Summary
Este protocolo descreve como gerar feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos e como monitorar, colher e preparar as feridas para análise morfométrica. Incluído é uma descrição aprofundada de como usar seções histológicas seriais para definir, quantificar e detectar defeitos morfométricos.
Abstract
O modelo de ferida excisional de murina tem sido usado extensivamente para estudar cada uma das fases sequencialmente sobrepostas da cicatrização da ferida: inflamação, proliferação e remodelação. As feridas de Murina têm um leito de ferida histologicamente bem definido e facilmente reconhecível sobre o qual essas diferentes fases do processo de cura são mensuráveis. Dentro do campo, é comum o uso de um "meio" arbitrariamente definido da ferida para análises histológicas. No entanto, as feridas são uma entidade tridimensional e muitas vezes não histologicamente simétrica, apoiando a necessidade de um método bem definido e robusto de quantificação para detectar defeitos morfométricos com um pequeno tamanho de efeito. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para a criação de feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos, bem como uma instrução detalhada sobre como medir parâmetros morfométricos usando um programa de processamento de imagem em seções seriais selecionadas. As medidas de duas dimensões do comprimento da ferida, comprimento epidérmico, área epidérmica e área da ferida são usadas em combinação com a distância conhecida entre as seções para extrapolar a área epidérmica de três dimensões que cobre a ferida, área geral da ferida, volume epidérmico e volume da ferida. Embora esta análise histológica detalhada seja mais demora e recursos do que as análises convencionais, seu rigor aumenta a probabilidade de detectar novos fenótipos em um processo de cicatrização de feridas inerentemente complexo.
Introduction
A cicatrização de feridas cutâneas é um processo biológico complexo com fases sequencialmente sobrepostas. Requer a coordenação de processos celulares e moleculares que são regulados temporal e espacialmente para restaurar a função de barreira do epitélio danificado. Na primeira fase, inflamações, neutrófilos e macrófagos migram para a ferida, mobilizando defesas locais e sistêmicas1. Seguir e sobrepor a fase inflamatória é o estágio de proliferação. Os fibroblastos começam a proliferar rapidamente e migrar para o tecido de granulação. Os queratinócitos para longe da borda principal proliferam direcionalmente em direção à ferida à medida que queratinócitos diferenciados na borda principal migram para re-epitelializar a ferida2. Finalmente, começa a fase de remodelação e maturação, durante a qual os fibroblastos no tecido de granulação começam a sintetizar e depositar colágeno. A remodelagem e organização da nova matriz pode durar até 1 ano após a lesão3. Devido à complexidade dos eventos sobrepostos envolvendo conversas cruzadas entre múltiplos tipos celulares, e apesar de anos de pesquisa, muitos dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à cicatrização das feridas permanecem mal compreendidos.
O modelo de camundongos é o modelo predominante de mamíferos para investigar mecanismos de cicatrização de feridas devido à sua facilidade de uso, custo relativamente baixo e manipulabilidade genética1,4,5. Embora diferentes tipos de feridas tenham sido descritas no modelo murino, o mais comum é uma ferida excisional (seja um soco bilateral ou biópsia direta do soco), seguida pelos modelos de ferida incisional4. O modelo de ferida excisional tem uma vantagem distinta sobre o modelo incisional, pois inerentemente gera tecido de controle que não passou pelo processo de cicatrização. O tecido de biópsia de soco excisado como parte do protocolo cirúrgico pode ser processado da mesma forma que o tecido ferido e usado para estabelecer as condições homeostáticas para um critério desejado. O tecido de controle excisado também pode ser útil se avaliar os efeitos de um pré-tratamento da pele ou confirmar alteração genética bem sucedida no momento da lesão4.
Os parâmetros de cura podem ser avaliados por muitas técnicas diferentes, incluindo planimetria ou histologia. No entanto, a planimetria só pode avaliar características visíveis da ferida, e devido à presença de uma cicatriz, muitas vezes não se correlaciona com medidas de cura que são visualizadas pela histologia, tornando a histologia o "padrão-ouro" da análise4. Apesar da análise histológica ser o padrão-ouro, é mais frequentemente realizada em um subconjunto arbitrário da ferida6,7. Por exemplo, cortar a ferida em "metade" antes de incorporar e seccionar a ferida é a prática comum para reduzir o tempo e os recursos gastos na seção de materiais e análise de dados. O método de análise morfométrica descrito neste protocolo foi desenvolvido para abranger todo o tecido da ferida, para refletir com precisão as características morfológicas da ferida, e para aumentar a probabilidade de detectar defeitos de cicatrização de feridas com um pequeno tamanho de efeito. Neste protocolo, detalhamos um método cirúrgico para a geração da ferida murina mais estudada, a ferida excisional de espessura total bilateral, bem como um método detalhado e rigoroso para análise histológica, como raramente é utilizado no campo.
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Protocol
Todos os experimentos foram concluídos de acordo e o cumprimento das regulamentações federais e as políticas e procedimentos da Universidade de Iowa foram aprovados pela Universidade de Iowa IACUC.
