Summary
このプロトコルは、マウスで両側の完全な厚さの切除傷を生成する方法と、その後、形態測定分析のために創傷を監視、収穫、および準備する方法を記述する。これには、シリアル組織学的セクションを使用して形態異常を定義、正確に定量化、検出する方法の詳細な説明が含まれています。
Abstract
マウスの外皮創傷モデルは、創傷治癒の順次重なり合う相(炎症、増殖および改造)のそれぞれを研究するために広く使用されてきた。マウスの創傷は、治癒プロセスのこれらの異なる段階が測定可能である組織学的に明確かつ容易に認識可能な創傷床を有する。フィールド内では、組織学的分析のために任意に定義された創傷の「中間」を使用することが一般的です。しかし、創傷は三次元の実体であり、しばしば組織学的に対称的ではなく、小さな効果サイズで形態異常を検出するための明確かつ堅牢な定量方法の必要性を支持する。本プロトコルでは、マウスにおける二国間の全厚切除創傷を作成するための手順と、選択したシリアルセクションの画像処理プログラムを用いて形態測定パラメータを測定する方法についての詳細な指示を説明する。創傷長さ、表皮長さ、表皮領域、および創傷領域の2次元測定は、創傷、全体的な創傷領域、表皮容積および創傷容積を覆う3次元表皮領域を外挿するために、断面間の既知の距離と組み合わせて使用される。この詳細な組織学的分析は、従来の分析よりも時間とリソースの消費が多いが、その厳格さは、本質的に複雑な創傷治癒プロセスで新しい型を検出する可能性を高める。
Introduction
皮創傷治癒は、連続的に重なる相を有する複雑な生物学的プロセスである。損傷した上皮のバリア機能を回復させるためには、時間的および空間的に調節される細胞および分子プロセスの調整が必要です。第1段階では、炎症、好中球およびマクロファージが創傷に移行し、局所防御および全身防御を動員する。炎症期に続いて重なり合うのが増殖段階である。線維芽細胞は急速に増殖し、造粒組織に移行し始める。先導端から離れた角化細胞は、前縁の分化された角化細胞が創傷2を再上皮化するために移行するとして、創傷に向かって方向に増殖する。最後に、造粒組織の線維芽細胞がコラーゲンを合成して沈着し始める間に、再造形および成熟相が始まる。新しいマトリックスの改造と組織は、怪我の後に1年まで続くことができます 3.複数の細胞タイプ間のクロストークを伴う重複する事象の複雑さにより、長年の研究にもかかわらず、創傷治癒の根底にある細胞および分子メカニズムの多くは十分に理解されていない。
マウスモデルは、使用の容易さ、比較的低コスト、遺伝的操作性1、4、5による創傷治癒のメカニズムを調査するための主要な哺乳類モデルである。マウスモデルには異なるタイプの創傷が記載されているが、最も一般的なのは切除創傷(両側性パンチまたは直接パンチ生検のいずれか)であり、続いて切開創傷モデル4が続く。切除創傷モデルは、癒しのプロセスを経ていない制御組織を本質的に生成するため、切開モデルに対して明確な利点があります。外科プロトコルの一部として切除されるパンチ生検組織は、傷ついた組織と同様に処理し、所望の基準のための恒食状態を確立するために使用することができる。切除された対照組織は、皮膚前処理の効果を評価する場合や、傷害時に遺伝子改変が成功したことを確認する場合にも有用である。
治癒パラメータは、平面測定やヒストロジーを含む多くの異なる技術によって評価することができる。しかし、プラニメトリーは創傷の目に見える特性しか評価できないし、また、かさぶたの存在のために、しばしば、占いが可視化される治癒の測定値と相関しない、それによって、構造学を分析4の「ゴールドスタンダード」にする。組織学的分析はゴールドスタンダードであるにもかかわらず、最も頻繁に創傷の任意のサブセット6,7で行われる。例えば、創傷を埋め込み、切断する前に「半分」に創傷を切断することは、材料の切断およびデータ分析に費やされる時間とリソースを削減するために現在一般的な習慣である。このプロトコルに記載された形態測定解析の方法は、創傷組織全体を包含し、創傷の形態学的特徴を正確に反映し、小さな効果サイズで創傷治癒欠陥を検出する可能性を高めるために開発された。このプロトコルでは、最も一般的に研究されているマウス創傷、両側の完全な厚さの切除傷を生成するための外科的方法、ならびにそのような組織学的分析のための詳細かつ厳格な方法が現場ではほとんど使用されない。
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Protocol
すべての実験は連邦規制に従って完了し、アイオワ大学の方針と手順はアイオワ大学IACUCによって承認されています。
