사용하고 대부분의 상처는 7 일까지 다시 상형화되었다. 그러나 이 기간은 작은 펀치를 사용하는 경우 단축해야 합니다(1mm만큼 작을 수 있음). 이전 시간점과 함께, 이러한 작은 상처는 조직학분석(15)의양을 줄이는 것이 바람직할 수 있다. 마지막으로, 리모델링 및 성숙 단계는 부상 후 7 일 및 최대 1 년 후 발생16. 이러한 후기 시점은 상처의 성숙을 조사하거나 실험 동물의 상처 치유 지연을 조사하기 위해 필요할 수 있습니다. 따라서, 조사관은 그들의 특정 가설에 근거를 둔 상처 치유의 특정 단계를 조사하는 데 필요한 중요한 시간 점을 결정해야합니다5.
상처 치유의 분석은 종종 조직학적 분석에 국한되지 않습니다. 얼룩이 없는 파라핀 섹션은 콜라겐 증착을 위한 면역 불면 또는 Masson의 삼색과 같은 추가 분석에 사용될 수 있습니다. 제어 조직 (펀치 생검)과 조직의 수확 단계는 모두 조직학적 분석 외에도 상처 치유가 어떻게 평가되는지에 달려 있습니다. 외과 프로토콜의 일환으로, 펀치 생검은 절제된 상처를 생성하기 위하여 제거됩니다. 이러한 펀치는 단백질 (서양 또는 사이토카인 프로파일링), DNA 또는 RNA 추출과 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대한 상처없는 제어 조직역할을 할 수 있으며 그에 따라 처리되어야합니다. 특히 상처 전에 피부가 치료되는 경우(예를 들어, Cre-Lox 재조합17의유도를 위한 타목시펜의 적용)에 조직학적 분석을 위해 하나 이상의 펀치를 저장하는 것이 좋습니다. 펀치의 검사는 피부 형태에 대한 치료의 효과를 결정하거나 단순히 사용되는 특정 마우스 모델의 기준선 피부 형태의 평가를 허용할 수 있습니다. 공장학에 사용되지 않는 상처는 상처의 크기를 포괄하는 펀치 생검으로 수확 할 수 있습니다. 이 절차는 상처 크기에 관계없이 동일한 양의 조직을 수확하는 것을 포함하여 몇 가지 장점이 있습니다 (큰 상처는 주변이 덜 건강한 조직을 가지고 있습니다). 마지막으로, 우리는 4% 파라포름알데히드의 사용을 각각 조직을 보존하고 포함시키는 재료로 고정 및 파라핀으로 설명합니다. 특정 응용 프로그램에는 다른 고정제가 필요할 수 있으며 대체 할 수 있습니다 (예 : Carnoy's 또는 부인의 고정). 최적의 면역형광 염색을 위해 최적의 절삭 온도 화합물에 상처의 동결 및 포함을 위해 냉동 단면이 선택되는 방법이 남아 있습니다.
상처 입은 조직의 단면은 딱지의 존재 때문에 많은 도전, 특히 일 4 상처를 제시할 수 있습니다. 고품질 섹션을 생성하려면 마이크로톤의 모든 부분이 단단히 고정되고, 블록 홀더가 초기 위치로 후퇴하고, 블레이드 홀더가 0과 10° 사이에 설정되고 블레이드가 단단히 고정되어 있지만 과도하게 조여지지 않았는지 확인하는 것이 좋습니다. 파라핀 블록은 차가워지지만 조직은 여전히 분쇄 될 수 있습니다. 파쇄가 계속되면, 얼음 조각은 여전히 장착하는 동안 5 분 동안 블록에 배치 할 수 있습니다. 단면이 시작되면 파라핀 섹션의 손실을 방지하기 위해 마이크로 토메에서 블록을 제거하는 것이 좋습니다. 잃어버린 파라핀 섹션, 그들의 숫자와 직렬 단면에서 순위를 모두 기록하는 것이 필수적입니다. 이는 형태 분석에 영향을 미치며 고려해야 합니다. 단면을 시작하면, 얼룩이 없는 부분에 상처입은 조직의 식별이 어려울 수 있습니다, 특히 조직학에 익숙하지 않은 경우. 의심할 때, 그것은 보수적이고 조직을 포함하는 모든 단면도를 유지하는 것이 좋습니다. 조직학적 얼룩이 수행되면 조직 조직이 더 분명해지고 상처가 더 뚜렷해질 것입니다. 때때로, 모낭은 명확하게 보이지 않을 수 있습니다 또는 상처 가장자리에서 멀리 있을 수 있습니다. 이 경우, 상처입은 조직의 다른 주요 특성은 결합 조직의 조직에 표피 두께및 날카로운 변화의 즉각적인 감소에 이어 갑작스런 증가를 포함하여 상처의 경계를 확립하는 데 사용될수있다(도 4A-B).
디지털 이미징은 형태 분석에서 중요한 단계입니다. 형태 분석은 반복되는 측정을 피하기 위해 각 이미지의 랜드마크를 사용하여 개별 이미지에서 수행해야 합니다. 그러나 디지털 소프트웨어를 사용하여 모든 프레임을 함께 스티치하고 단일 이미지에서 분석을 수행할 수 있습니다. 처음에는 쉽게 보이지만 큰 이미지를 조작하면 분석 프로세스가 느려질 수 있습니다. 섹션의 선택은 분석에도 중요합니다. 8th 슬라이드의 상단 섹션을 디지털 방식으로 획득하는 것이 좋습니다만 섹션의 품질에 우선 순위를 지정해야 하며 해당 슬라이드의 5개 섹션 중 최고를 이미지화해야 합니다. 접힌 면적/길이를 추정하여 접힌 부분이 작은 부분을 분석할 수 있습니다. 해당 특정 섹션의 수는 디지털 파일과 Excel 스프레드시트 모두에서 기록되어야 하므로 이전 섹션과 다음 분석된 섹션 사이의 거리를 그에 따라 조정할 수 있습니다.
상처 상처는 매년18년 이상 250억 달러 이상의 비용이 드는 치료를 받는 약 650만 명에게 영향을 미치며 당뇨병과 비만을 포함한 많은 다른 건강 문제에 이차적인 것 외에도 외과 적 수술의 내재된 구성 요소입니다. 마우스는 종종 인간 장애에 비해 미묘한 표현형을 전시에도 불구하고, 그것의 게놈을 조작에 있는 용이성 때문에 인간적인 질병을 공부하는 편리한 모형으로 이용되었습니다. 본 프로토콜에 기재된 양측 절제적 상처 모델 및 후속 형태 분석은 본질적으로 복잡한 상처 치유과정(19)에서사소한 결함을 검출하는 데 어려움을 해결하는 능력 때문에 유의하다. 감도가 높아지고 가변성이 감소하기 때문에 이 프로토콜은 동일한 실험 감도를 얻기 위해 더 적은 동물을 사용할 수 있는 기회를 제공합니다. 프로토콜은 매우 사용자 정의 하 고 조직 복구의 모든 단계를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다. 조직의 현상 특성 특성과 함께 상세한 조직 학적 형태 분석은 조직 수리를 변조하는 중요한 요인의 이해를 증진하는 데 필요한 지식을 증가시킬 수있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 수년에 걸쳐이 프로토콜의 최적화에 기여 한 던발트 연구소의 모든 구성원과 상처 분석을위한 직렬 단면의 사용을 촉진하는 지속성 지나 샤테만에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH /NIAMS에서 마틴 던발트 (AR067739)에 대한 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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