1. Animais e criação
- Use camundongos adultos da linha de camundongos desejada com 8-10 semanas de idade quando o estágio do folículo piloso estiver em telogen.
- No dia da cirurgia, separe os ratos em gaiolas limpas e abriga individualmente para minimizar a interrupção da ferida.
2. Cirurgia
NOTA: É desnecessário manter as condições cirúrgicas estéreis. Enquanto deve-se tomar cuidado para manter a esterilidade entre os animais, a biópsia do soco em si é feita em uma superfície limpa, mas não estéril. A duração da cirurgia por animal é entre 10 e 15 minutos.
- Anesthetization
- Anestesiar o animal por 1-2 min em uma câmara de indução com o vaporizador isoflurane definido para uma taxa de fluxo de 4-5% e o medidor de fluxo de oxigênio definido em 1 litro por minuto. Consulte Discussão para opções alternativas de anestesia.
- Confirme a anestesia adequada antes de iniciar o procedimento. A profundidade da anestesia pode ser confirmada por uma beliscão firme do dedo do dedo do sol.
- Transfira o mouse do recipiente de indução para um cone de nariz e reduza a taxa de fluxo isoflurane para 1,5% e o medidor de fluxo de oxigênio para 0,5 L/min.
- Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos, pois o procedimento excede 5 min.
- Mantenha a temperatura normal do corpo usando uma almofada térmica.
- Preparação do local da ferida
- Use um cortador de navalha elétrico em um movimento rostral caudal para remover a pele na parte de trás do mouse no nível do ombro. Remova o cabelo mais baixo nas costas, conforme necessário, se houver mais de duas feridas.
- Remova o cabelo restante usando uma lâmina de barbear em um movimento caudal rostral mantido a 20° da parte de trás do mouse para raspar de perto a área cortada(Figura 1A).
- Limpe a área raspada com um cotonete povidone-iodo.
- Limpe a pele com uma almofada de preparação de álcool isopropílico de 70% estéril para reduzir a irritação cutânea potencial do cotonete de iodo.
- Ferindo
- Aperte a pele entre as omoplatas ao longo da linha dorsal e puxe a dobra da pele sanduíche para longe do corpo(Figura 1B).
- Posicione o mouse de lado com a dobra cutânea em uma superfície plana coberta com uma toalha limpa à base de papel ou equivalente. Use uma folha de cera dentária sob a toalha para proteger a superfície subjacente de danos(Figura 1C).
- Coloque o soco de biópsia do tamanho desejado o mais próximo possível do corpo e deixe a pele relaxar. Não estique a pele, ou o tamanho da ferida será maior do que o tamanho do soco designado(Figura 1D).
- Soque a pele pressionando para baixo, um movimento de balanço pode ser usado para garantir que todas as camadas da pele em ambos os lados tenham sido penetradas(Figura 1E). Use um novo soco de biópsia para cada animal.
- Remova as biópsias de ponche das feridas(Figura 1F). Se ainda houver locais de fixação use tesouras estéreis e pinças para libertar o soco da pele circundante. Processe o tecido de controle da biópsia do soco conforme necessário com base em planos a jusante para análises de cicatrização de feridas (ver Discussão para sugestões).
- Tire fotografias macroscópicas de uma distância igual aos locais da ferida ou com uma régua no quadro, a fim de medir a área inicial da ferida e eliminar outliers da análise.
- Administre analgesia por um mínimo de 24h de acordo com um protocolo animal aprovado. Por exemplo: Buprenorfina SR-LAB, injetada como uma única dose subcutânea em 0,5-2 mg/kg para 48h de alívio da dor (ver Discussão para sugestões e considerações alternativas).
- Monitore o mouse quando ele sai da anestesia até que ele mantenha uma postura vertical e esteja andando normalmente ao redor da gaiola.
3. Monitoramento de feridas pós
- Monitore os ratos diariamente para pontos finais experimentais conforme determinado pelo investigador e de acordo com o cumprimento dos protocolos institucionais. Exemplos incluem: infecção, perda de peso visível ou uma postura curvada.
- Tire fotos macroscópicas diárias de forma controlada, como foi feito após a cirurgia inicial.
4. Feridas de colheita
- Eutanize camundongos no ponto de tempo desejado após a ferida de acordo com um protocolo animal aprovado.
- Tire fotografias macroscópicas dos locais da ferida de forma controlada consistente com a aquisição prévia de fotografias(Figura 2A,C).
- Corte um retângulo largo ao redor dos locais da ferida usando um bisturi(Figura 2D,E).
- Liberte o pedaço retangular do tecido usando tesouras e pinças para descascar e cortar a pele do tecido subjacente(Figura 2F). Coloque em uma placa de Petri(Figura 2G).
- Colhe as feridas. Apare até 2 mm de tecido não enrolado em torno de todos os lados da ferida em uma forma retangular(Figura 2H,I). Consulte Discussão para obter opções alternativas para colher a ferida.
- Processe as feridas conforme necessário para estudos subsequentes. Reserve pelo menos uma ferida por rato para incorporação de parafina e análise histológica.