1. 動物と畜産
- 毛包ステージが四葉語にある8〜10週齢で所望のマウスラインの成体マウスを使用する。
- 手術当日は、マウスを清潔なケージに分離し、創傷の破壊を最小限に抑えるために個別に収容します。
2. 手術
注:無菌の手術状態を維持する必要はありません。動物間の無菌性を維持するために注意する必要がありますが、パンチ生検自体は清潔ですが、無菌表面で行われます。動物1匹あたりの手術期間は10〜15分です。
- 麻酔
- イオフルラン気化器を4~5%の流量に設定し、酸素流量計を毎分1リットルに設定して、誘導室で1〜2分間動物を麻酔します。代替麻酔オプションについては 、「議論」 を参照してください。
- 手順を開始する前に、適切な麻酔を確認してください。麻酔の深さは、しっかりとしたつま先ピンチによって確認することができます。
- 誘導容器から鼻コーンにマウスを移し、イオブルランの流量を1.5%に、酸素流量計を0.5 L/分に下げます。
- 処置が5分を超えるので両眼に眼科軟膏を適用する。
- サーマルパッドを使用して、常温を維持します。
- 創傷部位の準備
- 肩のレベルでマウスの背面の毛皮を取り除くために尾のrostralの動きで電気カミソリのクリッパーを使用してください。2つ以上の傷を行う場合は、必要に応じて背中の下の髪を削除します。
- 残りの髪を取り除くために、マウスの後ろから20°で保持されたロストラルの尾骨運動でカミソリの刃を使用して、クリップされた領域を密接に剃ります(図1A)。
- ポビドネヨウ素綿棒で剃った領域をきれいにします。
- ヨウ素綿棒からの潜在的な皮膚刺激を減らすために無菌70%イソプロピルアルコール準備パッドで皮膚を拭きます。
- 負傷
- 背背の中線に沿って肩甲骨の間の皮膚をつまみ、サンドイッチされたスキンフォールドを体から引き離す(図1B)。
- 清潔なペーパーベースのタオルまたは同等物でドレープされた平らな表面にスキンフォールドを置いて、マウスを横に置きます。タオルの下に歯科用ワックスを使用して、下地の表面を損傷から保護します(図1C)。
- 所望の大きさの生検パンチをできるだけ体の近くに置き、皮膚をリラックスさせます。皮膚を伸ばさないか、または創傷のサイズが指定されたパンチサイズより大きくなる(図1D)。
- 下押しで皮膚をパンチし、両側の皮膚のすべての層が貫通していることを確認するために揺れる動きを使用してもよい(図1E)。各動物のための新しい生検パンチを使用してください。
- 傷口からパンチ生検を取り除く(図1F)。まだ取り付けのサイトがある場合は、周囲の皮膚からパンチを解放するために滅菌はさみやピンセットを使用してください。創傷治癒解析の下流計画に基づいて、必要に応じてパンチ生検制御組織を処理する(提案については 、議論 を参照)。
- 最初の創傷領域を測定し、外れ値を解析から排除するために、同じ距離から創傷部位またはフレーム内の定規で巨視的な写真を撮ります。
- 承認された動物のプロトコルに従って、最低24時間の鎮痛を投与する。例えば:ブプレノルフィンSR-LABは、痛みの軽減の48時間のために0.5-2 mg /kgで皮下に単回投与として注射される(代替提案および考慮事項のための 議論 を参照)。
- 直立姿勢を維持し、ケージの周りを正常に歩いているまで、麻酔から出てくるようにマウスを監視します。
3. ポスト創傷モニタリング
- 研究者によって決定された実験エンドポイント、および機関プロトコルに従って準拠している実験エンドポイントについて、マウスを毎日監視します。例としては、感染、目に見える体重減少、またはハンチ姿勢が含まれます。
- 最初の手術後に行われたように、制御された方法で毎日の巨視写真を撮ります。
4. 創傷の収穫
- 承認された動物プロトコルに従って、目的の時点でマウスを創傷後に安楽死させる。
- 以前の写真取得と一致する制御された方法で創傷部位の巨視的な写真を撮る(図2A,C)。
- メスを使用して創傷部位の周りに広い長方形をカットします(図2D,E)。
- はさみとピンセットを使用して長方形の組織を解放し、下の組織から皮膚を切り離します(図2F)。ペトリ皿に入れる(図2G)。
- 傷を収穫する。傷口の全側面を囲む傷のない組織を2mmまで長方形の形で切り下げる(図2H,I)。傷を収穫するための代替オプションについては 、「ディスカッション 」を参照してください。
- その後の研究のために必要に応じて創傷を処理します。パラフィン埋め込みおよび組織学的分析のために、マウス1匹につき少なくとも1つの傷を予約する。
5. 創傷の固定および埋め込み
- 傷を固定する