5. Fixação e incorporação de feridas
- Conserte a ferida.
- Fixar o tecido da ferida em uma solução de paraformaldeído de 4% recém preparada8 por 3 h à temperatura ambiente e depois transfira para 4 °C durante a noite. Microscopia eletrônica (EM) grau paraformaldeído e filtragem de solução não é necessário.
- Lave as feridas duas vezes por 30 minutos em 1x PBS.
- Substitua o PBS por 70% de ETOH e armazene a 4 °C até incorporar. Processe tecidos dentro de 24-48 h para evitar a perda de antígeno ou dentro de 1-2 semanas se apenas avaliar características histológicas.
- Processar e incorporar a ferida
- Transfira cada ferida para um de incorporação. Rotular a incorporação de a lápis, pois o processo removerá tintas.
- Processe o tecido manualmente ou usando um processador automatizado desidratando o tecido com percentuais de etanol aumentados, limpando com xileno e, em seguida, infiltrando o tecido com cera de parafina(Tabela 1).
- Incorporar a ferida 90° ("pé") da superfície horizontal do molde de incorporação(Figura 3A,B).
6. Análise da área da ferida do dia 0
- Baixe o software livre NIH-Image J ou NIH-Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Abra um arquivo com uma foto das feridas do 0º dia.
- Verifique a caixa para "Área" em Analisar | Medidas de conjunto.
- Selecione "Escala definida" em Analisar. Digite a distância em pixels, a distância correspondente conhecida e a unidade da distância (= unidade de comprimento) se as medidas macroscópicas fizerem parte do estudo ou pularem esta etapa se forem necessárias apenas medidas relativas.
- Selecione"Seleções à mãolivre " na barra de ferramentas fiji.
- Delineie o perímetro da ferida.
- Clique em Analisar .
- Crie uma planilha para acompanhar as medidas por animal por ferida.
- Copie a medição da área da ferida na planilha.
- Calcule a área média e o desvio padrão de todas as feridas para um determinado experimento.
- Exclua quaisquer feridas fora de dois desvios padrão da média da análise histológica.
7. Secção serial
- Esfrie os blocos de feridas embutidos na parafina a 4 °C durante a noite.
- Insira o bloco de parafina no suporte do bloco do microtome e oriente para que a lâmina corte em linha reta através do bloco. Oriente o bloco de tal forma que o tecido "fique" a 90° permitindo a seção simultânea da epiderme e derme(Figura 3C,D).
- Faça 2-4 fitas de 20-30 seções de parafina de 7 μm cada.
- Use uma escova de tinta seca e uma agulha de dissecção para transferir cada fita para uma superfície firme, mas manipuladora, como uma folha de plástico preta firme.
- Retire a parte superior de cada fita com uma lâmina de barbear e coloque em um slide de microscópio.
- Observe as seções não manchadas sob um microscópio de campo brilhante para determinar quais contêm tecido ferido, que pode ser identificado pela ausência de folículo piloso, alterações no aparecimento do tecido conjuntivo ou epiderme, e/ou a presença de uma cicatriz(Figura 4A,B).
- Descarte seções não enroladas até 20 seções antes do início da ferida.
- Seção através da ferida repetindo as etapas 7.3 e 7.4 até que nenhuma ferida seja detectada em seções não manchadas.
8. Montagem de seções de parafina
- Seções de parafina separadas a cada 5 seções com uma lâmina de barbear, começando com a primeira fita(Figura 3E).
- Rotular slides de microscópio com o número de slides e todos os números da seção.
- Pegue o grupo de 5 seções com uma escova de tinta molhada e flutue-as na superfície da água de um banho de água quente (40-45 °C) para achatá-las.
- Escolha o grupo de 5 seções fora do banho de água usando um dos slides de microscópio rotulado(Figura 3F) e coloque em um conjunto mais quente de slides a 37 °C por até 24 horas.
- Armazene os slides eretos em uma caixa de slides.
9. Coloração histológica
- Transfira cada slidede microscópio 8 (equivalente a cada 40seção de parafina) para um rack de coloração e colorindo com hematoxilina e eosina.
10. Imagem microscópica
- Adquira imagens usando um microscópio de campo brilhante equipado com um objetivo de 4x e recursos de aquisição digital. Regisso da escala em que a imagem é tirada.
- Imagem toda a ferida da parte superior de cada slide manchado e certifique-se de incluir algum tecido não enrolado em ambos os lados. Tire várias fotos sobrepostas se a ferida for maior que a moldura de uma única imagem.
- Salve o arquivo, incluindo o número da seção para análise morfométrica. Use o número da seção seguido de a, b, c, etc. para imagens sobrepostas da mesma ferida.
11. Análise morfométrica
NOTA: Quando a ferida abrange várias imagens, soma as medidas tiradas das imagens individuais para obter um valor por métrica por seção de ferida para registrar na planilha.
- Na Imagem J, abra um arquivo digital de uma imagem manchada. Não use fotos costuradas para análise. Execute medições em imagens sobrepostas com zoom, encontrando pontos de referência para deixar de fora e captar medidas de imagem em imagem.
- Defina as preferências de escala e medição.
- Selecione "Escala definida" em Analisar. Digite a distância em pixels, a distância correspondente conhecida e a unidade da distância (= unidade de comprimento). A escala deve aparecer na janela e deve corresponder à escala em que a imagem foi adquirida.
- Verifique a caixa "Global" para manter a escala a mesma para cada imagem aberta.
- Repita as etapas 11.2.1 a 11.2.2 toda vez que a imagem J for fechada e reaberta.
- Verifique a caixa para "Área" em Analisar | Medidas de conjunto.
- Meça o comprimento da ferida
- Selecione"Seleções à mãolivre " na barra de ferramentas fiji.
- Medida a partir do último folículo piloso do tecido ileso de um lado da ferida até o primeiro folículo piloso do tecido ileso do outro lado da ferida(Figura 4A,B).
- Rastreie ao longo da junção dermo-epidérmica para alcançar esses dois marcos. Se a epiderme não cobrir toda a ferida, siga a junção dermo-epidérmica de um lado da ferida e onde a língua migratória termina continue seguindo o aspecto superior do tecido de granulação ou a junção entre o tecido de granulação e a cicatriz até chegar à língua migratória e, finalmente, o primeiro folículo piloso do tecido ileso do outro lado(Figura 4E,F).
- Em Analisar, clique em Medir. O comprimento da medição aparecerá nas mesmas unidades definidas na escala.
- Crie uma planilha para acompanhar as medidas (Tabela Suplementar 1).
- Copie o comprimento da ferida na planilha.
- Meça o comprimento epidérmico
- Se a epiderme cobrir toda a ferida, o comprimento epidérmico é o mesmo que o comprimento da ferida.
- Copie a medição do "comprimento da ferida" na coluna "comprimento epidérmico" na planilha Excel e pule para a etapa 11.5.
- Se a epiderme não cobrir toda a ferida, selecione as "seleções à mão livre" e meça a distância entre cada borda epidérmica seguindo o aspecto superior do tecido de granulação ou a junção entre o tecido de granulação e a cicatriz ao primeiro folículo piloso(Figura 4C,D).
- Em Analisar, clique em Medir.
- Subtraia esta medição do comprimento da ferida e registre o número em "comprimento epidérmico" na planilha Excel.
- Se a epiderme cobrir toda a ferida, o comprimento epidérmico é o mesmo que o comprimento da ferida.
- Meça a área da ferida
- Selecione"Seleções à mãolivre " na barra de ferramentas fiji.
- Medida a partir do último folículo piloso do tecido ileso de um lado da ferida até o primeiro folículo piloso do tecido ileso do outro lado da ferida(Figura 4A,B,E,F).
- Rastreie ao longo do aspecto superior da epiderme (não inclua a cicatriz) ou o aspecto superior do tecido de granulação se a ferida não estiver totalmente coberta pela epiderme.
- Continue a traçar verticalmente ao longo do folículo piloso no tecido de granulação uma vez que o folículo piloso oposto seja atingido e até que o tecido adiposo ou o músculo seja atingido. Siga a borda inferior do tecido de granulação até o lado oposto da ferida e junte-se ao ponto de partida ao longo do folículo piloso para fechar a área(Figura 4E,F).
- Em Analisar, clique em Medir.
- Copie a área da ferida na planilha em "área de ferida medida".
- Meça a área epidérmica
- Selecione"Seleções à mãolivre " na barra de ferramentas fiji.
- Se a ferida estiver totalmente epitelializada:
- Traçar ao longo do aspecto superior da epiderme até que o folículo piloso oposto seja alcançado e complete a área "retornando" ao ponto de partida após a junção dermo-epidérmica entre a epiderme e a derme(Figura 4D).
- Em Analisar, clique em Medir.
- Copie a área epidérmica na planilha Excel em "área epidérmica medida" e pule para a etapa 11.7.
- Se a ferida não estiver totalmente epitelializada:
- Rastreie ao longo do aspecto superior da epiderme até a borda superior e retorne ao ponto de partida após a junção dermo-epidérmica(Figura 4C).
- Em Analisar, clique em Medir.
- Repita o passo 11.6.3.1 e 11.6.3.2 no lado oposto da ferida.
- Em Analisar, clique em Medir.
- Somam os dois números obtidos nas etapas 11.6.3.2 e 11.6.3.4 e digitem o resultado em "área epidérmica medida" na planilha.
- Repita as etapas 11.3 a 11.6 em cada seção 40(cada 8º slide).
- Calcule a área epidérmica de toda a ferida.
- Crie uma nova coluna na planilha "área epidérmica calculada" ao lado do "comprimento epidérmico".
- Multiplique o número para "comprimento epidérmico" por 280 para cada seção, exceto o último (seção de 7 μm de espessura x 40 seções).
- Multiplique o número para "comprimento epidérmico" por 7 para a última seção (espessura da seção).