- 創傷組織を室温で3時間に対して調製した4%パラホルムアルデヒド溶液8 に固定し、一晩で4°Cに移す。電子顕微鏡(EM)グレードのパラホルムアルデヒドおよび溶液ろ過は必要ありません。
- 1x PBSで30分間傷口を2回洗います。
- 70%ETOHでPBSを交換し、埋め込みになるまで4°Cで保管してください。組織組織を24~48時間以内に処理して、抗原の損失を回避するか、組織学的特徴を評価するだけであれば1〜2週間以内に組織を処理します。
- 創傷を処理し、埋め込む
- 各創傷を埋め込みカセットに移します。プロセスとして鉛筆にカセットを埋め込むラベルは、インクを削除します。
- エタノールの割合を増やして組織を脱水し、キシレンでクリアし、次にパラフィンワックスで組織に浸透させることによって、組織を手動でまたは自動化されたプロセッサを使用して組織を処理する(表1)。
- 埋め込み型の水平面から創傷を90°(「立っている」)埋め込む(図3A,B)。
6. 0日目の創傷面積解析
- NIHイメージJまたはNIHフィジーのフリーソフトウェア(https://imagej.net/Fiji/Downloads)をダウンロードしてください。
- 0日目の傷の写真を含むファイルを開きます。
- [分析] の下の [領域] のチェック ボックスをオンに |測定を設定する。
- [分析] の下の[ スケールの設定] を選択します。距離をピクセル単位で入力し、距離の既知の距離と距離の単位(長さの単位)を入力します (距離の単位) 相対測定値のみがスタディの一部である場合、このステップをスキップします。
- フィジーのツールバーの [フリーハンドの選択] を選択します。
- 傷の周囲を輪郭を描きます。
- [分析] の下の [測定]をクリックします。
- 傷1つにつき動物ごとの測定値を追跡するためのスプレッドシートを作成します。
- スプレッドシート内の傷領域の寸法をコピーします。
- 特定の実験の全創傷の平均面積と標準偏差を計算します。
- 組織学的分析から平均の2つの標準偏差の外の傷を除外する。
7. シリアル切り分け
- パラフィン埋め込み創傷ブロックを一晩4°Cで冷やします。
- ミクロトームのブロックホルダーにパラフィンブロックを挿入し、ブレードがブロックを横切ってまっすぐ切るように配向します。組織が90°で「立っている」ようなブロックの向きをして、表皮と真皮の同時断面化を可能にする(図3C,D)。
- 2~4個のパラフィンセクションをそれぞれ7μmで作ります。
- 乾燥したペイントブラシと解剖用のからかい針を使用して、各リボンをしっかりとした黒いプラスチックシートなどの堅固で操作可能な表面に移します。
- 各リボンの上部をカミソリの刃で外し、顕微鏡スライドに置きます。
- 明視野顕微鏡下で染色されていない部分を観察して、毛包の不在、結合組織または表皮の外観の変化、および/またはかさぶたの存在によって特定することができる傷ついた組織が含まれている部分を決定する(図4A,B)。
- 傷の開始前に20のセクションまで傷ついていないセクションを捨てます。
- 汚れのない部分で傷が検出されないまで、ステップ7.3と7.4を繰り返すことによって創傷を通して切り離す。
8. パラフィンセクションの取り付け
- 最初のリボン(図3E)から始めて、5つのセクションごとにパラフィンセクションをカミソリブレードで分けます。
- ラベル顕微鏡は、スライド番号とすべてのセクション番号の両方でスライドします。
- ぬれたペンキのブラシで5つのセクションのグループをつかみ、それらを平らにするために暖かい水浴(40-45 °C)の水の表面にそれらを浮かべる。
- ラベル付き顕微鏡スライド(図3F)のいずれかを使用して、ウォーターバスから5つのセクションのグループを選び、最大24時間37°Cに設定されたスライドウォーマーの上に置きます。
- スライドをスライド ボックスに直立して保存します。
9. 組織学的染色
- 8番目 の顕微鏡スライド(40番目 のパラフィンセクションに相当)を、ヘマトキシリンとエオシンで染色ラックと汚れに移します。
10. 顕微鏡イメージング
- 4倍の目的とデジタル取得機能を備えた明るい視野顕微鏡を使用して画像を取得します。画像が撮影されるスケールを記録します。
- 各染色スライドの上部セクションの傷全体を画像化し、両側にいくつかの傷のない組織を含むようにしてください。傷が 1 つの画像の枠よりも大きい場合は、重なり合う複数の画像を撮影します。
- モルフォメトリクス解析の断面番号を含むファイルを保存します。同じ傷の重なり合う写真には、セクション番号の後にa、b、cなどを使用します。
11. モルフォメトリック解析
メモ: 傷が複数の画像にまたがっている場合は、個々の写真から取得した測定値を合計して、スプレッドシートに記録する傷部分ごとにメートル単位ごとに 1 つの値 を取得します。
- イメージ J で、汚れた傷の画像のデジタル ファイルを開きます。ステッチされた画像を解析に使用しないでください。ズームイン重なり合う画像の測定を行うには、画像から画像までの測定値を取得するランドマークを見つせます。
- スケールと測定の設定を行います。
- [分析] の下の[ スケールの設定] を選択します。距離をピクセル単位で、既知の対応する距離と距離の単位 (長さの単位) を入力します。スケールはウィンドウに表示され、画像が取得された縮尺に対応している必要があります。
- 開いているイメージごとにスケールを同じに保つには、[グローバル] チェック ボックスをオンにします。
- イメージ J を閉じて再び開くたびに、手順 11.2.1 ~ 11.2.2 を繰り返します。
- [分析] の下の [領域] のチェック ボックスをオンに |測定を設定する。
- 創傷の長さを測定する
- フィジーのツールバーの [フリーハンドの選択] を選択します。
- 創傷の片側の傷のない組織の最後の毛包から、傷の反対側の傷害されていない組織の最初の毛包まで測定する(図4A,B)。
- これらの2つのランドマークに到達するために、ダーモ表皮接合部に沿ってトレースします。表皮が創傷全体を覆わない場合は、創傷の片側の皮膚表皮接合部に従い、移動する舌の端が顆粒組織の優れた側面または顆粒組織とかさぶたの間の接合に従い続け、最後に他方の側の傷害されていない組織の最初の毛包に達する(図4E,F)。
- [ 分析] の [ メジャー] をクリックします。計測の長さは、スケールで設定した単位と同じ単位で表示されます。
- 測定値を追跡するためのスプレッドシートを作成します (補足表 1)。
- 巻きの長さをスプレッドシートにコピーします。
- 表皮の長さを測定する
- 表皮が創傷全体を覆う場合、表皮の長さは創傷の長さと同じである。
- 「創傷長さ」の測定値をExcelスプレッドシートの「表皮長」列にコピーし、ステップ11.5にスキップします。
- 表皮が創傷全体を覆わない場合は、「フリーハンド選択」を選択し、造粒組織の優れた側面に従って、または肉芽組織と最初の毛包とかさぶたの間の接合部に従って、表皮のリーディングエッジ間の距離を測定する(図4C,D)。
- [ 分析] の [ メジャー] をクリックします。
- この測定値を傷の長さから引き、Excel スプレッドシートの「表皮の長さ」の下の数値を記録します。
- 表皮が創傷全体を覆う場合、表皮の長さは創傷の長さと同じである。
- 創傷領域を測定する
- フィジーのツールバーの [フリーハンドの選択] を選択します。
- 創傷の片側の傷のない組織の最後の毛包から、傷の反対側の傷害されていない組織の最初の毛包まで測定する(図4A、B、E、F)。
- 表皮の優れた側面に沿って痕跡(かさぶたを含まない)または創傷が表皮によって完全に覆われなければ顆粒組織の優れた態様。
- 反対側の毛包に達すると、脂肪組織または筋肉に達するまで、毛包に沿って顆粒組織に垂直にトレースを続けます。顆粒組織の下縁を傷の反対側に沿って、毛包に沿って開始点を結合して領域を閉じる(図4E,F)。
- [ 分析] の [ メジャー] をクリックします。
- 「傷領域を測定」の下のスプレッドシートに、巻き領域をコピーします。
- 表皮領域を測定する
- フィジーのツールバーの [フリーハンドの選択] を選択します。
- 創傷が完全に上皮化されている場合:
- 反対側の毛包が到達するまで表皮の上面に沿ってトレースし、表皮と真皮の間の真皮表皮接合部に続く出発点に「戻る」ことで領域を完成させる(図4D)。
- [ 分析] の [ メジャー] をクリックします。
- 表皮領域を Excel スプレッドシートの 「測定された表皮領域」にコピーし、ステップ 11.7 にスキップします。
- 創傷が完全に上皮化されていない場合:
- 表皮の上面に沿って、リーディングエッジまでトレースし、ダーモ表皮接合部に続く開始点に戻ります(図4C)。
- [ 分析] の [ メジャー] をクリックします。
- 手順 11.6.3.1 と 11.6.3.2 を、傷の反対側で繰り返します。
- [分析] の [測定] をクリックします。
- ステップ 11.6.3.2 および 11.6.3.4 で得られた 2 つの数値を合計し、スプレッドシートの「表皮領域測定」の下に結果を入力します。