- Soma o valor da "área epidérmica calculada" para cada seção obter a área epidérmica de toda a ferida.
- Calcule a área da ferida inteira.
- Repita as etapas 11.8.1 a 11.8.4 usando as medidas de comprimento da ferida.
- Calcule o volume epidérmico de toda a ferida.
- Repetir as etapas 11.8.1 a 11.8.4 usando as medidas "área epidérmica medida".
- Calcule o volume da ferida inteira.
- Repetir as etapas 11.8.1 a 11.8.4 usando as medidas "área de ferida medida".
- Calcule a porcentagem de volume epidérmico na ferida.
- Divida o volume epidérmico total pelo volume total da ferida e multiplique por 100 para obter a porcentagem (não faça essa razão para cada seção).
- Calcule a porcentagem de área epidérmica entre a área da ferida.
- Divida a área epidérmica total pela área total da ferida e multiplique por 100 para obter o percentual. Se uma ferida for totalmente epitelializada, este número deve ser de 100.
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Representative Results
A Figura 5 retrata a faixa em valores medidos e calculados obtidos pela realização de análise morfométrica em feridas do tipo selvagem geradas em diferentes cepas de camundongos por vários cirurgiões e analisadas por diferentes indivíduos. Camundongos do tipo selvagem de diferentes cepas podem apresentar diferenças estatísticas como descrito tanto em nossos estudos quanto na literatura9,10. Com base nesses resultados representativos, recomendamos que, dentro de um estudo, sejam utilizados camundongos de apenas uma cepa. Embora recomendemos que o mesmo indivíduo realize todas as feridas dentro de um determinado estudo, vários indivíduos poderiam atuar como cirurgiões, desde que a área das feridas no dia 0 não seja estatisticamente diferente entre o trabalho do indivíduo. Finalmente, como a análise morfométrica descrita neste protocolo pode ser extensa, vários indivíduos poderiam analisar partes do mesmo experimento, mas apenas se os resultados de sua análise de duas amostras estiverem dentro de 5% um do outro. No entanto, é preferível ter um único indivíduo analisando as feridas de forma cega para evitar viés.
A Figura 6 apresenta uma meta-análise comparando as medidas da ferida obtidas seguindo o protocolo descrito neste estudo11 com medidas obtidas do "meio" da ferida e 40 seções circundantes. Na Figura 6A, a área epidérmica e a área da ferida foram calculadas a partir da medição dos comprimentos epidérmicos e da ferida em seções de ferida seguidas do cálculo do percentual da área epidérmica entre a área da ferida (às vezes referida como "percentual de fechamento" ou "percentual de epitelialização"). Da mesma forma, na Figura 6B,o percentual da epiderme na ferida foi obtido como a razão do volume epidérmico (calculado a partir da área epidérmica medida) sobre o volume da ferida (calculado a partir da área da ferida medida). Para ambos os parâmetros, a análise de toda a ferida mostrou fortes diferenças estatísticas entre os grupos (até P < 0,001 seguindo Anova unidirecional). No entanto, a significância foi diminuída (até P < 0,01 seguindo a Anova unidirecional) quando apenas 40 seções no meio do seria analisado. Esses resultados demonstram uma diminuição no nível de significância quando apenas um subconjunto da ferida é analisado. Esses dados sugerem que defeitos com um tamanho de efeito pequeno provavelmente só serão detectados ao realizar análises morfométricas em toda a ferida, e que fenótipos de cicatrização de feridas mais leves serão perdidos de um tipo de análise "meio da ferida".
A prática comum de análise da cicatrização da ferida in vivo envolve medir a área da ferida em seções histológicas escolhidas em algum lugar da ferida12. Com isso em mente, a média da área de ferida medida das seções seriais de feridas inteiras foi comparada com a obtida a partir das seções do subconjunto médio. Os resultados não apresentaram diferença significativa entre os grupos experimentais e entre o método de análise(Figura 6C). No entanto, o protocolo atual utiliza a área medida (mostrada na Figura 6C) sobre toda a ferida para calcular o volume da ferida. Como mostrado na Figura 6D, o volume calculado da ferida (que só pode ser calculado utilizando a análise de toda a ferida) é significativamente diferente entre os grupos experimentais. Em suma, esses resultados representativos demonstram a importância da análise histológica aprofundada dos parâmetros de cicatrização de feridas descritos neste protocolo, a fim de detectar fenótipos que de outra forma teriam sido perdidos usando uma análise mais tradicional de cicatrização de feridas.