- 40 番目のセクション(8番目のスライドごと) ごとに、手順 11.3 ~ 11.6 を繰り返します。
- 創傷全体の表皮領域を計算します。
- 表皮の長さの横に、スプレッドシートの「表皮領域計算」に新しい列を作成します。
- 最後のセクションを除く各セクション(7 μm厚いセクションx 40セクション)の「表皮長」の数に280を掛けます。
- 最後のセクション (セクションの厚さ) に対して「表皮の長さ」の数に 7 を掛けます。
- 各セクションの「計算された表皮領域」の値を合計し、創傷全体の表皮領域を求める。
- 創傷全体の傷領域を計算します。
- 創傷長さの測定を使用して、ステップ11.8.1から11.8.4を繰り返します。
- 創傷全体の表皮容積を計算します。
- 「表皮領域測定」の測定を使用して、ステップ11.8.1から11.8.4を繰り返します。
- 創傷全体の巻き容積を計算します。
- 「傷領域測定」を使用して、ステップ11.8.1~11.8.4を繰り返します。
- 創傷の表皮体積の割合を計算します。
- 表皮容積全体を総創傷体積で割り、100を掛けてパーセンテージを求めます(各セクションに対してこの比率を行わない)。
- 創傷領域の表皮面積の割合を計算します。
- 表皮の総面積を全創傷面積で割り、100 を掛けてパーセンテージを求めます。創傷が完全に上皮化されている場合、この数は100である必要があります。
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Representative Results
図5は、複数の外科医によって異なるマウス株で発生した野生型創傷に対して形態測定解析を行い、異なる個体によって分析した結果、得られた測定値と計算値の範囲を示している。異なる株由来の野生型マウスは、我々の研究と文献9,10の両方に記載されているように統計的な違いを示すことができる。これらの代表的な結果に基づいて、1つの研究内で、1つの株からのマウスのみを使用することをお勧めします。同じ個人が特定の研究内のすべての創傷を行うことをお勧めしますが、0日目の創傷の領域が個人の仕事間で統計的に異ならない限り、複数の個人が外科医として機能することができます。最後に、このプロトコルで説明されている形態測定解析は広範囲に及ぶ可能性があるため、複数の個体が同じ実験の一部を分析することができますが、2つのサンプルの分析結果が互いに5%以内にある場合に限ります。しかし、偏りを避けるために、単一の個体が目が見えない方法で創傷を分析することが好ましい。
図6は、本研究11に記載されたプロトコルに従って得られた創傷測定値と、創傷の「中間」および40の周囲の切片から得られた測定値を比較したメタ分析を示す。図6Aにおいて、表皮領域および創傷領域は、創傷部の表皮及び創傷長の測定から計算され、その後に創傷領域の表皮領域の割合(時には「閉鎖の割合」または「上皮化の割合」と呼ばれる)の計算が行われた。同様に、図6Bにおいて、創傷における表皮の割合は、創傷体積(測定された創傷領域から計算される)に対する表皮容積の比率(測定された創傷領域から計算)として得られた。両方のパラメータについて、創傷全体の分析は、グループ間の強い統計的差を示した(P<0.001まで一方通行のアノバに続く)。 しかし、中間の40個のセクションのみが分析された場合、有意性は減少した(一方向Anovaに続くP<0.01まで)。これらの結果は、創傷のサブセットのみが分析される場合の有意水準の低下を示す。これらのデータは、小さな効果サイズの欠陥は、創傷全体に対して形態測定解析を行う場合にのみ検出される可能性が高く、より軽度の創傷治癒表現型は「創傷の真ん中」タイプの分析から見逃されることを示唆している。
生体内創傷治癒を解析するための一般的な方法は、創傷12のどこかで選ばれた組織学的切片上の創傷の面積を測定することを含む。そのことを念頭に置いて、創傷全体の連続部分からの測定された創傷領域の平均を、中間サブセットセクションから得られたものと比較した。結果は、実験群と分析方法の間に有意な差を示さなかった(図6C)。しかし、現在のプロトコルは、創傷全体にわたって測定された領域( 図6Cに示す)を使用して、創傷体積を計算します。 図6Dに示すように、計算された創傷容積(創傷全体の分析を用いてしか計算できない)は、実験群間で有意に異なる。要するに、これらの代表的な結果は、従来の創傷治癒分析を用いて見逃された可能性のある表現型を検出するために、このプロトコルに記載されている創傷治癒パラメータの詳細な組織学的分析の重要性を示している。
図1:両側切除創の手順。(A)手術領域から髪を切り抜いて剃った後のマウスの代表的な写真。(B)背の中線に沿って肩甲骨の間につままれた皮膚。(C) マウスは、スキンフォールドを平らにして、その側面に配置します。(D) 生検パンチ配置の表現。(E) パンチスキンフォールド。(F) 0日目に2つの両側傷を有するマウスと白い矢印で示される切除パンチ生検制御組織。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:創傷収穫手順。(A-C)4日後の6mm切除傷(A)、7日(B)及び11日(C)の巨視写真。(D-E)メスの刃で、傷と傷のない組織を含む広い長方形の形で切開を行った。(F)皮膚は鉗子とはさみで下層の組織から放出された。(G) 収穫された両側創傷の表現(H) 白い点線は、パンチ生検の使用後に収穫される組織の境界を表します(この方法は、組織の収穫量を標準化することができます)。(I) 点線の白い線は、組織学のためにトリミングされる組織の境界線を表します(長方形の形状は、より簡単に埋め込むことができます)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ソリューション | 時間(分) | 温度(摂氏) | 圧力(kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | N/a |
| 95% ETOH | 30 | Rt | N/a |
| 100% ETOH | 30 | Rt | N/a |
| キシレン | 30 | Rt | N/a |
| キシレン | 30 | Rt | N/a |
| パラフィン | 30 | 60 | 20 |
| パラフィン | 30 | 60 | 20 |
表1:パラフィン埋め込み用のサンプル処理手順 RT = 室温。N/A = 適用できません。
図3:創傷埋め込みと断面化。(A)埋め込み型に平らに横たわっているパラフィン加工創傷。(B)創傷は、埋め込み用の金型の水平面から90°("立っている")で保持した。(C)ミクロトームに装着したパラフィンブロックを正しく向けたパラフィン埋め込み傷(D)約20セクションのリボンに切り分けた(E)パラフィンリボンは白い括弧で示されるように5セクションずつ切った。(F)暖水槽(40-45°C)に平らに敷設されたシリアルセクションは、顕微鏡スライドに取り付けた。(A-C)の漫画は、表皮(e)と各ステップの真皮(d)の適切な向きを持つ皮膚(青色)の創傷(オレンジ色)を表しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:創傷の組織学的特徴と形態測定パラメータの図示(A, B)1日目4(A)と1日7日(B)6mmの創傷の組織学的特徴。(C-F)定量的形態学的分析を行うために使用される異なる測定値の表現:表皮の長さ(C、D、黒線)、表皮の測定領域(C、D、黄色の陰点)、創傷の長さ(E、F、黄色の点線)および創傷全体の測定領域(E、F、灰色の陰出領域) HF = 毛包;スケールバー= 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:4日目、7日目、11日目の野生型創傷の形態学的特徴を創傷後に行う。散乱プロットは、複数の外科医によって異なるマウス株で生成された6mm野生型創傷の形態測定分析から得られたデータを表し、異なる個体によって分析される。(A)創傷容積、(B)表皮容積、(C)創傷における表皮の割合、(D)創傷領域(計算)、(E)表皮領域(計算)、および(F)創傷領域中の表皮領域の割合は、形態値の変動の範囲を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:創傷全体から得られたパラメータと創傷の中間を比較するメタ分析は、より高い意義を持つ新しい欠陥を特定する。創傷治癒性病態は、生理活性を注射した創傷(対照)、成長因子β3(Tgfb3)、中和抗体(Tgfb3+NAB)を用いたTgfb3および中和抗体(NAB)をトランスフォームした7日目に行った。測定は、連続切片創傷(「全体」)または創傷の中央から40のセクション(「真ん中」)で行われ、創傷領域(A)、創傷中の表皮の割合(B)および創傷容積(D)の表皮領域の割合を計算するために使用した。(C)は、創傷の全体または中央で測定された創傷領域の平均を表す。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, ns = 有意ではない、 一方行アノバ)。この図は、Le et al.11のデータを使用して変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:モルフォメトリック測定を記録するためのスプレッドシートの例。こちらの表をダウンロードしてください。