Figura 1: Procedimento bilateral de ferida excisional. (A) Foto representativa de um rato após o corte e corte de cabelo da área cirúrgica. (B) A pele beliscada entre as omoplatas ao longo da linha dorsal. (C) O rato posicionado de lado com a dobra cutânea colocada plana. (D) Representação da colocação do soco da biópsia. (E) Dobra cutânea perfurada. (F) O camundongo com duas feridas bilaterais no dia 0 e os tecidos de controle da biópsia do soco excisado, conforme indicado pelas setas brancas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Procedimento de colheita da ferida. (A-C) Fotografias macroscópicas de feridas excisionais de 6 mm após 4 dias(A),7 dias(B) e 11 dias(C). (D-E) Com uma lâmina de bisturi, uma incisão cutânea foi feita na forma de um retângulo largo que inclui as feridas e o tecido não adulterado ao redor. (F) A pele foi liberada do tecido subjacente com fórceps e tesouras. (G) Representação de feridas bilaterais colhidas. (H) A linha branca pontilhada representa a borda do tecido que seria colhida após o uso de uma biópsia de ponche (este método permite a quantidade padronizada de tecido colhido). (I) A linha branca pontilhada representa a borda do tecido que seria aparada para histologia (a forma retangular permite uma incorporação mais fácil). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Tempo (minutos) | Temperatura (Celsius) | Pressão (kPa) |
| 80% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| 95% ETOH | 30 | Rt | N/A |
| ETOH 100% | 30 | Rt | N/A |
| Xileno | 30 | Rt | N/A |
| Xileno | 30 | Rt | N/A |
| Parafina | 30 | 60 | 20 |
| Parafina | 30 | 60 | 20 |
Tabela 1: Procedimento de processamento de amostras para incorporação de parafina. RT = temperatura ambiente. N/A = não aplicável.
Figura 3: Incorporação e secção de feridas. (A) Ferida processada por parafina deitada plana em um molde de incorporação. (B) A ferida foi mantida a 90° ("pé") da superfície horizontal do molde para incorporação. (C) Ferida embutida de parafina devidamente orientada para secção (D) Bloco de parafina montado no microtome foi seccionado em fitas de cerca de 20 seções(E) Fitas de parafina cortadas em incrementos de 5 seções, conforme indicado pelos suportes brancos. (F) Seções seriais colocadas planas em um banho de água quente (40-45 °C) foram montadas em um slide de microscópio. O desenho animado em (A-C) representa a ferida (laranja) na pele (azul) com a orientação adequada da epiderme (e) e da derme (d) para cada passo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Características histológicas das feridas e ilustração de parâmetros morfométricos. (A, B) Características histológicas de um dia 4(A) e um dia 7(B) 6 mm de ferida. (C-F) Representação das diferentes medidas utilizadas para a realização da análise quantitativa morfométrica: comprimento da epiderme (C, D, linha preta pontilhada), área medida da epiderme (C, D,área sombreada amarela), comprimento da ferida(E, F, linha amarela pontilhada) e área medida de toda a ferida(E, F, área sombreada cinza). HF = folículo piloso; barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Características morfométricas de feridas representativas do tipo selvagem de 6 mm no dia 4, dia 7 e dia 11 pós-ferimentos. Parcelas dispersas representam dados obtidos a partir de análises morfométricas de feridas de 6 mm selvagens geradas em diferentes cepas de camundongos por vários cirurgiões e analisadas por diferentes indivíduos. (A) volume da ferida, (B) volume epidérmico, (C) percentual de epiderme na ferida, (D) área da ferida (calculada), (E) área epidérmica (calculada) e (F) percentual de área epidérmica entre a área da ferida demonstram a variação dos valores morfômicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Meta-análise comparando parâmetros obtidos de ferida inteira com meio da ferida identifica novos defeitos com maior significância. A morfometria de cicatrização da ferida foi realizada no dia 7 feridas injetadas com soro fisiológico (controle), transformando o fator de crescimento beta 3 (Tgfb3), Tgfb3 com anticorpo neutralizante (Tgfb3 + NAB) e anticorpo neutralizante sozinho (NAB). As medições foram realizadas em feridas seccionadas em série ("inteira") ou em 40 seções do meio da ferida ("meio") e utilizadas para calcular a porcentagem de área epidérmica sobre a área da ferida(A),a porcentagem de epiderme na ferida(B)e o volume da ferida(D). (C) representa a média da área da ferida medida no todo ou no meio da ferida. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, ns = não significativo, Anova Unidirecional). Este número foi modificado utilizando dados de Le et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela suplementar 1: Um exemplo de uma planilha para registro de medições morfométricas. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
O modelo bilateral de ferida excisional é um procedimento altamente personalizável que pode ser usado para estudar muitos aspectos diferentes da cicatrização de feridas. Antes de iniciar um projeto de cicatrização de feridas, os investigadores devem realizar uma análise de energia para determinar o número de feridas necessárias para detectar um defeito de um determinado tamanho de efeito. Existem inconsistências na literatura sobre se camundongos individuais ou feridas devem ser usados como réplicas biológicas, no entanto, um estudo recente mostrou que não há correlação significativa entre duas feridas em um único animal4. Isso sugere que as feridas de um único animal são independentes umas das outras e podem ser consideradas como réplicas biológicas, reduzindo o número de camundongos necessários para detectar um defeito. Isso é relevante quando se considera tamanhos de pequenos efeitos para os quais é necessário um alto número de feridas para atingir a significância4. Além disso, os resultados do cálculo de energia podem influenciar quantas feridas são realizadas em cada animal, sendo mais comuns 2 e 4 feridas por animal.