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Discussion
両側切除創傷モデルは、創傷治癒の多くの異なる側面を研究するために使用することができる高度にカスタマイズ可能な手順である。創傷治癒プロジェクトを開始する前に、研究者は、特定の効果サイズの欠陥を検出するために必要な創傷の数を決定するために、パワー分析を実行する必要があります。個々のマウスまたは創傷を生物学的複製として使用すべきかどうかについての文献内に矛盾が存在するが、最近の研究では、単一の動物4に対する2つの創傷の間に有意な相関関係がないことを示した。これは、単一の動物からの創傷が互いに独立しており、生物学的複製とみなすことができることを示唆しており、欠陥を検出するために必要なマウスの数を減らすことができる。これは、有意性4に達するために多数の創傷が必要な小さな効果サイズを考慮する場合に関連する。さらに、パワー計算の結果は、各動物に対して行われる創傷の数に影響を与え、動物1匹につき2、4の創傷が最も一般的である。
外科プロトコル自体も非常に柔軟です。短い手順の長さと迅速な回復(マウスあたり10〜15分)によるイゾフルラン気化器による麻酔をお勧めしますが、気化器にアクセスできない研究者はケタミン/キシラジンまたはペントバルビタールを含む注射麻酔を使用することができます。適切な鎮痛薬の選択は、創傷治癒の炎症段階に関連するので、特に重要である。非ステロイド性抗炎症薬 (NSAIDS) の使用は、彼らは炎症を減少させることができるとして、Flunixinメグルミンやメロキシカムなどの注意して使用する必要があります。.したがって、オピオイドは、炎症が調査されている研究で好ましい。鎮痛薬(例えば、ブプレノルフィン持続放出)は、鎮痛の48時間まで提供し、反復、追加の用量の必要性を排除することをお勧めします。すべての外科的処置は、連邦ガイドラインに従って実行され、承認された動物議定書によって支持されるべきである。
創傷治癒は、いくつかの相を包含するプロセスであり、それぞれが異なる細胞タイプ3を含む異なる生物学的プロセスによって特徴付けられる。炎症期は、0日目から5日目の間に起こり、多形核好中球(PMN)およびマクロファージの傷害部位への早期移行を伴う13。増殖期は3日から14日の間に起こり、再上皮化は創傷14の大きさに基づいて様々な時間を取る。このプロトコルでは、6mm生検パンチを使用し、ほとんどの創傷を7日再上皮化した。ただし、小さなパンチを使用する場合は、この時間枠を短縮する必要があります(1 mmの小さなサイズで利用可能です)。以前の時点と組み合わせて、これらの小さな創傷は、組織学的分析15の量を減少させるのが好ましいかもしれない。最後に、改造および成熟段階は、7日後および傷害16の後の1年後に起こる。これらの後の時点は、創傷の成熟を調査したり、実験動物の創傷治癒遅延を調査するために必要とされ得る。したがって、研究者は、創傷治癒の特定の段階を調査するために必要な重要な時間ポイントを、その特定の仮説5に基づいて決定する必要があります。
創傷治癒の分析は、多くの場合、組織学的分析に限定されません。未染色パラフィン切片は、コラーゲン沈着のための免疫蛍光やマッソンのトリクロームなどの追加の分析に使用することができます。対照組織(パンチ生検)の処理および組織の収穫ステップはすべて、組織学的分析に加えて、創傷治癒がどのように評価されるかに依存する。外科プロトコルの一部として、切除創傷を発生させるためにパンチ生検が除去される。これらのパンチは、タンパク質(西洋またはサイトカインプロファイリング)、DNAまたはRNA抽出などの下流用途のための傷つきのない制御組織として機能し、それに応じて処理する必要があります。組織学的分析のために少なくとも1つのパンチを保存することが推奨される、特に皮膚が傷つく前に治療される場合(例えば、Cre-Lox再結合17の誘導のためのタモキシフェンの適用)。パンチの検査は、治療が皮状形態に及ぼす影響を決定したり、使用されている特定のマウスモデルのベースライン皮状形態の評価を可能にしたりすることができる。組織学に使用されない創傷は、創傷の大きさを包含するパンチ生検で収穫することができる。この手順は、創傷のサイズに関係なく同じ量の組織を収穫することを含むいくつかの利点を有する(より大きな創傷は、より少ない周囲の健康な組織を有する)。最後に、組織を保存・埋め込むための材料として、固定剤として4%パラホルムアルデヒドを用い、パラフィンをそれぞれ記載する。他の固定剤は、特定のアプリケーションに必要とされ、置き換えることができます (例えば、Carnoy's または Bouin の固定剤).最適な切削温度化合物に続いて凍結断裂を続ける際の最良の免疫蛍光染色、凍結および埋め込みのための最良の方法は、選択の方法のままです。