O protocolo cirúrgico em si também é altamente flexível. Embora recomendemos a anestesia por vaporizador de isoflurano devido ao curto comprimento do procedimento e recuperação rápida (10-15 min por mouse), os investigadores sem acesso a um vaporizador podem usar anestesia injetável, incluindo cetamina/xilazina ou pentobarbital. A seleção de um analgésico apropriado é particularmente crítica, pois diz respeito às fases inflamatórias da cicatrização de feridas. O uso de anti-inflamatórios não esteroides (NSAIDS) como flunixina meglumina ou Meloxicam deve ser usado com cautela, pois podem diminuir a inflamação. Os opioides são, portanto, preferidos em estudos onde a inflamação está sendo investigada. Recomendamos analgésicos (por exemplo, Buprenorphine Sustained-Release) que fornecem até 48h de analgesia e eliminam a necessidade de doses repetidas e adicionais. Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser executados de acordo com as diretrizes federais e apoiados por um protocolo animal aprovado.
A cicatrização de feridas é um processo que engloba várias fases, sendo cada uma caracterizada por diferentes processos biológicos envolvendo diferentes tiposcelulares 3. A fase inflamatória ocorre entre os dias 0 e 5, com a migração precoce de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) e macrófagos para o local da lesão13. A fase proliferativa ocorre entre 3 e 14 dias com a reepilielialização levando uma quantidade variada de tempo com base no tamanho da ferida14. Neste protocolo, usamos um soco de biópsia de 6 mm e a maioria das feridas foram re-epitelializadas por 7 dias. No entanto, esse período de tempo precisaria ser encurtado se socos menores fossem usados (eles estão disponíveis tão pequenos quanto 1 mm). Em combinação com os pontos de tempo anteriores, essas feridas menores podem ser preferíveis para reduzir a quantidade de análises histológicas15. Por fim, as fases de remodelação e maturação ocorrem após 7 dias e até um ano após a lesão16. Esses pontos de tempo posteriores podem ser necessários para investigar o amadurecimento da ferida ou para investigar atrasos de cicatrização de feridas em animais experimentais. Portanto, o investigador precisará determinar os pontos de tempo críticos necessários para investigar fases específicas da cicatrização da ferida com base em sua hipótese particular5.
A análise da cicatrização de feridas muitas vezes não se restringe a análises histológicas. Seções de parafina não detidas podem ser usadas para análises adicionais, como imunofluorescência ou tricromsomo de Masson para deposição de colágeno. O processamento do tecido de controle (biópsias de ponche) e as etapas de colheita do tecido dependerão de como, além das análises histológicas, a cicatrização da ferida é avaliada. Como parte do protocolo cirúrgico, biópsias de perfuração são removidas para gerar a ferida excisional. Esses socos podem servir como tecido de controle não enfeitiçado para aplicações a jusante, como proteína (para perfil de western ou citocina), extração de DNA ou RNA e devem ser processados de acordo. Recomenda-se que pelo menos um soco seja salvo para análise histológica, especialmente nos casos em que a pele é tratada antes do ferimento (por exemplo, aplicação de tamoxifen para indução de recombinação Cre-Lox17). O exame do soco pode determinar o efeito do tratamento na morfologia cutânea ou simplesmente permitir a avaliação da morfologia cutânea da linha de base do modelo de camundongo em particular que está sendo utilizado. Feridas não usadas para histologia podem ser colhidas com uma biópsia de ponche que abrange o tamanho da ferida. Este procedimento tem algumas vantagens, incluindo a colheita da mesma quantidade de tecido, independentemente do tamanho da ferida (feridas maiores têm menos tecido saudável circundante). Por fim, descrevemos o uso de 4% de paraformaldeído como fixação e parafina como material para preservação e incorporação de tecidos, respectivamente. Outros fixativos podem ser necessários para determinadas aplicações e podem ser substituídos (por exemplo, carnoy ou fixativos de Bouin). Para melhor coloração imunofluorescente, congelamento e incorporação da ferida no composto de temperatura de corte ideal seguido de secção congelada continua sendo o método de escolha.
A secção de tecido ferido pode apresentar muitos desafios, particularmente feridas do dia 4 por causa da presença da cicatriz. Para gerar seções de alta qualidade, recomenda-se verificar se todas as partes do microtome estão bem apertadas, o suporte do bloco é retraído à sua posição inicial, o suporte da lâmina é definido entre 0 e 10° e a lâmina está bem apertada, mas não apertada. Embora o bloco de parafina esteja refrigerado, o tecido ainda pode rasgar. Se a trituração continuar, um pedaço de gelo pode ser colocado no bloco por 5 minutos enquanto ainda estiver montado. Uma vez iniciada a secção, é altamente recomendável evitar a remoção do bloco do microtome para evitar a perda de seções de parafina. É imperativo registrar quaisquer seções de parafina perdidas, tanto seus números quanto sua classificação na seção serial. Isso afetará a análise morfométrica e precisa ser considerado. Após o início da secção, a identificação de tecido ferido em seções não manchadas pode ser difícil, especialmente se não estiver familiarizado com a histologia. Na dúvida, recomenda-se ser conservador e manter todas as seções que contêm tecido. Uma vez realizada a mancha histológica, a organização do tecido será mais evidente e a ferida mais distinta. Ocasionalmente, os folículos capilares podem não ser claramente visíveis ou podem estar longe da borda da ferida. Se esse for o caso, outras características-chave do tecido ferido podem ser usadas para estabelecer os limites da ferida, incluindo um aumento abrupto seguido de diminuição imediata da espessura epidérmica e alterações bruscas na organização do tecido conjuntivo(Figura 4A-B).
A imagem digital é um passo crítico na análise morfométrica. A análise morfométrica deve ser realizada em imagens individuais usando um marco em cada imagem para evitar medições repetidas. No entanto, é possível costurar todos os quadros usando software digital e realizar a análise em uma única imagem. Embora isso pareça mais fácil no início, a manipulação de uma imagem grande pode retardar o processo de análise. A escolha da seção também é fundamental para análise. Embora recomendemos adquirir digitalmente a seção superior de cada8º slide, a qualidade da seção deve ser priorizada e o melhor das 5 seções nesse slide deve ser visualizado. Seções com pequenas dobras ainda podem ser analisadas estimando a área/comprimento da dobra. O número dessa seção específica deve ser registrado tanto no arquivo digital quanto na planilha do Excel, de forma que a distância entre a seção anterior e a próxima analisada possa ser ajustada de acordo.
As feridas cutâneas afetam cerca de 6,5 milhões de pessoas com tratamento que custa mais de US$ 25 bilhões por ano18 e são um componente inerente aos procedimentos cirúrgicos, além de serem secundárias a muitas outras preocupações com a saúde, incluindo diabetes e obesidade. O camundongo tem sido usado como um modelo conveniente para estudar doenças humanas devido à facilidade em manipular seu genoma, apesar de muitas vezes exibir um fenótipo sutil em comparação com a desordem humana. O modelo bilateral de ferida excisional e a análise morfométrica subsequente descrita neste protocolo são significativos devido à sua capacidade de lidar com a dificuldade em detectar pequenos defeitos em um processo de cicatrização de feridas inerentemente complexo19. Devido à sua maior sensibilidade e à redução da variabilidade, este protocolo oferece oportunidades de usar menos animais para obter a mesma sensibilidade experimental. O protocolo é altamente personalizável e pode ser usado para estudar todas as etapas de reparação tecidual. A análise morfométrica histológica detalhada em combinação com a caracterização fenotípica do tecido tem grande potencial para aumentar o conhecimento necessário para aprofundar a compreensão dos fatores críticos que modulam a reparação tecidual.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Somos gratos a todos os membros do Laboratório Dunnwald que contribuíram para a otimização deste protocolo ao longo dos anos, e a Gina Schatteman cuja persistência em promover o uso de seção serial para análise de feridas tornou sua criação possível. Este trabalho foi apoiado por financiamento do NIH/NIAMS para Martine Dunnwald (AR067739).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | |||
| 70% ethanol | |||
| 80% ethanol | |||
| 95% ethanol | |||
| Alcohol Prep | NOVAPLUS | V9100 | 70% Isopropyl alcohol, sterile |
| Ammonium hydroxide | |||
| Biopsy pads | Cellpath | 22-222-012 | |
| Black plastic sheet | Something firm yet manipulatable about the size of a sheet of paper | ||
| Brightfield microscope | With digital acquisition capabilities and a 4X objective | ||
| Cotton tipped applicators | |||
| Coverslips | 22 x 60 #1 | ||
| Dental wax sheets | |||
| Digital camera | Include a ruler for scale, if applicable | ||
| Dissection teasing needle (straight) | |||
| Embedding molds | 22 x 22 x 12 | ||
| Embedding rings | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y | |||
| Glacial acetic acid | |||
| Hair clipper | |||
| Heating pad | Conair | Moist dry Heating Pad | |
| Hematoxylin | |||
| Microtome | |||
| Microtome blades | |||
| Paint brushes | |||
| Paraffin Type 6 | |||
| Paraformaldehyde | |||
| Permount | |||
| Phosphate buffer solution (PBS) | |||
| Povidone-iodine | Aplicare | 82-255 | |
| Processing cassette | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Razor blades | ASR | .009 Regular Duty | |
| Scalpel blades #10 | |||
| Scalpel handle | |||
| Sharp surgical scissors | sterile for surgery | ||
| Skin biopsy punches | Size as determined by researcher | ||
| Slide boxes | |||
| Slide warmers | |||
| Superfrosted microscope slides | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Temperature control water bath | |||
| Tissue embedding station | Minimum of a paraffin dispenser and a cold plate | ||
| Tissue processor | Minimum of a oven with a vacuum pump | ||
| Triple antibiotic opthalmic ointment | |||
| tweezers, curved tip | sterile for surgery | ||
| tweezers, tapered tip | sterile for surgery | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
References
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