傷ついた組織の切片は、かさぶたの存在のために、特に4日目の創傷に関する多くの課題を提示することができる。高品質のセクションを生成するには、マイクロトームのすべての部分がしっかりと締め付けられており、ブロックホルダーが初期位置に引き込まれ、ブレードホルダーが0〜10°の間に設定され、ブレードがしっかりと締め付けられていないことを確認することをお勧めします。パラフィンブロックは冷やされるが、組織は依然として細断され得る。シュレッダーが続く場合、マウントしたまま5分間、氷をブロックに置くことができます。切り離しが始まったら、パラフィンの部分の損失を防ぐためにミクロトームからブロックを取り除くことを避けることを強くお勧めします。失われたパラフィンセクション、その番号とシリアルセクションのランキングの両方を記録することが不可欠です。これは形態測定解析に影響を及ぼし、考慮する必要があります。切片を起たした後、特に組織学に精通していない場合、染色されていない切片での傷ついた組織の同定は困難である可能性がある。疑わしい場合は、保存を行い、組織を含むすべてのセクションを保持することをお勧めします。組織学的な汚れが行われると、組織組織はより明白になり、創傷はより明確になる。時折、毛包ははっきりと見えないか、創傷の端から遠いかもしれません。この場合、傷ついた組織の他の重要な特徴は、急激な増加を含む創傷の境界を確立するために使用することができ、その後、表皮の厚さの即時減少および結合組織の組織の急激な変化(図4A-B)。
デジタルイメージングは、形態測定解析において重要なステップです。モルフォメトリクス解析は、各画像のランドマークを使用して個々の画像に対して実行し、繰り返し測定を行わないようにする必要があります。ただし、デジタルソフトウェアを使用してすべてのフレームをつなぎ合わせ、単一の画像で解析を行うことができます。これは最初は簡単に思えますが、大きな画像を操作すると解析プロセスが遅くなる可能性があります。セクションの選択は、分析にも重要です。8番目 のスライドごとに最上位のセクションをデジタルで取得することをお勧めしますが、セクションの品質を優先し、そのスライドの 5 つのセクションのうち最高の部分をイメージする必要があります。小さな折り目のあるセクションは、折り目の面積/長さを推定することによって分析することができます。その特定のセクションの数は、デジタルファイルとExcelスプレッドシートの両方に記録され、前のセクションと次の分析セクションの間の距離を適切に調整することができます。
皮傷は、年間250億ドル以上の治療費用を持つ推定650万人に影響 を与え、糖尿病や肥満を含む他の多くの健康上の懸念に二次的であることに加えて、外科的処置の固有の構成要素である。マウスは、ヒト障害に比べて微妙な表現型を示すことが多いにもかかわらず、ゲノムを操作するのが容易であるため、ヒト疾患を研究するのに便利なモデルとして使用されてきました。このプロトコルに記載された両側切除創傷モデルおよびその後の形態学的解析は、本質的に複雑な創傷治癒過程19における軽度の欠陥の検出の難しさに対処する能力のために重要である。より大きな感受性および減少した変動性のために、このプロトコルは同じ実験的感受性を得るためにより少ない動物を使用する機会を提供する。プロトコルは高度にカスタマイズ可能であり、組織修復のすべての段階を研究するために使用することができる。組織の表向きの特徴付けと組み合わせた詳細な組織形態学的解析は、組織修復を調節する重要な因子の理解をさらに深めるために必要な知識を高める大きな可能性を秘めている。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
私たちは、長年にわたってこのプロトコルの最適化に貢献してきたダンヴァルト研究所のすべてのメンバーと、創傷分析のための連続断面の使用を促進する粘り強さが、その作成を可能にしたジーナ・シャッテマンに感謝しています。この研究は、NIH/NIAMSからマーティン・ダンヴァルト(AR067739)への資金提供によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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